本文介绍了从海洋和淡水生态系统的真光层采样的方法，以分离蓝藻噬菌体（及其宿主），以及采样后富集单一基因型并表征病毒-宿主相互作用动态的过程。
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本文内容
摘要
摘要
对光合微生物及其病毒的环境采样，在理解当前海洋和淡水生态系统生物多样性、生态系统动态以及气候变化相关因素（如温度升高和酸化）对物种进化轨迹和群落组成的影响方面发挥着关键作用。然而，病毒圈的多样性决定了无法采用单一通用的采样与实验流程。事实上，每种病毒系统都具有独特的特征，需要对病毒学中的标准操作流程进行相应调整，才能实现研究目标。尽管病毒的发现与表征需依赖针对特定目标系统的策略，但对于所有病毒而言，研究目标是相似的：分离病毒、确定宿主范围、确认 productive 感染，并对病毒、宿主以及病毒-宿主相互作用关系进行表征。对病毒-宿主系统的可靠描述至少应包括形态学、生理学、生物化学以及组学（omics）特征的阐明。通过改变感染复数、温度、pH、宿主转换、定向进化或施加药物以观察病毒-宿主系统的响应，还可获得进一步的信息。本实验室研究涵盖生命三域（古菌、细菌和真核生物）中的病毒。在本报告中，我们详细描述了从淡水和海洋环境的真光层中采样光合微生物的方法，并重点聚焦于分离感染蓝细菌的噬菌体（即蓝藻噬菌体）。蓝细菌是这些水生生态系统中初级生产力和营养循环的关键物种。本文所述流程涵盖从不同水深采水，到利用液体和固体培养基培养、先进的分子/遗传学方法以及分析手段对病毒-宿主系统特征进行表征的全过程。所描述的方法可适用于跨生命三域的噬菌体及其他病毒发现研究中的病毒-宿主系统研究。
引言
阐明蓝藻噬菌体及其宿主的感染动态和进化关系，对于理解当前及未来海洋和淡水生态系统的状态至关重要。先进的高通量测序技术与现代分析方法使得蓝藻噬菌体（及宿主）基因组能够快速测序，从而研究病毒-宿主之间的相互关系1,2。然而，研究流程始于环境采样，以分离和鉴定病毒及其宿主3,4,5。由于病毒圈的多样性，目前尚无一种通用的方案可用于采样和表征所有病毒及细菌噬菌体。事实上，每种病毒-宿主系统都具有其独特的特征。尽管如此，无论研究何种病毒系统，其基本目标均相似：分离病毒；确定宿主范围；在一个或多个宿主中证明 productive 感染；利用定性和定量方法对病毒、宿主以及病毒-宿主感染动态进行表征。通过扰动系统，可进一步深入理解病毒系统。改变感染复数（MOI）6、温度、pH、宿主菌株，或施加药物以观察系统响应，可进一步揭示病毒-宿主动态的本质。更高级的操作，例如定向进化，可提供有关该系统潜在进化轨迹的信息，并揭示共进化终点可能如何影响更大范围的微生物群落及整个生态系统。
本研究提供了一种模型化（但易于调整）的环境采样方案，用于采集在海洋、淡水....
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方案
1. 环境采样
注意：本方案描述了从美国加利福尼亚州南部海岸线附近5英里范围内的透光层中采集光合微生物的离岸采样方法。然而，该方案已被调整用于湖泊、冰冻湖泊或地热温泉的采样（图1）。
- 沿美国加利福尼亚州南部海岸线进行近海环境采样
注意：使用一艘长6米、V型深底、中控台式船只（即快艇），配备双150马力外挂发动机，并装载科研设备（材料表）。选择三个站点进行真光层采样：（a）1号站点：北纬30°15.436，西经117°31.551；（b）2号站点：北纬33°12.521，西经117°25.275；（c）3号站点：北纬32°59.914，西经117°17.058。在每个站点，于中午时分从三个不同深度各采集20升水样：< 3米（表层水样）、6米和14米。- 转移泵组件安装：到达每个采样点后，抛下船锚，并从导航系统记录GPS坐标。组装采样系统。
- 简要步骤：将一段内径2.54厘米、长50英尺的Flex-Plus蓝色PVC软管一端连接至一个直径2.54厘米的吸水滤网，以防止大颗粒杂物进入泵系统。使用胶带固定滤网与软管的连接处。将软管另一端连接至1马力不锈钢转移泵的进水歧管。
- 将一段长10英尺、内径2.54厘米的抗压橡胶软管连接至泵的出水口。将转....
