本文介绍了从海洋和淡水生态系统的真光层采样的方法，以分离蓝藻噬菌体（及其宿主），以及采样后富集单一基因型并表征病毒-宿主相互作用动态的过程。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
对光合微生物及其病毒的环境采样，在理解当前海洋和淡水生态系统生物多样性、生态系统动态以及气候变化相关因素（如温度升高和酸化）对物种进化轨迹和群落组成的影响方面发挥着关键作用。然而，病毒圈的多样性决定了无法采用单一通用的采样与实验流程。事实上，每种病毒系统都具有独特的特征，需要对病毒学中的标准操作流程进行相应调整，才能实现研究目标。尽管病毒的发现与表征需依赖针对特定目标系统的策略，但对于所有病毒而言，研究目标是相似的：分离病毒、确定宿主范围、确认 productive 感染，并对病毒、宿主以及病毒-宿主相互作用关系进行表征。对病毒-宿主系统的可靠描述至少应包括形态学、生理学、生物化学以及组学（omics）特征的阐明。通过改变感染复数、温度、pH、宿主转换、定向进化或施加药物以观察病毒-宿主系统的响应，还可获得进一步的信息。本实验室研究涵盖生命三域（古菌、细菌和真核生物）中的病毒。在本报告中，我们详细描述了从淡水和海洋环境的真光层中采样光合微生物的方法，并重点聚焦于分离感染蓝细菌的噬菌体（即蓝藻噬菌体）。蓝细菌是这些水生生态系统中初级生产力和营养循环的关键物种。本文所述流程涵盖从不同水深采水，到利用液体和固体培养基培养、先进的分子/遗传学方法以及分析手段对病毒-宿主系统特征进行表征的全过程。所描述的方法可适用于跨生命三域的噬菌体及其他病毒发现研究中的病毒-宿主系统研究。
引言
阐明蓝藻噬菌体及其宿主的感染动态和进化关系，对于理解当前及未来海洋和淡水生态系统的状态至关重要。先进的高通量测序技术与现代分析方法使得蓝藻噬菌体（及宿主）基因组能够快速测序，从而研究病毒-宿主之间的相互关系1,2。然而，研究流程始于环境采样，以分离和鉴定病毒及其宿主3,4,5。由于病毒圈的多样性，目前尚无一种通用的方案可用于采样和表征所有病毒及细菌噬菌体。事实上，每种病毒-宿主系统都具有其独特的特征。尽管如此，无论研究何种病毒系统，其基本目标均相似：分离病毒；确定宿主范围；在一个或多个宿主中证明 productive 感染；利用定性和定量方法对病毒、宿主以及病毒-宿主感染动态进行表征。通过扰动系统，可进一步深入理解病毒系统。改变感染复数（MOI）6、温度、pH、宿主菌株，或施加药物以观察系统响应，可进一步揭示病毒-宿主动态的本质。更高级的操作，例如定向进化，可提供有关该系统潜在进化轨迹的信息，并揭示共进化终点可能如何影响更大范围的微生物群落及整个生态系统。
本研究提供了一种模型化（但易于调整）的环境采样方案，用于采集在海洋、淡水及其他水生生态系统中参与营养循环和初级生产的光合微生物，如蓝细菌和微藻7,8,9,10,11。该工作流程聚焦于从海洋和淡水环境的真光层中分离宿主及其病毒和噬菌体，这些病毒和噬菌体是这些生态系统中的关键驱动因素12。病毒和噬菌体均影响真核生物和原核生物的种群结构，并显著影响生态系统的多样性与生产力13。因此，本研究的目标是提供一套采样方案及采样后的操作流程，以促进宿主和病毒的富集，进而开展以下研究：单病毒-单宿主、多病毒-单宿主、单病毒-多宿主以及多病毒-多宿主之间的相互作用动态；揭示病毒-宿主感染动态背后的组学（-omics）研究基质；以及探索影响所研究病毒-宿主系统及其来源更大生态系统的潜在共进化路径与进化终点。
具体而言，我们描述了一种用于环境采样、样品的野外预处理（即在到达实验室之前）、噬菌体（及病毒）分离的后续处理、富集混合微生物培养物以鉴定敏感宿主、获得潜在宿主的单菌落分离物以及验证宿主的流程。 真正 病毒-宿主关系（即 productive infection），并表征基本的感染特性（如毒力）。感染实验不仅允许计算相对毒力（VR)14 以及宿主的恢复力（RR)15 但还包括在关键时间点提取培养样品的步骤，用于研究观察到的生理现象背后的组学底物（即病毒-宿主相互作用动态）。最后，我们讨论了潜在的陷阱、故障排除方法与解决方案，以及如何修改特定步骤以针对特定分类群。该工作流程适用于蓝藻噬菌体-蓝细菌、藻类DNA病毒-微藻以及嗜热斐氏病毒-古菌系统。16,17，证明了其在表征细菌域、真核生物域和古菌域这三类生命体中的病毒方面的实用性。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 环境采样
注意：本方案描述了从美国加利福尼亚州南部海岸线附近5英里范围内的透光层中采集光合微生物的离岸采样方法。然而，该方案已被调整用于湖泊、冰冻湖泊或地热温泉的采样（图1）。
- 沿美国加利福尼亚州南部海岸线进行近海环境采样
