需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

荧光引导的基质辅助激光解吸/电离结合激光诱导后电离质谱分析单个大鼠神经细胞

1.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/68376

⸱

2025年5月23日

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Chemistry, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois Urbana-Champaign, 4Neuroscience Program, University of Illinois Urbana-Champaign

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案概述了微MS（microMS）在荧光引导下单细胞MALDI-2质谱分析中的应用，可实现对原代大鼠神经元细胞的增强型分子谱分析。

摘要

单细胞测量对于理解大脑丰富的空间化学异质性至关重要。基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱（MS）能够无需标记、高通量地表征单个细胞内的内源性分子。近年来，配备激光诱导后电离（MALDI-2）技术的MALDI质谱仪在多种脂质及其他小分子的检测灵敏度方面实现了显著提升。然而，对于大多数应用而言，利用MALDI-2在细胞分辨率下对大样本进行质谱成像的速度过于缓慢，难以实现。在本实验方案中，将原代细胞分离并分散至导电载玻片上，通过全片荧光显微镜确定各细胞的相对位置，随后精确地将显微镜坐标与MALDI-2质谱仪的载物台坐标进行共定位配准。仅针对细胞位置进行靶向质谱分析，相比对整个样本进行质谱成像，可实现高通量的单细胞测量，具有更高的分析物覆盖率并显著减少数据量。本文详细描述了单细胞制备、全片荧光成像、基质涂布以及MALDI-2质谱分析所必需的关键步骤。

引言

脂质和代谢物是细胞功能的基础，作为细胞膜、能量来源以及信号分子的必需组分1,2。然而，它们的组成和丰度在单个细胞之间可能存在显著差异，反映出细胞类型以及发育和功能状态的不同3,4,5。分析这些差异对于理解生物变异性以及识别不同的细胞亚群至关重要。单细胞测量技术（如RNA测序）可提供有用的细胞特异性转录谱6。然而，转录水平的测量并不能直接反映脂质和代谢物在细胞内的实际含量，因为基因表达水平并不总是与这些分析物的实际丰度相关。因此，需要专门的方法对脂质和代谢物进行直接测量，以全面分析单个细胞及其群体的化学组成。

基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱成像（MSI）是一种用于原位无标记空间定位内源性生物分子的首选工具in situ7,8。通常，在MALDI中，使用紫外激光从与有机基质共结晶的薄样品层中消融材料，形成离子和中性分子的羽流。生成的离子随后由质谱分析器分离，并在质谱仪中被检测。由于现代质谱仪载物台具有精确定位能力，激光可被定位以靶向特定样品区域，或逐点扫描区域，从而通过MSI生成分子图像。利用聚焦激光束和精确的载物台移动，实现细胞或亚细胞空间分辨率（< 10 µm）的MSI可用于获取单个细胞的化学信息9,10。然而，在该尺度下的MSI测量效率较低，特别是在目标细胞密度较低的样品中，因为大量时间被用于对细胞间空白区域成像。此外，由于采样体积小，许多分析物的可检测性受到限制。为克服这些挑战，我们开发了一种基于图像引导的MALDI质谱方法，用于高通量单细胞分析11,12。在该方法中，分散细胞的位置通过全片荧光图像程序化确定，并用于引导质谱仪载物台移动至具有特定参数（如大小和形状）的单个细胞所在位置，随后通过MALDI激光照射进行分析。此前利用该靶向方法的研究已用于表征异质细胞群体中的脂质、肽段及其他生物分子5,13。

由于单细胞的样品量极为有限，此类样本中可检测到的分析物数量通常少于直接从组织中检测到的数量。因此，为了提高单细胞质谱分析中分析物的覆盖范围，提升分析物的检测灵敏度至关重要。近年来发展出的一种有助于克服这一检测挑战的方法是基质辅助激光解吸电离结合激光后电离技术（MALDI-2），该技术已被证明可显著增强多种分析物的检测灵敏度9,14,15,16。因此，MALDI-2 能够生成更全面的单细胞数据集，并在样品量受限的样本（如分离的单细胞）中实现更深入的分子覆盖。