- 转移泵组件安装：到达每个采样点后，抛下船锚，并从导航系统记录GPS坐标。组装采样系统。
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结果
使用便携式汽油动力发电机、水体转移泵及抗压塌软管，可有效从海洋、湖泊、冰封湖泊及其他水体环境（如泻湖）的特定深度提取水样（图1，前三行）。对于地热温泉、池塘和泥浆池等高温酸性水体，需要使用其他设备，其pH值可能具有 < 4 且温度高于 90 °C一根长竹竿或可伸缩的铝合金泳池清洁杆，其末端可固定250 mL瓶子或50 mL离心管，可用于从这些极端环境中采集水样（图1，底行）。在所有情况下，均记录水样的基线数据，包括温度、pH、盐度和GPS坐标。图1，底行，中左。
水样应从采样现场立即运送至野外工作站或实验室内，以便完成样品的预处理（见图8A，灰色框；步骤1.2）。在预处理过程中，使用野外显微镜验证微生物是否存活（见图2D）。
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讨论
病毒圈极为广阔且多样化，因此研究不同的病毒系统需要采用不同的实验方法。这包括从不同环境中分离病毒及其宿主的不同策略，以及采用不同的处理方法，以确保能够从原始样品中获得宿主及其病毒的纯培养物。这些纯培养物可用于固相培养基和液体培养中的病毒-宿主（SVSH）感染实验，从而实现对系统特征及病毒-宿主动态关系的定量分析。在本报告中，我们描述了一种标准但可调整的工作流程，用于从海洋、湖泊、冰盖下水体以及其他水生环境（例如地热池和温泉）中采集样品。该工作流程详细说明了样品在运回实验室前的现场预处理步骤，这对于确保有活性的微生物群能够成功运抵实验室并进行更深入的分析至关重要。通过一系列不同孔径的滤膜对原始样品进行过滤和滤膜浓缩，分离样品中的不同组分，并避免样品暴露于阳光（即紫外线辐射）和极端温度等不利因素，是该工作流程第一步的关键环节（图8）。
进入实验室后，可将0.45 µm滤液直接进行离心浓缩，或先将0.45 µm滤液通过0.22 µm滤膜截留生物量后再对截留物进行离心浓缩，从而富集真核病毒或较大的原核病毒（例如噬菌体、古菌病毒）。.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究部分得到了美国国家科学基金会（NSF）OISE项目编号1856091（项目负责人：Ceballos）和NSF DBI项目编号2119968（项目负责人：Ceballos）的资助。作者感谢泰国国王科技大学（Thonburi）的Chinnapong Wangnai博士和Chakrit Tachaapaikoon博士所做出的贡献，他们分别为环境采样提供了视频拍摄和野外支持。作者还感谢哥斯达黎加大学瓜纳卡斯特分校的Jorge Armando Leiva Sanabria博士，他在获取哥斯达黎加国家公园的采样许可以及地热池样本采集过程中提供了协助。作者同样感谢加利福尼亚大学默塞德分校的Enrique Marroquin, Jr. 先生和缅因大学（美国缅因州奥罗诺）的Alexia Maceda女士，他们分别协助完成了南加州海岸以及明尼苏达州北部湖泊的采样工作。作者感谢并致谢Socheata Hour女士提供的技术支持，她计算了φSBL14-SWII 数据集的感染参数。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 马力不锈钢转子泵 | Utilitech, Charlotte, NC, USA | N/A | |
| 1.5 ml 离心管 | www.eppendorf.com | 30123611 | |
| 10K NMWL Centricon Plus 70 离心浓缩管 | www.sigmaaldrich.com | UFC701008 | |
| 250 mL 带挡板锥形瓶 | www.sigmaaldrich.com | CLS4450250 | |
| 3800 瓦逆变发电机 | WEN Products, West Dundee, IL, USA | WEN 56380i | |
| 3K NMWL Amicon 15 mL 离心浓缩管 | www.sigmaaldrich.com | UFC800308 | |
| 500 mL 带挡板锥形瓶 | www.sigmaaldrich.com | CLS4450500 | |
| 5 加仑水桶 | www.homedepot.com | N/A | |
| 80 英尺长，0.5” 直径，尼龙材质 | https://facomex.mx/producto/combo/ | N/A | |
| 一艘 26 英尺深 V 型中控台 Sailfish 2660 船，配备两台 150 马力雅马哈舷外发动机 | https://yamahaoutboards.com/ | N/A | |
| 乙酸铵 (CH3CO2NH4) | www.sigmaaldrich.com | 631618 | |
| 硼酸 (H3BO3) | www.sigmaaldrich.com | 10043353 | |
| 二水氯化钙 (CaCl2·2H2O) | www.sigmaaldrich.com | 10035048 | |
| Centrifuge 5920 R 离心机 | www.eppendorf.com | 5948000107 | |