注意：使用一艘长6米、V型深底、中控台式船只（即快艇），配备双150马力外挂发动机，并装载科研设备（材料表）。选择三个站点进行真光层采样：（a）1号站点：北纬30°15.436，西经117°31.551；（b）2号站点：北纬33°12.521，西经117°25.275；（c）3号站点：北纬32°59.914，西经117°17.058。在每个站点，于中午时分从三个不同深度各采集20升水样：< 3米（表层水样）、6米和14米。- 转移泵组件安装：到达每个采样点后，抛下船锚，并从导航系统记录GPS坐标。组装采样系统。
- 简要步骤：将一段内径2.54厘米、长50英尺的Flex-Plus蓝色PVC软管一端连接至一个直径2.54厘米的吸水滤网，以防止大颗粒杂物进入泵系统。使用胶带固定滤网与软管的连接处。将软管另一端连接至1马力不锈钢转移泵的进水歧管。
- 将一段长10英尺、内径2.54厘米的抗压橡胶软管连接至泵的出水口。将转移泵的电源线插入由汽油驱动的3800瓦逆变发电机。组装完成后，对转移泵进行预灌引水，并测试以确保泵系统正常运行（图1，上排）。
- 为转移管配重：将一根长25米、直径1.25厘米的尼龙船用绳一端固定在14公斤重的蘑菇形锚的眼环上。每隔3米用胶带将绳子与蓝色PVC管固定在一起，滤网位置应距锚约1米，以防止滤网陷入沙中或撞击水下岩石。利用该锚将转移管（蓝色PVC管）沉入水中，并避免强水流导致船体与管道之间形成过大角度，从而确保采样深度准确。将锚、绳和管道组件下放至目标深度。
- 海水样品采集：当带滤网的管道末端到达目标深度后，启动发电机和泵。如需引水，可重新引灌或轻摇转移管，使水开始从指定深度泵出。当水持续稳定地从深水处被抽出后，先将1至2管体积的水排回海洋，以确保流经泵系统的水确实来自目标深度。随后使用20升水桶收集水样（图1，上排最右侧）。
- 样品运送到野外工作站：装填20升水桶时，水量应约为18升，以留出顶空空间，便于运输过程中水样与空气之间的气体交换（如O2/CO2）。在盖紧水桶盖之前，记录原始水样的温度、pH值和盐度。然后盖紧桶盖，将水桶放置于船舱下层的冰床上，并用浅色布料覆盖，以防阳光直射和高温影响。
- 转移泵组件安装：到达每个采样点后，抛下船锚，并从导航系统记录GPS坐标。组装采样系统。
- 水样的野外预处理
注意：到达陆上设施（如酒店房间、会议室或野外工作站）后，需进行一系列预处理步骤，以保护水样中的微生物成分，并根据颗粒大小分离海水样品的不同组分。- 过滤系统组装：将一段长1米、内径9.525毫米的透明乙烯基软管一端连接至便携式气动隔膜真空泵的真空接口接头处。将同一根软管的另一端连接至一个容量1.0升、孔径0.45 µm的滤杯真空组件。依次使用0.45 µm和0.22 µm滤杯组件，按如下所述分离海水样品的不同组分。
- 测试系统是否存在泄漏或滤膜破损：通过0.45 µm聚醚砜（PES）膜滤杯过滤0.25升海水样品。若系统无泄漏，在海水完全过滤后，滤膜与滤网之间应能形成负压吸附状态。
- 通过0.45 µm PES膜滤杯组件进行过滤：为分离光合微生物（如微藻和蓝细菌），目标是使用两个1升滤杯（或四个500毫升滤杯）将2升海水样品通过0.45 µm PES膜滤杯组件进行过滤。所有滤液瓶均应正确标注滤膜孔径、采样深度、日期及采样点编号。最后拧紧瓶盖，并用半透明布料或套管覆盖装有0.45 µm滤液的瓶子，以防强光照射。
注意：切勿让滤杯中的滤膜变干。应始终保持滤膜表面有一薄层液体。滤膜会逐渐积累生物碎屑（如细胞）。若滤膜因碎屑堵塞，应小心拧开滤杯组件，将已使用的滤杯暂放一旁，但不得丢弃堵塞的滤杯。更换新的0.45 µm滤膜后继续过滤。 - 通过0.22 µm PES膜滤杯组件进行过滤：为分离大型真核病毒，取上一步骤（步骤1.2.3）所得的1升0.45 µm滤液，通过0.22 µm滤杯进行过滤。对超滤液瓶进行正确标注，内容包括滤膜孔径、采样深度、日期及采样点编号。最后拧紧瓶盖，并覆盖装有0.22 µm超滤液的瓶子（即由0.45 µm滤液进一步过滤所得）。
注意：切勿让滤杯中的滤膜变干。应始终保持滤膜表面有一薄层液体。滤膜会积累含有生物样本的生物碎屑。若滤膜堵塞，应拧开滤杯组件，将已使用的滤杯暂放一旁，不得丢弃。更换新的0.22 µm滤膜后继续操作。 - 浓缩0.45 µm滤膜上的生物量：将48毫升滤液（来自0.22 µm过滤）分别倒入两个无菌的50毫升锥形聚丙烯离心管中。使用无菌手术刀，在滤杯组件内沿已使用过的0.45 µm滤膜最外缘均匀切割。使用无菌镊子取出载有生物量且湿润的滤膜，将其切成两半。将其中一半卷成卷状，放入一个50毫升锥形管中。另一半重复相同操作，放入第二个50毫升锥形管中。拧紧管盖，并用透明封膜（如Parafilm）密封。标记试管。