本方法的目标是从数千个单个细胞中获取脂质测量数据。为此，我们描述了一种工作流程，可实现高通量的单细胞基质辅助激光解吸电离二级质谱（MALDI-2）分析，并且该流程通常可扩展至任何具有精确载物台控制的基于探针的质谱分析方法17。在此工作流程中，首先分离出感兴趣脑区的组织，然后通过木瓜蛋白酶消化法从组织中获得单个细胞。细胞经核染料标记后，被分散至刻有基准标记的导电玻璃载玻片上，使其贴附。接着，使用荧光显微镜对整个载玻片进行成像。通过升华法沉积基质，在载玻片表面形成可重复的均匀晶体层，从而为单细胞质谱分析提供高信噪比。利用开源软件microMS11，将显微图像中细胞位置的相对坐标与质谱仪载物台坐标进行映射和对齐，该过程通过载玻片上刻有的基准标记实现点集配准。最后，基于这些信息，对每个单个细胞进行精确定位的质谱采集，从而可在一次运行中完成对数千个细胞的分析（<1 h）12,13。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究中的所有动物实验均严格按照伊利诺伊州机构动物护理和使用委员会（23228）批准的动物使用方案进行，并严格遵守国家及ARRIVE关于动物伦理待遇与护理的标准。

1. 材料与溶液的准备

  1. 配制含1.5 mM CaCl2、4.9 mM KCl、0.2 mM KH2PO4、11 mM MgCl2、0.3 mM MgSO4、138 mM NaCl、27.7 mM NaHCO3、0.8 mM Na2HPO4和25 mM HEPES的改良Gey平衡盐溶液（mGBSS）。使用3 M NaOH将pH值调节至7.2。建议配制1 L mGBSS，并于4 °C保存备用。
  2. 将已配制的mGBSS溶液注入50 mL注射器中，并置于冰上用于心脏灌流。每只解剖的大鼠准备1支注射器。
  3. 按照Worthington木瓜蛋白酶解离系统说明书配制木瓜蛋白酶溶液分装液。该系统包含以下四个小瓶，其中第4号小瓶不用于本方案：
    第1号小瓶：含碳酸氢盐和酚红的无菌Earle平衡盐溶液（EBSS）
    第2号小瓶：含L-半胱氨酸和EDTA的木瓜蛋白酶
    第3号小瓶：脱氧核糖核酸酶I（DNase）
    ​第4号小瓶：含牛血清白蛋白的卵黏蛋白蛋白酶抑制剂
    1. 将5 mL EBSS（第1号小瓶）加入木瓜蛋白酶小瓶（第2号小瓶）中，置于37 °C水浴中10分钟以溶解木瓜蛋白酶。
    2. 向DNase小瓶（第3号小瓶）中加入500 µL EBSS（第1号小瓶），轻轻混匀。再将250 µL稀释后的DNase溶液（第3号小瓶）加入木瓜蛋白酶小瓶（第2号小瓶）中。该配制液最终浓度为20单位/mL木瓜蛋白酶、0.005% DNase、0.5 mM EDTA和1 mM L-半胱氨酸。
    3. 将配制好的木瓜蛋白酶溶液分装为每份250 µL，冷冻保存以用于后续解离（约可分装20份）。向该溶液中添加以下抗生素：100单位/mL青霉素G、100 µg/mL链霉素和100 µg/mL庆大霉素。可根据用户的具体应用进行调整。
  4. 配制150 mM醋酸铵溶液，并于4 °C保存。通过将甘油稀释于已配制的mGBSS溶液中，制备33%甘油溶液。
  5. 使用碳化钨或钻石尖雕刻笔或CO2激光雕刻机，在涂有氧化铟锡（ITO）的显微镜载玻片上蚀刻定位标记。在ITO玻璃载玻片的导电面，沿载玻片边缘蚀刻20–40个X形定位标记，以实现跨平台（如显微镜与质谱仪）的空间配准。
    注意：避免在样品或其区域周围蚀刻成一条连续的线条，以免破坏该区域与玻璃载玻片适配器之间的表面导电性。