| 柠檬酸 (C6H8O7) | www.sigmaaldrich.com | 77929 | |
| 六水合硝酸钴(II) [Co(NO3)2·6H2O] | www.sigmaaldrich.com | 10026229 | |
| 抗塌陷橡胶软管 | swanhose.com | CELTF58050 | |
| 五水硫酸铜(II) (CuSO4·5H2O) | www.sigmaaldrich.com | 7758998 | |
| Corning 50 mL 离心管 | www.sigmaaldrich.com | CLS430291 | |
| 磷酸氢二钾 (K2HPO4) | www.sigmaaldrich.com | 7758114 | |
| 乙二胺四乙酸二钠 (Na2EDTA) | www.sigmaaldrich.com | 6381926 | |
| DS-11 FX+_微量分光光度计和荧光计 | www.denovix.com | N/A | |
| 封箱胶带 | www.homedepot.com | N/A | |
| Eppendorf 管 | www.sigmaaldrich.com | EP022364120 | |
| 乙醇 | www.sigmaaldrich.com | 64175 | |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | www.sigmaaldrich.com | 60004 | |
| 柠檬酸铁铵 (C6H8O7·xFe3+·yNH3) | www.sigmaaldrich.com | 1185575 | |
| Flex-plus 蓝色 PVC 软管 | www.carlonsales.com | 12008-750 | |
| Innova S44i - 可堆叠恒温摇床 | www.eppendorf.com | 2231001081 | |
| LVEM5 台式电子显微镜_透射电子显微镜 (TEM) | delongamerica.com | N/A | |
| 七水硫酸镁 (MgSO4·7H2O) | www.sigmaaldrich.com | 10034998 | |
| 四水氯化锰(II) (MnCl2·4H2O) | www.sigmaaldrich.com | 13446349 | |
| 蘑菇锚，黑色乙烯基涂层，30 磅 | www.homedepot.com | N/A | |
| 聚苯乙烯培养皿 | www.sigmaaldrich.com | P5481 | |
| 带 0.22 mm 聚醚砜 (PES) 膜滤杯 | www.sigmaaldrich.com | Z358193-1CS | |
| 带 0.45 mm 聚醚砜 (PES) 膜滤杯 | www.sigmaaldrich.com | Z370622-1CS | |
| 乙基黄原酸钾 (C2H5OCSSK) | www.sigmaaldrich.com | 140896 | |
| 碳酸钠 (Na2CO3) | www.sigmaaldrich.com | 497198 | |
| 十二烷基硫酸钠 [CH3(CH2)11OSO3Na] | www.sigmaaldrich.com | 151213 | |
| 二水钼酸钠 (Na2MoO4·2H2O) | www.sigmaaldrich.com | 10102406 | |
| 硝酸钠 (NaNO3) | www.sigmaaldrich.com | 7631994 | |
| 三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸 (TES) (C6H15NO6S) | www.sigmaaldrich.com | 7365448 | |
| Triton X-100 | www.sigmaaldrich.com | T8787 | |
| 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl) | www.sigmaaldrich.com | 1185531 | |
| 真空/压力泵 | Cole-Parmer; Vernon Hills, IL, USA | EW-79204-00 | |
| 乙烯基软管 | www.homedepot.com | N/A | |
| 七水硫酸锌 (ZnSO4·7H2O) | www.sigmaaldrich.com | 7446200 |
参考文献
- Zhang, D., You, F., He, Y., Te, S. H., Gin, K. Y. H. Isolation and characterization of the first freshwater cyanophage infecting Pseudanabaena. J Virol. 94 (17), 10-1128 (2020).
- Dong, Z. Isolation, Characterization and Ecological Dynamics of Tropical Fresh....
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