- 浓缩0.22 µm滤膜上的大型病毒生物量： 将14毫升超滤液分别倒入两个无菌的15毫升锥形聚丙烯离心管中。使用无菌手术刀，在滤杯组件内沿已使用过的0.22 µm滤膜外缘进行切割。使用无菌镊子取出载有生物量且湿润的滤膜，将其切成两半。将其中一半卷起并插入一个15毫升锥形管中，另一半同样处理并放入第二个15毫升锥形管中。拧紧管盖，并用透明封膜（如Parafilm）密封。每根管子均需标注滤膜孔径（即0.22 µm）、采样点、采样深度和日期。
- 保留剩余的0.45 µm滤液以及剩余的0.22 µm滤液，用于运回实验室。对每个采样深度和采样点重复执行整个过滤流程（步骤1.2.2至1.2.6）。
注意：超滤液将在实验室中用作培养基基础（含天然矿物质及其他营养物质）。
原始样品显微观察（可选）：取一个装有0.45 µm滤膜的50毫升锥形管，轻轻摇晃。使用塑料滴管（或移液器）从中取出30–50毫升海水，制备载玻片样品并加盖盖玻片。利用野外显微镜和计算机观察载玻片内容，检测并记录所观察到的微生物特征（图2D）。
2. 样品处理以浓缩病毒/噬菌体并富集宿主
注意：本方案描述了样本从野外采集地运抵实验室后所需进行的最初处理步骤。通过飞机或陆路交通工具运输可能需要考虑不同的因素。环境样本的活性会随着温度、pH、盐度、光照暴露或缺乏光照、溶解气体（如 CO2 和 O2）浓度的剧烈变化，以及环境采样与实验室处理之间时间的延长而降低。
- 旋转浓缩并储存病毒和噬菌体
注意：样本到达实验室后，若能在8小时内完成处理，可尽量减少因采样点提取与实验室接收之间的时间间隔而导致的活性微生物损失。以下步骤将制备浓缩的噬菌体（或病毒）悬液分装样品（即工作储备液），用于长期保存和后续使用。- 浓缩超滤液：针对每个采样点和采样深度，将剩余约800 mL超滤液运送至实验室。使用3K NMWL的15 mL离心超滤管，在6000 × g条件下离心10–20分钟，将50–100 mL超滤液浓缩至1.0–1.5 mL。按照先前所述方法16制备透射电镜（TEM）载网，以检测所得浓缩超滤液中是否存在病毒样颗粒（VLPs）。若检测到VLPs，将浓缩液分装为每份100 mL的 aliquot。于4 °C保存（或于-20 °C进行长期保存）。
- 从0.22 µm滤膜上浓缩颗粒：使用无菌解剖刀轻轻刮取0.22 µm滤膜上的残留物，并将其转移至运输所用的50 mL离心管中的超滤液内。使用10K NMWL的旋转浓缩杯组件，将50–200 mL悬液浓缩至约3 mL的截留样品体积。按照先前所述方法16制备TEM载网，以确定是否有来自0.45 µm滤液的病毒样颗粒被截留在0.22 µm滤膜表面。若检测到VLPs，将浓缩液分装为每份100 mL的 aliquot，并于4 °C保存（或于-20 °C进行长期保存）。
- 旋转浓缩并富集0.45 µm滤膜的截留物。
注意：混合微生物培养物中可能含有上述步骤（2.1.1和2.1.2）所分离病毒和噬菌体的宿主。通过旋转浓缩和富集混合培养物，可获得用于建立潜在宿主纯培养的工作储备液（见步骤3）。- 浓缩混合悬液：针对每个采样点和采样深度，将约100 mL含有细胞碎片的0.45 µm滤膜及其超滤液运回实验室。使用无菌解剖刀将0.45 µm滤膜上的碎片轻轻刮入运输所用的50 mL离心管中的超滤液中。在4 °C条件下，以2000 × g离心10分钟，使生物量沉淀。用移液器轻柔吹打，将沉淀重悬于5 mL 1:8稀释的BG-11培养基18中。
- 富集0.45 µm滤膜的截留物：在六个250 mL带挡板的锥形瓶中平行接种培养，其中三瓶含50 mL BG-11培养基，另三瓶含采样点超滤液40 mL与BG-11培养基10 mL的混合液。每瓶接种0.5 mL细胞浓缩液（来自步骤2.2.1）。将锥形瓶置于光生物反应器中，在25 °C、光照强度为20–40 mmol 光子/m2/s的条件下轻微振荡培养至少7–10天19。当生长旺盛时（例如OD730nm = 0.8），在4 °C条件下以2000 × g离心10分钟收集沉淀。用移液器轻柔吹打，将沉淀重悬于10 mL 1:8稀释的BG-11培养基中。将细胞悬液分装为10–20份，每份0.5 mL，装入带螺口盖的冻存管中，于-80 °C保存。
3. 建立微生物宿主的单基因型纯培养
注意：本方案描述了从采集的环境样品处理得到的混合培养物中分离和纯化病毒及噬菌体的潜在微生物宿主的操作步骤。可分离并纯化多种宿主表型，从而提高检测储水样品中所含病毒和噬菌体的易感宿主的概率（步骤 2.1.1–2.1.2）。
- 平板划线与单菌落分离株的筛选
注意：从混合培养物中获得多个单基因型纯培养物，旨在提高分离到在环境采样过程中捕获的病毒或噬菌体的敏感且易感宿主的概率，并用于研究病毒或噬菌体的宿主范围。- 按以下方法制备单菌落分离株（SCI）。
- 制备 BG-11 琼脂平板20。将保存于 -80 °C 的混合悬液（来自步骤 2.2.2）一份置于冰上解冻。使用无菌接种环，采用标准技术20将细胞浓缩物划线接种至 BG-11 琼脂平板上。将划线后的平板置于光生物反应器中，在 25 °C、光照强度为 20–40 mmol photon/m2/s 的条件下培养约 10 天 ，或直至平板上出现菌落。