2. 原代神经细胞的制备

注意：大鼠海马组织经解剖后，使用木瓜蛋白酶将其解离为单个细胞，并以低密度接种至导电玻璃载片上。通过此种方式分离细胞，可实现对内源性脂质进行高通量单细胞质谱分析。

  1. 动物解剖前，将一份预先配制的木瓜蛋白酶溶液解冻，并放入带有进气管和出气管的容器中，使 CO2 可以置换容器内的空气。将该系统置于设定为 37 °C 的水浴中，并持续通入 CO2，直至溶液达到适当 pH 值（通过 Worthington 木瓜蛋白酶解离系统试剂盒中附带的 pH 比色卡判断颜色变化）。目标 pH 值应在 7.2 至 7.4 之间。
    注意：切勿将 CO2 直接通入酶溶液中，否则会导致 DNase 变性并丧失生物活性。建议使用一个 50 mL 离心管，在管盖上固定两根导管，使 CO2 从底部进入，并从顶部的出气管逸出。
  2. 根据机构、地方及联邦指南，依照 IACUC 协议对大鼠实施安乐死。本实验中使用 2 至 3 月龄雄性 Sprague-Dawley 大鼠，采用 CO2 窒息法处死。
  3. 用冰浴（4 °C）的 mGBSS 溶液对大鼠进行心脏灌注，以清除血管系统中的血液并迅速冷却动物身体。该操作的一个示例可参见 We 等人发表的方案18。
  4. 通过外科手术将大鼠脑组织分离，注意避免损伤目标脑区。此前发表的该分离操作概述提供了部分具体步骤的更多细节19。
  5. 使用组织切片机或组织切割器将脑组织切成约 2 mm 厚的横截面，以暴露待取样的脑区（如海马、皮层或纹状体）。
  6. 使用 2 mm 活检打孔器取下目标脑区组织，并将组织块放入木瓜蛋白酶溶液小瓶中。
  7. 将组织与木瓜蛋白酶溶液在 37 °C 下孵育 30–90 分钟，并持续振荡（例如使用电动摇床）。
    注意： 酶解时间应根据脑区、动物品系、年龄以及所需细胞产出（例如保留突起的神经元和星形胶质细胞 vs. 不保留突起但获得最大细胞产量）进行优化。对于大鼠海马组织，通常为 60–90 分钟。较短的酶解时间可能保留部分突起，但会留下较多未解离的细胞团块；而较长的酶解时间可提高产量，但会增加细胞损伤，需通过活/死细胞检测（如 LIVE/DEAD 活性/细胞毒性检测试剂盒）进行评估。在比较研究中，不同样本类型的处理条件必须保持一致。
  8. 将含有组织和木瓜蛋白酶的管子置于冰上冷却，以抑制酶活性。使用剪切过的移液枪头连接 P100 可调移液器对组织进行吹打，直至肉眼观察下大部分组织已分散。解离过程中避免产生气泡，以防造成过度细胞损伤。
    注意：剧烈吹打可获得较高的细胞产量，但细胞的突起结构大多无法保留；轻柔吹打则可保留更多细胞突起，但会有更多未解离的细胞团块。也可尝试使用不同尺寸的移液枪头或其他方法，并优化以获得理想的解离效果20。
  9. 将解离后的细胞在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL mGBSS 中。加入 Hoechst 33342 核染料，使其终浓度为 1 µg/mL。
  10. 将 100–500 µL 细胞悬液滴加至刻蚀的 ITO 玻璃载玻片上，静置约 5 分钟或更长时间，使细胞沉降并附着于载玻片表面。
    1. 细胞悬液的稀释倍数需通过实验确定。使用光学显微镜，在载玻片上滴加少量细胞悬液以粗略判断细胞密度，并据此进行稀释，确保细胞之间有足够的间距（即间距明显大于 MALDI 激光束尺寸）。可在第一张载玻片上进行初步稀释，随后根据需要调整后续载玻片的稀释比例。
  11. 使用真空系统（从真空管线起依次包括）：1）带在线气体 HEPA 过滤器的导管，2）连接至 50 mL 抽滤瓶的导管，3）连接至第二个抽滤瓶进气口并配有移液枪头（如 100 μL）的导管，轻柔地将载玻片上的细胞悬液吸除。若需将已接种的细胞保存以供后续使用，则吸除悬液后加入 33% 甘油溶液处理 1–2 分钟，再将其移除。
    注意：此步骤有助于维持细胞稳定性。从一侧加入甘油溶液的同时从另一侧轻柔抽吸，最有利于保持细胞结构完整。在制备首个样本时，应始终使用倒置显微镜目视监控此处描述的所有步骤。
  12. 向已沉积细胞的区域加入 100–500 µL 醋酸铵溶液，静置约 1 分钟后吸除，以清洗载玻片。根据需要重复此步骤，确保载玻片上无任何盐分或甘油残留。

3. 显微镜检查

注意：为了确定沉积细胞的位置，每张载玻片均需通过明场/荧光显微镜成像。荧光通道可用于精确定位经Hoechst染色的细胞，而明场成像则提供形态学信息。任何具备拼接图像采集功能的显微镜均适用于此过程。

  1. 如果之前未进行此步骤，请用 2–3 mL 的 150 mM 醋酸铵溶液冲洗载玻片。此步骤至关重要，可去除甘油和盐结晶，这些物质会干扰显微镜观察和 MALDI 基质的涂布。将载玻片置于温和的 N2 气流下吹干，或自然晾干。
  2. 将载玻片装入显微镜载物台。使用至少 10 个均匀分布在载玻片上的支撑点进行显微镜聚焦。
  3. 使用适用于 DAPI（激发波长：335–383 nm，发射波长：420–470 nm）和明场成像的滤光片，在整个载玻片上以 5×–10× 放大倍数获取拼接荧光图像，确保捕获步骤 1.5 中创建的定位标记。
    注意：通常 5× 放大倍数已足够，尤其是在需要成像大量载玻片时。若需分辨更精细的细胞形态，可使用 10× 或 20× 物镜，但成像时间将呈平方级增长，且文件体积显著增加。
  4. 使用显微镜软件（如 ZEN（Zeiss））对拼接图像进行图像拼接。精确的拼接至关重要，因为此步骤中的任何误差都会传递至最终的配准步骤，导致靶向不准确。检查时应确保垂直相邻的图像瓦片之间无偏移。此外，建议以较大的瓦片重叠率（20%–30%）采集拼接图像。
  5. 在显微镜软件中处理并导出每幅图像为 bigTIFF 文件。如果成像区域相对较小，最终图像文件大小小于 2 GB，则可改用标准 TIFF 文件格式。

4. 基质应用

注意：一致且正确的 MALDI 基质应用对于获得高质量的单细胞数据至关重要。尽管本文使用商业设备进行升华法涂布，但基质应用也可通过机器人喷涂仪12、喷笔21或自制升华装置22完成。我们发现，与通常用于质谱成像的薄组织切片相比，单细胞样本所需的基质量更少。为减少批次效应，建议在同一次实验中对所有待研究载玻片进行基质涂布，并尽可能将不同组别（例如脑区或处理组与对照组）的细胞沉积在同一张载玻片上。基质的选择对于传统的 MALDI 和 MALDI-2 单细胞工作流程均至关重要。在单细胞 MALDI 中，DHB23、9-AA24和 CHCA25已被成功应用。在 MALDI-2 中，我们及其他研究者观察到 DHAP9可显著增强信号，而 NEDC16和 CHCA26等基质也已被有效使用。

  1. 将 20 mg 的 2,5-二羟基苯乙酮（DHAP）溶解于 1.5 mL 丙酮中。将载玻片放入升华室的支架中，并将其置于升华装置内。
  2. 用移液器将溶解的基质溶液点样至陶瓷晶片上，待丙酮完全挥发。关闭升华室以确保密封。
  3. 在冷却室中加入冰水混合物，并将其放置在升华室顶部。
  4. 开启真空泵，使系统平衡 5 分钟。系统内压力应低于 40 mbar。
  5. 通过将升华室加热至 200 °C 持续 5 分钟，开始升华过程。
  6. 移除冰水浴，将温度调至 25 °C，并在升华室顶部放置一个散热装置。让系统缓慢升温至室温约 5 分钟，以避免冷凝水形成。
    注意：盛放冰水浴的容器可清空后注入热水，作为散热装置使用。
  7. 缓慢释放系统压力，打开升华室，取出载玻片。

5. 单细胞基质辅助激光解吸电离质谱

注意：单细胞质谱数据使用 MALDI-2 timsTOF 仪器（timsTOF flex）和开源的 microMS 软件包获取，用于检测细胞并引导质谱仪。此过程需要将目标细胞在光学图像中的像素位置转换为质谱仪载物台的物理坐标。