- 在 20 mL 培养管中制备约 10 份种子培养物，每管加入 5 mL BG-11 培养基和/或 5 mL 样品点超滤液与 BG-11 的混合液。用无菌牙签从平板上挑取一个单菌落分离株（SCI），并将每根牙签分别投入各培养管中进行单独接种。在光生物反应器中以 25 °C、光照强度 20–40 mmol photon/m2/s 的条件下轻微振荡培养至少 10–15 天，或直至检测到生长（例如，OD730nm = 0.4–0.8）。
注意：若首次划线平板上存在多种菌落表型（如形态、透明度、颜色等），应从不同菌落表型中分别挑选单个菌落进行接种。
- 工作菌种纯培养物的建立：一旦检测到阳性种子培养物生长，重复划线操作，直至平板上仅出现单一菌落表型（图 3B 和 图 4B）。将种子培养物扩增至 250 mL 带挡板的三角瓶中的 50 mL 培养体系（图 3C 和 图 4C），方法同上（步骤 2.2.2）。制备约 20 份 0.5 mL 的 SCI 细胞悬液，用移液器分装至 1.0 mL 螺口冻存管中，用于 -80 °C 保存。
注意：在建立蓝藻纯培养物时，可能需要添加抗生素或抗真菌剂（如亚胺培南、放线菌酮）以减少污染21。平板接种步骤是定向分离蓝藻或微藻的关键环节。培养期间的光照参数可根据光照强度或明暗循环进行调整。
- 按以下方法制备单菌落分离株（SCI）。
- 单基因型表征及工作菌种的保存
注意：为确认单个潜在宿主基因型的分离与富集，需对纯培养物进行形态学和遗传学表征。- 形态学表征：当液体培养与固体培养基平板操作循环后获得单一细胞表型时，应通过光学显微镜（图 2A–C）以及在条件允许时通过透射电子显微镜（TEM）和/或扫描电子显微镜（SEM；图 3A 和 图 4A）对微生物形态类型进行表征。在光学显微镜下（例如 60x–100x 放大倍数），可观察到绿色、浅棕色或透明的单细胞、群体、丝状、螺旋状、分枝状或具有藻丝结构的细胞排列方式。这些特征可提示可能的分类学归属。
- 遗传学表征：通过对潜在纯培养物提取 DNA 并进行部分基因组测序，验证单一微生物基因型的分离。在蓝藻中，16S rRNA 基因常作为靶标（图 5A）22。16S 系统发育分析可用于确定其分类群归属22。在微藻中，通常以 18S rRNA 为靶标23。对于具有研究价值或新发现的分离株，可进一步开展全基因组测序。
4. 单基因型病毒/噬菌体悬液的制备
注意：本方案描述了从环境样品中分离和纯化多种单一基因型病毒及噬菌体悬液的步骤。
- 病毒样颗粒浓缩物的稀释与透射电镜观察
注意：通过透射电子显微镜（TEM）和基于平板的噬斑实验24，可确认病毒样颗粒（VLPs）为能够感染宿主细胞的真实噬菌体（或病毒）。- 滤液（0.45 µm 和 0.22 µm）的透射电子显微镜观察：使用原始水样经 0.45 µm 和 0.22 µm 滤膜过滤后所得的浓缩物（见步骤 2.1），制备 TEM 载网16并成像，以观察病毒颗粒的异质性（即形态类型的多样性）。若载网上颗粒密度过高（例如达 90%），应在进行后续步骤前对样品进行稀释，使最终载网上的颗粒密度控制在 30%–50%。可通过人工计数或图像分析软件估算载网上颗粒的覆盖度。
注意：载网上颗粒密度过高可能导致固体培养基平板上的宿主菌苔被完全清除，而非形成可挑选的独立噬斑。因此，在进行噬斑实验前对样品进行稀释可节省时间。或者，也可使用 VLP 浓缩物的系列稀释液，测试多个宿主菌苔平板以检测宿主-病毒相互作用。 - 检测噬菌体（或病毒）在宿主菌苔上的活性：在 BG-11 琼脂平板上，由工作菌种（步骤 3.1.2）培养形成蓝细菌（或微藻）的疑似宿主菌苔。将 0.5 mL VLP 悬液加入 4.5 mL 培养基中，滴加至菌苔表面（图6A，左），轻轻旋转平板，使悬液均匀覆盖整个菌苔表面。将平板置于光生物反应器中，在 25 °C、光照强度为 20–40 mmol 光子/m2/s 的条件下培养 3–10 天，直至平板上出现可见噬斑（图6A，右）。
- 滤液（0.45 µm 和 0.22 µm）的透射电子显微镜观察：使用原始水样经 0.45 µm 和 0.22 µm 滤膜过滤后所得的浓缩物（见步骤 2.1），制备 TEM 载网16并成像，以观察病毒颗粒的异质性（即形态类型的多样性）。若载网上颗粒密度过高（例如达 90%），应在进行后续步骤前对样品进行稀释，使最终载网上的颗粒密度控制在 30%–50%。可通过人工计数或图像分析软件估算载网上颗粒的覆盖度。
- 刮取噬斑并建立单一基因型病毒或噬菌体悬液
注意：通过刮取单个噬斑表型并在宿主液体培养物中扩增噬菌体，可确认真实的宿主-噬菌体（或宿主-病毒）相互作用，从而建立用于感染实验的噬菌体（或病毒）工作菌种。噬菌体（或病毒）工作菌种必须通过多种方法之一（如 qPCR、噬斑实验）测定滴度，以便在确定的感染复数（MOI）下进行后续感染实验。- 分离并扩增单一噬菌体（或病毒）基因型：当平板上可清晰观察到单个噬斑时（因 VLP 浓缩物已充分稀释），使用无菌接种环刮取单个噬斑。将接种环在 10 mL 宿主种子培养物中轻轻搅动（图6B，左）。在光生物反应器中，于 25 °C、光照强度 20–40 mmol 光子/m2/s 条件下，以轻微振荡（例如 70–120 rpm）培养 3–10 天，直至 OD730nm 下降或在试管底部观察到细胞碎片，表明细胞死亡或裂解（图6B，右）25。
注意：若噬斑可在宿主菌苔上形成，但在液体培养中未见感染迹象，则噬斑可能由细菌素26而非噬菌体（或病毒）引起。透射电镜可辅助平板实验，通过显示由噬菌体（或病毒）感染导致的细胞死亡提供证据。 - 测定噬菌体（或病毒）工作菌种的滴度：通过上述过滤与离心浓缩方法可实现噬菌体（或病毒）的分离。采用系列稀释噬斑实验27测定噬菌体（或病毒）悬液的滴度。或者，也可进行 DNA 提取、全病毒基因组测序及系统发育分析（图5B），设计特异性引物，通过基于 qPCR 的滴定方法建立用于后续感染实验的噬菌体工作菌种。
注意：若滴度或工作菌种体积不足以满足实验需求，可将单一噬菌体（或病毒）基因型的扩增规模提升至 50 mL 或 100 mL 培养。在建立工作菌种时，应考虑病毒-宿主系统的特性（如高毒力或低毒力）、计划用于感染实验的感染复数（MOI）以及项目中需进行的感染实验次数。不建议反复冻融病毒菌种。每次实验应解冻并使用同一批次制备、相同滴度的独立病毒菌种之一。其他滴定技术也可作为补充，包括电喷雾电离/质谱法（ESI/MS）28。
- 分离并扩增单一噬菌体（或病毒）基因型：当平板上可清晰观察到单个噬斑时（因 VLP 浓缩物已充分稀释），使用无菌接种环刮取单个噬斑。将接种环在 10 mL 宿主种子培养物中轻轻搅动（图6B，左）。在光生物反应器中，于 25 °C、光照强度 20–40 mmol 光子/m2/s 条件下，以轻微振荡（例如 70–120 rpm）培养 3–10 天，直至 OD730nm 下降或在试管底部观察到细胞碎片，表明细胞死亡或裂解（图6B，右）25。
5. 感染实验
注意：本实验方案描述了用于在固体培养基上定性表征毒力、宿主范围和感染表型（反映复制策略的指标），以及在液体培养物中定量评估生长动力学、病毒毒力14和宿主抗性15的宿主-噬菌体（或宿主-病毒）感染实验。
- 在固体培养基上测定噬菌体（或病毒）的相对毒力和宿主范围
注意：所有固体培养基实验，包括涂布平板法、单板连续稀释噬斑法和宿主抗性平板实验，均可提供关于噬菌体-宿主感染参数的定性数据，例如病毒毒力、宿主范围和复制策略。液体培养生长实验则可实现更定量的测量，并用于病毒-宿主动态关系的建模。- 点种法检测：为确定宿主范围，制备来自环境样品或其他实验室或菌种保藏中心获得的多种潜在宿主的菌苔。用移液器在菌苔上点加2 µL噬菌体（或病毒）悬液。在同一平板的另一区域，分别点加等量的Triton X-100和超纯水（18MW）作为阳性和阴性对照。16. 对给定的噬菌体（或病毒）在多种宿主上进行多次涂布平板斑点实验，以评估该噬菌体的宿主范围16噬菌体（或病毒）的噬斑表型可揭示其复制策略。边界清晰且可完全清除至琼脂层的噬斑表明为裂解性复制，而边界弥散或具有晕圈的噬斑则可能表明为非裂解性复制。16,17.
注意： alternatively，单板连续稀释噬斑测定可用于判断噬斑大小与噬菌体滴度之间是否存在线性关系。使用记号笔在平板背面将平板划分为网格状或扇形区域。随后，在相同体积（即 2 mL）但不同稀释度的噬菌体悬液（例如 1:1、1:4、1:16、1:64）条件下，在同一宿主平板上进行点种法噬斑测定。 - 宿主抗性检测：为确定一组噬菌体是否能在特定宿主上引发感染，按上述方法在平板上制备宿主菌苔。使用记号笔在平板背面将平板划分为网格状或饼状区域。随后，将每种噬菌体（或病毒）悬液各2 mL点样至网格（或饼状）的一个区域中，以Triton X-100和纳米纯水作为对照。若所有噬菌体（或病毒）悬液以相同滴度加入，则可定性评估不同噬菌体株（或病毒）在宿主上的相对毒力（即噬菌斑越大，表示病毒毒力越强）。
- 点种法检测：为确定宿主范围，制备来自环境样品或其他实验室或菌种保藏中心获得的多种潜在宿主的菌苔。用移液器在菌苔上点加2 µL噬菌体（或病毒）悬液。在同一平板的另一区域，分别点加等量的Triton X-100和超纯水（18MW）作为阳性和阴性对照。16. 对给定的噬菌体（或病毒）在多种宿主上进行多次涂布平板斑点实验，以评估该噬菌体的宿主范围16噬菌体（或病毒）的噬斑表型可揭示其复制策略。边界清晰且可完全清除至琼脂层的噬斑表明为裂解性复制，而边界弥散或具有晕圈的噬斑则可能表明为非裂解性复制。16,17.