  1. 打开 microMS 软件，使用“图像组”选项对 bigTIFF 显微图像进行降采样，因为图像包含明场和荧光通道。
  2. 使用“斑点选项”工具确定用于选择目标细胞的最佳参数。调整以下参数：最大和最小斑点尺寸，用于确定检测斑点的大小范围；阈值设置，用于确定荧光通道进行斑点检测时的分割阈值；以及圆形度，用于确定被识别细胞的形状接近圆形的程度。对于本研究中的数据，我们使用的参数值如下：最大圆形度：无；最小圆形度：0.6；阈值：75；最小尺寸：20；最大尺寸：无。
  3. 使用“查找斑点”功能识别斑点，并在弹出窗口中将斑点列表以指定名称保存。
  4. 使用“距离滤波”工具设定每个细胞之间必须保持的特定距离（对于本实验数据，在使用5倍荧光显微镜成像时，我们设定了35像素的距离滤波）。此步骤旨在确保细胞之间足够分离，以便进行单细胞分析。该数值单位为像素，因此需了解显微镜的像素与微米（µm）之间的换算关系，以确定理想数值。建议采用激光探针直径加上约20–30 µm，以补偿定位过程中的误差。
  5. 使用 MTP Slide Adapter II 将载玻片装入仪器。返回 microMS 所在计算机，通过远程桌面应用程序连接至质谱仪计算机。
  6. 若为首次使用该仪器，需验证仪器的 X-Y 坐标位置。操作方法为：进入“工具”菜单下的“仪器设置”。弹出窗口将显示一组包含 X 和 Y 位置的坐标。在仪器上的 MTP Slide Adapter II 几何结构中选择 Each of These Specific Points，并在 microMS 窗口中更新对应的 X 和 Y 坐标。
  7. 利用质谱仪的相机和载物台控制功能，导航至载玻片上一个易于识别的位置，并复制仪器坐标。在 microMS 中，在显微图像中找到对应位置，右键单击该点，并在弹出窗口的文本框中输入坐标。所有坐标应四舍五入至最接近的整数，X 和 Y 坐标之间以空格分隔（例如：39595 -23232）。
  8. 重复步骤 5.7，至少在整个载玻片范围内注册12个基准标记点。当添加了三个注册点后，其中一个圆圈将变为红色，表示该点相对于整体注册位置偏差最大。若出现此情况，请使用 shift + 右键单击删除当前注册点，然后重新尝试。
  9. 在“文件”菜单下，选择“保存”，然后选择“注册”，以保存注册文件（.msreg 格式）。
  10. 在显微图像上显示斑点后，通过“文件”→“保存”→“仪器位置”保存仪器位置文件（.xeo 格式）。使用远程桌面软件将此 .xeo 文件传输至仪器计算机。
  11. 将自定义生成的 .xeo 文件中的文本复制到仪器上的 MTP Slide Adapter II 对应的 .xeo 文件中并保存。此操作将使用细胞位置信息更新该几何文件。
  12. 点击 Automation 标签页，选择 New… 以启动自动运行。在显示的样本区域上拖动以选择细胞，右键单击将其添加到分析列表中。保存自动化运行任务，然后点击 Start Automatic Run 开始数据采集。运行时长取决于多种因素，包括细胞数量、激光射击次数和激光频率；一般情况下，在 MALDI 模式（10 kHz 激光重复频率）下每秒可分析约 5–10 个细胞，在 MALDI-2 模式（1 kHz 激光重复频率）下每秒可分析 1–5 个细胞。

6. 数据处理

注意：现有的商业软件包并不适合分析高通量单细胞质谱数据。尽管可以对单个质谱进行可视化，但提取有意义的生物学信息需要专门的工具。为解决这一问题，我们提供了一款免费软件，可促进单细胞 MALDI-2 质谱数据的分析。我们更新后的工作流程支持将单细胞数据直接转换为开源的 imzML 格式27，从而实现与 SCiLS MVS 及其他厂商软件的兼容。对于更高级的数据分析，完整脚本还包含由 Matplotlib（版本 3.7.3）支持的脂质注释、聚类及其他可视化工具功能。原始数据的解析与读取由 pyTDFSDK 库实现，该库是一组包含在 TIMSCONVERT 工作流程28中的函数。

  1. 通过将 补充文件 1 中提供的文件复制到与 Jupyter Notebook 相同的工作路径下，并在第一个代码单元格中按下键盘上的 Shift + Enter，来初始化自定义 Python 库 SC_MALDI2_Analysis。这将使我们能够在后续调用这些函数并用于处理数据。
  2. 复制采集数据的路径（Bruker .d 文件）。我们建议对每个文件夹及文件名进行描述性命名，以便后续解析这些文件路径以建立每个样本的元数据。运行 导入 Bruker .d 文件 并保存至列表的代码单元格。这将输出已加载的 .d 文件总数。
  3. 运行标题为 处理原始数据并保存为 imzML 的代码单元格。该步骤将读取每个提供的 Bruker .d 文件，对数据进行峰提取，然后将每个峰周围 20 ppm 范围内的数据保存为位于 .d 文件内部的 .imzML 文件。
    1. 要查找已保存的数据，请打开第一个 .d 文件所在的位置，imzML 文件及其他元数据将被保存在此路径中。在此阶段，已保存的 imzML 文件可导入厂商软件（如 SCiLS Lab MVS）中。如需进行更高级的数据分析，请继续按照脚本操作。
  4. 通过运行“加载先前保存的 imzML 文件”代码单元格，加载已保存的 imzML 数据。这会将保存的数据加载到变量 data 中。
  5. 运行“数据分箱并保存数据矩阵”代码单元格，将所有数据沿公共 m/z 轴进行分箱，去除低丰度（<0.1%）的特征，并剔除低于噪声水平（100 相对强度）的值。该函数随后通过计算每个箱内各峰 m/z 值的平均值对数据重新分箱。生成的数据矩阵保存为 datacube_array，与矩阵对应的 m/z 分箱保存为 valid_mz_bins，每个分箱的计数保存为 count。
  6. 为对数据进行注释，请运行 导出峰用于 LIPID MAPS 注释 代码单元格。这会将数据矩阵中的所有 m/z 峰复制到剪贴板。将其粘贴到一个空白文本文件中并保存，以便上传至 LIPID MAPS。
  7. 打开 lipidmaps.org，选择 MS Data Bulk Search 和 Search LMSD，以搜索生物学相关的脂质种类。通过选择该文本文件上传峰列表，并选择适当的加合物（例如 [M+H]+、[M+Na]+ 和 [M+K]+）。根据您的质谱仪选择合适的质量容差（我们选择 ±0.01 m/z），选择所有感兴趣的脂质类别，然后点击 Search。下载生成的 .tsv 文件。
  8. 通过运行 加载单细胞路径以获取元数据 代码单元格，加载光谱元数据。根据文件路径结构修改此处的 split 代码。
  9. 通过运行 数据预处理与脂质注释 代码单元格对数据进行预处理。该步骤将使用 lipidMAPS 的 tsv 文件对数据集进行注释（误差控制在 10 ppm 内），从 lipidMAPS 结果中剔除奇数碳链脂质，对剩余数据进行归一化处理，并去除未达到特定阈值的特征或细胞。处理后的新数据集将保存为 data2，更新后的光谱元数据保存为 updated_cell_types。
  10. 使用 scanpy 对数据进行分析。运行 单细胞 UMAP 与聚类分析 代码单元格，选择感兴趣的数据（此处我们仅选择 MALDI-2、M2 数据），对数据集进行缩放，并将其加载至 scanpy AnnData 对象中以便进行分析。
    注意：此处对数据集进行了 Leiden 聚类和降维（UMAP）分析，同时可视化了原始数据类别和 UMAP 上的聚类结果，并使用 scanpy 的 rank_genes_groups_dotplot 函数总结了各聚类间最具统计显著性的部分特征。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

荧光引导的单细胞MALDI-2质谱工作流程概览如图1所示。首先，从目标脑区分离的组织（图1A）被解离为单个细胞，并沉积到导电的ITO涂层显微镜载玻片上（图1B）。通过全片荧光成像确定细胞位置（图1C），随后进行MALDI基质涂布（图1D）、微质谱辅助的MALDI-2质谱分析（图1E）以及数据分析（图1F）。利用该工作流程，可在单个细胞内初步鉴定出数十至数百种脂质，质荷比准确度优于10 ppm（使用MALDI-2 timsTOF仪器）。

质谱成像可用于小范围感兴趣区域，以评估细胞制备和基质涂布的质量。图2A展示了...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

高通量、图像引导的单细胞基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI MS）是研究单细胞尺度化学异质性的有力工具。引入激光诱导后电离技术（MALDI-2）可实现更全面的分析物覆盖，这对于哺乳动物单细胞等质量与体积受限的样品尤为关键。

尽管已发表的单细胞脂质和代谢物质谱工作流程绝大多数使用培养细胞，但我们的方法应用于相对较快分离的原代细胞。这一区别至关重要，因为培养细胞仅在数天的培养过程中，其代谢物和脂质含量即表现出显著变化23,31。在大多数情况下，酶法细胞分离会导致轴突、树突和星形胶质细胞突起等精细细胞结构的丢失。因此，所观测到的分析物信号主要来源于细胞胞体。尽管如此，仍可成功实现按细胞类型4和脑区进行分类12。这表明，许多特异于不同类型细胞的脂质位于胞体中。

基质施加方法上的微小差异可能对最终的分析物信号产生显著影响。我...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何竞争利益需要披露。