- 量化液体培养感染实验中的毒力、恢复力与生长能力
注意：初步的定性结果可为靶向特定的噬菌体-宿主配对关系以及更深入地定量分析病毒-宿主相互作用动态提供依据。在液体培养中，通过生成感染宿主的生长曲线，并与未感染（对照）宿主的生长曲线进行比较。- 按照下述方法进行液体培养的单病毒/单宿主感染实验。
- 建立6-12个平行液体培养物（例如集胞藻），所用微生物应经固体培养基平板实验（步骤5.1）证实对其敏感且可支持生长，培养容器可选用1.0 L（装液量320 mL）、500 mL（装液量160 mL）或250 mL（装液量80 mL）的带挡板培养瓶，具体操作如前所述17在预设的时间点（通常为主宿主倍增时间的0.5或1倍），以相同的细胞密度（例如，OD730 nm 以预选的感染复数（MOI）和可用的工作浓度噬菌体悬液，按所需适当体积，设三个重复进行实验。
- 将其他平行培养物（同样设三个重复）保持未接种状态（即未感染），作为空白对照。可选地，用另一种噬菌体（或病毒）菌株接种第三组平行培养物，以便比较不同噬菌体-宿主配对之间的差异。将培养物置于光生物反应器中，在25 °C下培养3–10天，光照强度设定为20–40 mmol photons/m²/s。2/ s.
- 通过测定OD值生成宿主生长曲线730 nm 以规律的时间间隔（例如 8 h）记录噬菌体感染组与未感染组（对照组）培养物的读数（图7A）。使用透射电子显微镜（TEM）验证未感染的对照培养物（图7C）以及在宿主细胞培养中的有效感染（图7D细胞病变效应29,30 在大多数感染细胞中可 readily 观察到，而未感染细胞则不表现出形态学改变或应激迹象。
- 液体培养感染实验的基线分析：从单病毒/单宿主（SVSH）液体培养感染实验中可获得多个基线指标，例如：最大比生长速率（µ最大值)31相对噬菌体（或病毒）毒力14以及相对宿主韧性15- 用于更定量地描述噬菌体-宿主或病毒-宿主动态关系（图7B）。标准的可报告指标包括生长速率（通常报告为最大比生长速率，或 µ最大值）以及相对于未感染的宿主对照组和/或在同一宿主上的另一种噬菌体的相对毒力（VR）14。其他指标包括系统承载能力（N渐近线）以及宿主的相对恢复力（RR)15 也可能被报告。
- 按照下述方法进行液体培养的单病毒/单宿主感染实验。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
使用便携式汽油动力发电机、水体转移泵及抗压塌软管，可有效从海洋、湖泊、冰封湖泊及其他水体环境（如泻湖）的特定深度提取水样（图1，前三行）。对于地热温泉、池塘和泥浆池等高温酸性水体，需要使用其他设备，其pH值可能具有 < 4 且温度高于 90 °C一根长竹竿或可伸缩的铝合金泳池清洁杆，其末端可固定250 mL瓶子或50 mL离心管，可用于从这些极端环境中采集水样（图1，底行）。在所有情况下，均记录水样的基线数据，包括温度、pH、盐度和GPS坐标。图1，底行，中左。
水样应从采样现场立即运送至野外工作站或实验室内，以便完成样品的预处理（见图8A，灰色框；步骤1.2）。在预处理过程中，使用野外显微镜验证微生物是否存活（见图2D）。
...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
病毒圈极为广阔且多样化，因此研究不同的病毒系统需要采用不同的实验方法。这包括从不同环境中分离病毒及其宿主的不同策略，以及采用不同的处理方法，以确保能够从原始样品中获得宿主及其病毒的纯培养物。这些纯培养物可用于固相培养基和液体培养中的病毒-宿主（SVSH）感染实验，从而实现对系统特征及病毒-宿主动态关系的定量分析。在本报告中，我们描述了一种标准但可调整的工作流程，用于从海洋、湖泊、冰盖下水体以及其他水生环境（例如地热池和温泉）中采集样品。该工作流程详细说明了样品在运回实验室前的现场预处理步骤，这对于确保有活性的微生物群能够成功运抵实验室并进行更深入的分析至关重要。通过一系列不同孔径的滤膜对原始样品进行过滤和滤膜浓缩，分离样品中的不同组分，并避免样品暴露于阳光（即紫外线辐射）和极端温度等不利因素，是该工作流程第一步的关键环节（图8）。
进入实验室后，可将0.45 µm滤液直接进行离心浓缩，或先将0.45 µm滤液通过0.22 µm滤膜截留生物量后再对截留物进行离心浓缩，从而富集真核病毒或较大的原核病毒（例如噬菌体、古菌病毒）。...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究部分得到了美国国家科学基金会（NSF）OISE项目编号1856091（项目负责人：Ceballos）和NSF DBI项目编号2119968（项目负责人：Ceballos）的资助。作者感谢泰国国王科技大学（Thonburi）的Chinnapong Wangnai博士和Chakrit Tachaapaikoon博士所做出的贡献，他们分别为环境采样提供了视频拍摄和野外支持。作者还感谢哥斯达黎加大学瓜纳卡斯特分校的Jorge Armando Leiva Sanabria博士，他在获取哥斯达黎加国家公园的采样许可以及地热池样本采集过程中提供了协助。作者同样感谢加利福尼亚大学默塞德分校的Enrique Marroquin, Jr. 先生和缅因大学（美国缅因州奥罗诺）的Alexia Maceda女士，他们分别协助完成了南加州海岸以及明尼苏达州北部湖泊的采样工作。作者感谢并致谢Socheata Hour女士提供的技术支持，她计算了φSBL14-SWII 数据集的感染参数。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 马力不锈钢转子泵 | Utilitech, Charlotte, NC, USA | N/A | |
| 1.5 ml 离心管 | www.eppendorf.com | 30123611 | |
| 10K NMWL Centricon Plus 70 离心浓缩管 | www.sigmaaldrich.com | UFC701008 | |
| 250 mL 带挡板锥形瓶 | www.sigmaaldrich.com | CLS4450250 | |
| 3800 瓦逆变发电机 | WEN Products, West Dundee, IL, USA | WEN 56380i | |
| 3K NMWL Amicon 15 mL 离心浓缩管 | www.sigmaaldrich.com | UFC800308 | |
| 500 mL 带挡板锥形瓶 | www.sigmaaldrich.com | CLS4450500 | |
| 5 加仑水桶 | www.homedepot.com | N/A | |
| 80 英尺长，0.5” 直径，尼龙材质 | https://facomex.mx/producto/combo/ | N/A | |
| 一艘 26 英尺深 V 型中控台 Sailfish 2660 船，配备两台 150 马力雅马哈舷外发动机 | https://yamahaoutboards.com/ | N/A | |
| 乙酸铵 (CH3CO2NH4) | www.sigmaaldrich.com | 631618 | |
| 硼酸 (H3BO3) | www.sigmaaldrich.com | 10043353 | |
| 二水氯化钙 (CaCl2·2H2O) | www.sigmaaldrich.com | 10035048 | |