致谢

S.W.C. 感谢 Peixin He 和 Xiaoming Chen 博士奖学金（PhD4 Fellowship）以及伊利诺伊大学资助奖学金（University of Illinois Block Grant Fellowship）提供的支持。本工作还获得了美国国家药物滥用研究所（National Institute on Drug Abuse）资助号 P30DA018310、美国国家老龄化研究所（National Institute on Aging）资助号 R01AG078797，以及美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）主任办公室资助号 S10OD032242 的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2',5'-二羟基苯乙酮Sigma AldrichD107603DHAP，纯度97%
乙酸铵Sigma Aldrich238074ACS级试剂，≥97%
Axio M2 ImagerZeissN/AN/A
活检打孔器，2 mmFisher Scientific12-460-399integra miltex标准活检打孔器，2 mm
氯化钙Sigma AldrichC4901无水，粉末，≥97%
Eppendorf离心机Sigma AldrichEP54050004415425型离心机，配FA-24x2转子
庆大霉素Sigma AldrichG1272液体，BioReagent级
玻璃蚀刻笔Sigma AldrichZ225568碳化钨头，每包1支
甘油Sigma AldrichG7893ACS级试剂，≥99.5%
HEPES缓冲液Sigma AldrichH3375≥99.5%（滴定法）
Hoechst 33258溶液Sigma Aldrich944031 mg/mL水溶液，≥98.0%（HPLC）
在线HEPA过滤器Sigma AldrichWHA67225001VACU-GUARD 60 mm圆盘，0.45 μm PTFE外壳
ITO涂层显微镜载玻片Delta TechnologiesCG-90IN-S115电阻70–100Ω
氯化镁Sigma AldrichM8266无水，≥98%
硫酸镁Sigma Aldrich208094无水，≥97%
微量离心管Sigma AldrichHS4323K管容量1.5 mL，每包500个
木瓜蛋白酶解离系统Worthington Biochemical LK003150一盒，含5个一次性使用小瓶
青霉素-链霉素Sigma AldrichP4458液体，BioReagent级
氯化钾Sigma Aldrich529552分子生物学级
磷酸二氢钾Sigma AldrichP5379Reagent Plus级
碳酸氢钠Sigma AldrichS6014ACS级试剂，≥99.7%
氯化钠Sigma AldrichS9888ACS级试剂，≥99%
氢氧化钠Sigma Aldrich221465ACS级试剂，≥97%，颗粒状
磷酸氢二钠Sigma AldrichS9763ACS级试剂，≥99%
升华物HTXN/AN/A
timsTOF FleX MALDI-2BrukerN/A支持microGRID
真空管路 Thermo Scientific8701-0080Nalgene无邻苯二甲酸酯PVC管路 

参考文献

  1. Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. Membrane lipids and cell signaling. Curr Opin Lipidol. 28 (5), 408-413 (2017).
  2. Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  3. Cheng, K. W., Su, P. R., Feller, K. J. A., Chien, M. P., Hsu, C. C. Investigating the Metabolic Heterogeneity of Cancer Cells Using Functional Single-Cell Selection and nLC Combined with Multinozzle Emitter Mass Spectrometry. Anal Chem. 96 (2), 624-629 (2024).
  4. Neumann, E. K., Comi, T. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Lipid Heterogeneity between Astrocytes and Neurons Revealed by Single-Cell MALDI-MS Combined with Immunocytochemical Classification. Ange Chem. 131 (18), 5971-5975 (2019).
  5. Bhaduri, A., Neumann, E. K., Kriegstein, A. R., Sweedler, J. V. Identification of Lipid Heterogeneity and Diversity in the Developing Human Brain. JACS Au. 1 (12), 2261-2270 (2021).
  6. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nuc Acid Res. 42 (14), 8845-8860 (2014).
  7. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  8. Croslow, S. W., Trinklein, T. J., Sweedler, J. V. Advances in multimodal mass spectrometry for single-cell analysis and imaging enhancement. FEBS Lett. 598 (6), 591-601 (2024).
  9. Bien, T., Bessler, S., Dreisewerd, K., Soltwisch, J. Transmission-Mode MALDI Mass Spectrometry Imaging of Single Cells: Optimizing Sample Preparation Protocols. Anal Chem. 93 (10), 4513-4520 (2021).
  10. Rappez, L., et al. SpaceM reveals metabolic states of single cells. Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  11. Comi, T. J., Neumann, E. K., Do, T. D., Sweedler, J. V. microMS: A Python Platform for Image-Guided Mass Spectrometry Profiling. J Am Soc Mass Spec. 28 (9), 1919-1928 (2017).
  12. Xie, Y. R., et al. Multiscale biochemical mapping of the brain through deep-learning-enhanced high-throughput mass spectrometry. Nat Methods. 21 (3), 521-530 (2024).
  13. Neumann, E. K., Ellis, J. F., Triplett, A. E., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Lipid Analysis of 30 000 Individual Rodent Cerebellar Cells Using High-Resolution Mass Spectrometry. Anal Chem. 91 (12), 7871-7878 (2019).
  14. Soltwisch, J., et al. Mass spectrometry imaging with laser-induced postionization. Science. 348 (6231), 211-215 (2015).
  15. Barré, F. P. Y., et al. Enhanced Sensitivity Using MALDI Imaging Coupled with Laser Postionization (MALDI-2) for Pharmaceutical Research. Anal Chem. 91 (16), 10840-10848 (2019).
  16. McKinnon, J. C., et al. MALDI-2-Enabled Oversampling for the Mass Spectrometry Imaging of Metabolites at Single-Cell Resolution. J Am Soc Mass Spec. 35 (11), 2729-2742 (2024).
  17. Comi, T. J., Makurath, M. A., Philip, M. C., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. MALDI MS Guided Liquid Microjunction Extraction for Capillary Electrophoresis-Electrospray Ionization MS Analysis of Single Pancreatic Islet Cells. Anal Chem. 89 (14), 7765-7772 (2017).
  18. Wu, J., et al. Transcardiac Perfusion of the Mouse for Brain Tissue Dissection and Fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  19. Aboghazleh, R., et al. Rodent brain extraction and dissection: A comprehensive approach. MethodsX. 12, 102516(2024).
  20. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Adv Med Sci. 61 (1), 78-84 (2016).
  21. Chan-Andersen, P. C., Romanova, E. V., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Profiling 26,000 Aplysia californica neurons by single cell mass spectrometry reveals neuronal populations with distinct neuropeptide profiles. J Biol Chem. 298 (8), 102254(2022).
  22. Castro, D. C., Xie, Y. R., Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Sweedler, J. V. Image-guided MALDI mass spectrometry for high-throughput single-organelle characterization. Nat Methods. 18 (10), 1233-1238 (2021).
  23. Castro, D. C., et al. Single-Cell and Subcellular Analysis Using Ultrahigh Resolution 21 T MALDI FTICR Mass Spectrometry. Anal Chem. 95 (17), 6980-6988 (2023).
  24. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proc Natl Acad Sci. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  25. Krestensen, K. K., et al. Molecular Profiling of Glioblastoma Patient-Derived Single Cells Using Combined MALDI-MSI and MALDI-IHC. Anal Chem. 97 (7), 3846-3854 (2025).
  26. Niehaus, M., Soltwisch, J., Belov, M. E., Dreisewerd, K. Transmission-mode MALDI-2 mass spectrometry imaging of cells and tissues at subcellular resolution. Nat Methods. 16 (9), 925-931 (2019).
  27. Xie, Y. R., et al. Data-Driven and Machine Learning-Based Framework for Image-Guided Single-Cell Mass Spectrometry. J Proteome Res. 22 (2), 491-500 (2023).
  28. Luu, G. T., et al. TIMSCONVERT: a workflow to convert trapped ion mobility data to open data formats. Bioinformatics. 38 (16), 4046-4047 (2022).
  29. Vandergrift, G. W., et al. Experimental and Computational Evaluation of Lipidomic In-Source Fragmentation as a Result of Postionization with Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization. Anal Chem. 96 (41), 16127-16133 (2024).
  30. Zhang, Y., Parmigiani, G., Johnson, W. E. ComBat-seq: batch effect adjustment for RNA-seq count data. NAR Genom Bioinfo. 2 (3), lqaa078(2020).
  31. Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Single-Cell Metabolomics: Changes in the Metabolome of Freshly Isolated and Cultured Neurons. ACS Chem Neurosci. 3 (10), 782-792 (2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

单细胞质谱分析MALDI质谱分析荧光显微镜基质涂布神经细胞分析脂质谱型分析高通量分析空间分辨分析UMAP聚类
荧光引导的基质辅助激光解吸/电离结合激光诱导后电离质谱分析单个大鼠神经细胞
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。