| Centrifuge 5920 R 离心机 | www.eppendorf.com | 5948000107 | |
| 柠檬酸 (C6H8O7) | www.sigmaaldrich.com | 77929 | |
| 六水合硝酸钴(II) [Co(NO3)2·6H2O] | www.sigmaaldrich.com | 10026229 | |
| 抗塌陷橡胶软管 | swanhose.com | CELTF58050 | |
| 五水硫酸铜(II) (CuSO4·5H2O) | www.sigmaaldrich.com | 7758998 | |
| Corning 50 mL 离心管 | www.sigmaaldrich.com | CLS430291 | |
| 磷酸氢二钾 (K2HPO4) | www.sigmaaldrich.com | 7758114 | |
| 乙二胺四乙酸二钠 (Na2EDTA) | www.sigmaaldrich.com | 6381926 | |
| DS-11 FX+_微量分光光度计和荧光计 | www.denovix.com | N/A | |
| 封箱胶带 | www.homedepot.com | N/A | |
| Eppendorf 管 | www.sigmaaldrich.com | EP022364120 | |
| 乙醇 | www.sigmaaldrich.com | 64175 | |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | www.sigmaaldrich.com | 60004 | |
| 柠檬酸铁铵 (C6H8O7·xFe3+·yNH3) | www.sigmaaldrich.com | 1185575 | |
| Flex-plus 蓝色 PVC 软管 | www.carlonsales.com | 12008-750 | |
| Innova S44i - 可堆叠恒温摇床 | www.eppendorf.com | 2231001081 | |
| LVEM5 台式电子显微镜_透射电子显微镜 (TEM) | delongamerica.com | N/A | |
| 七水硫酸镁 (MgSO4·7H2O) | www.sigmaaldrich.com | 10034998 | |
| 四水氯化锰(II) (MnCl2·4H2O) | www.sigmaaldrich.com | 13446349 | |
| 蘑菇锚，黑色乙烯基涂层，30 磅 | www.homedepot.com | N/A | |
| 聚苯乙烯培养皿 | www.sigmaaldrich.com | P5481 | |
| 带 0.22 mm 聚醚砜 (PES) 膜滤杯 | www.sigmaaldrich.com | Z358193-1CS | |
| 带 0.45 mm 聚醚砜 (PES) 膜滤杯 | www.sigmaaldrich.com | Z370622-1CS | |
| 乙基黄原酸钾 (C2H5OCSSK) | www.sigmaaldrich.com | 140896 | |
| 碳酸钠 (Na2CO3) | www.sigmaaldrich.com | 497198 | |
| 十二烷基硫酸钠 [CH3(CH2)11OSO3Na] | www.sigmaaldrich.com | 151213 | |
| 二水钼酸钠 (Na2MoO4·2H2O) | www.sigmaaldrich.com | 10102406 | |
| 硝酸钠 (NaNO3) | www.sigmaaldrich.com | 7631994 | |
| 三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸 (TES) (C6H15NO6S) | www.sigmaaldrich.com | 7365448 | |
| Triton X-100 | www.sigmaaldrich.com | T8787 | |
| 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl) | www.sigmaaldrich.com | 1185531 | |
| 真空/压力泵 | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL, USA | EW-79204-00 | |
| 乙烯基软管 | www.homedepot.com | N/A | |
| 七水硫酸锌 (ZnSO4·7H2O) | www.sigmaaldrich.com | 7446200 |
参考文献
- Zhang, D., You, F., He, Y., Te, S. H., Gin, K. Y. H. Isolation and characterization of the first freshwater cyanophage infecting Pseudanabaena. J Virol. 94 (17), 10-1128 (2020).
- Dong, Z. Isolation, Characterization and Ecological Dynamics of Tropical Freshwater Cyanophages. , National University of Singapore. Doctoral dissertation (2022).
- Sime-Ngando, T. Environmental bacteriophages: viruses of microbes in aquatic ecosystems. Front Microbiol. 5, 355(2014).
- Sigee, D. C. Freshwater microbiology: biodiversity and dynamic interactions of microorganisms in the aquatic environment. , John Wiley & Sons. (2005).
- Jacquet, S., Miki, T., Noble, R., Peduzzi, P., Wilhelm, S. Viruses in aquatic ecosystems: important advancements of the last 20 years and prospects for the future in the field of microbial oceanography and limnology. Adv Oceanography Limnol. 1 (1), 97-141 (2010).
- Tucker, S., Pollard, P. Identification of cyanophage Ma-LBP and infection of the cyanobacterium Microcystis aeruginosa from an Australian subtropical lake by the virus. Appl Environ Microbiol. 71 (2), 629-635 (2005).
- Bhardwaj, A., et al. Cyanobacteria: a key player in nutrient cycling. Cyanobacteria. , 579-596 (2024).
- Douterelo, I., et al. Methodological approaches for studying the microbial ecology of drinking water distribution systems. Water Res. 65, 134-156 (2014).
- Brandt, J. P., Flannigan, M. D., Maynard, D. G., Thompson, I. D., Volney, W. J. A. An introduction to Canada's boreal zone: ecosystem processes, health, sustainability, and environmental issues. Environ Rev. 21 (4), 207-226 (2013).
- Ramanan, R., Kim, B. H., Cho, D. H., Oh, H. M., Kim, H. S. Algae-bacteria interactions: evolution, ecology and emerging applications. Biotechnol Adv. 34 (1), 14-29 (2016).
- Atkinson, C. L., Capps, K. A., Rugenski, A. T., Vanni, M. J. Consumer-driven nutrient dynamics in freshwater ecosystems: From individuals to ecosystems. Biol Rev. 92 (4), 2003-2023 (2017).
- Mojica, K. D., Brussaard, C. P. Factors affecting virus dynamics and microbial host-virus interactions in marine environments. FEMS Microbiol Ecol. 89 (3), 495-515 (2014).
- Graham, E. B., et al. Microbes as engines of ecosystem function: when does community structure enhance predictions of ecosystem processes. Front Microbiol. 7, 214(2016).
- Ceballos, R. M., Stacy, C. L. Quantifying relative virulence: when µ max fails and AUC alone just is not enough. J General Virol. 102 (1), 001515(2021).
- Hour, S., Pierce, A. J., Heng, S. Y., Plymale, R., Ceballos, R. M. Quantifying Resilience in Single-Host/Single-Virus Infections. Appl Microbiol. 5 (1), 18(2025).
- Ceballos, R. M., et al. Differential virus host-ranges of the Fuselloviridae of hyperthermophilic Archaea: implications for evolution in extreme environments. Front Microbiol. 3, 295(2012).
- Ceballos, R. M., Drummond, C. G., Stacy, C. L., Padilla-Crespo, E., Stedman, K. M. Host-dependent differences in replication strategy of the Sulfolobus spindle-shaped virus strain SSV9 (aka, SSVK1): infection profiles in hosts of the family Sulfolobaceae. Front Microbiol. 11, 1218(2020).
- Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. Microbiology. 111 (1), 1-61 (1979).
- Kliphuis, A. M., Janssen, M., van den End, E. J., Martens, D. E., Wijffels, R. H. Light respiration in Chlorella sorokiniana. J Appl Phycol. 23, 935-947 (2011).
- Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. J Vis Exp. (111), e54001(2016).
- Noroozi, M., Amozegar, M. A., Rahimi, R., Shahzadeh Fazeli, S. A., Bakhshi Khaniki, G. The isolation and preliminary characterization of native cyanobacterial and microalgal strains from lagoons contaminated with petroleum oil in Khark Island. Biol J Microorg. 5 (20), 33-41 (2017).
- Nübel, U., Garcia-Pichel, F., Muyzer, G. PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (8), 3327-3332 (1997).
- Tragin, M., Lopes dos Santos, A., Christen, R., Vaulot, D. Diversity and ecology of green microalgae in marine systems: an overview based on 18S rRNA gene sequences. Perspect. Phycol. 3 (3), 141-154 (2016).
- Uchida, H., et al. A coupled assay system for the lysis of cyanobacteria. Japanese J Water Treatment Biol. 34 (1), 67-75 (1998).
- Drummond, C. Characterization of Sulfolobus. Spindle-shaped Virus replication. , Portland State University. (2010).
- Flores, E., Wolk, C. P. Production, by filamentous, nitrogen-fixing cyanobacteria, of a bacteriocin and of other antibiotics that kill related strains. Arch Microbiol. 145, 215-219 (1986).
- Wick, C., McCubbin, P. Characterization of purified MS2 bacteriophage by the physical counting methodology used in the integrated virus detection system (IVDS). Toxicol Methods. 9 (4), 245-252 (1999).
- Marei, E. M., Elbaz, R., Hammad, A. Induction of temperate cyanophages using heavy metal-copper. Int J Microbiol Res Rev. 5 (5), 472(2013).
- Bratchkova, A., Kroumov, A. D. Microalgae as producers of biologically active compounds with antibacterial, antiviral, antifungal, antialgal, antiprotozoal, antiparasitic and anticancer activity. Acta Microbiol Bulgarica. 36 (3), 79-89 (2020).
- Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. The virulence index: a metric for quantitative analysis of phage virulence. Phage. 1 (1), 27-36 (2020).
- Omata, T., Murata, N. Isolation and characterization of three types of membranes from the cyanobacterium (blue-green alga) Synechocystis PCC 6714. Arch Microbiol. 139, 113-116 (1984).
- Wilson, W. H., Joint, I. R., Carr, N. G., Mann, N. H. Isolation and molecular characterization of five marine cyanophages propagated on Synechococcus sp. strain WH7803. Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3736-3743 (1993).
- Grasso, C. R., et al. A review of cyanophage-host relationships: Highlighting cyanophages as a potential cyanobacteria control strategy. Toxins. 14 (6), 385(2022).
- Srivastava, A., Gupta, N., Mishra, A. K. Cyanophages: interacting mechanism and evolutionary significance. Cyanobacteria. , 255-282 (2024).
- Cai, L., et al. Abundant and cosmopolitan lineage of cyanopodoviruses lacking a DNA polymerase gene. ISME J. 17 (2), 252-262 (2023).
- Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86 (4), 295-335 (2014).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
