本方案描述了使用透射电子显微镜（TEM）定量分析小鼠桶状皮层中昼夜节律变化的方法，主要关注突触数量和树突棘形态的变化。
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方法文章
透射电子显微镜作为小鼠桶状皮层昼夜节律性突触可塑性分析的可视化技术
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
研究昼夜突触可塑性需要将小鼠饲养在不同的光照条件下（12小时光照/12小时黑暗循环，LD 12:12，以及持续黑暗，DD），提供跑轮供其活动，并在24小时内四个明确的时间点处死小鼠——分别在白天/主观白天的起始和中期，以及夜晚/主观夜晚的起始和中期。随后对脑组织进行适当固定，用于透射电子显微镜（TEM）观察。桶状皮层因其精确的躯体定位结构，是此类分析的理想模型。为获取所需脑区，使用振动切片机对脑组织进行水平切片，然后挑选包含桶状皮层的切片并将其包埋于Polybed树脂中。从含有目标桶状结构的包埋块中连续切取超薄切片。利用体视学剖分法（stereological dissector method）对电子显微照片中的兴奋性和抑制性突触密度进行分析。此外，TEM图像还用于树突棘的三维重建。树突棘形态的变化表明神经元在一天中发生重塑。在小鼠中，兴奋性突触的数量在睡眠期（白天）达到峰值，而抑制性突触则在其活跃期（夜间中期）达到高峰。
引言
昼夜节律由生物体内几乎所有生理过程中的生物钟产生。在动物和人类中，昼夜节律已在分子、细胞以及整个生物体水平上被检测到，并体现在其行为中。生物体的昼夜系统由主生物钟（起搏器）和外周生物钟组成。所有生物钟均通过钟控基因的周期性表达产生昼夜振荡，而这些基因的表达又受到其编码蛋白的调控。生物钟的分子机制所产生的节律周期约为1天（可能长于或短于24小时），但在昼夜交替的条件下，内源性节律的周期会被同步为24小时。在无脊椎动物和脊椎动物神经系统的生理过程中已发现多种昼夜节律；然而，一些研究表明，昼夜节律也存在于突触可塑性和神经元可塑性中，即突触和树突的数量与结构的变化1,2,3,4。
小鼠体感皮层因其结构清晰且与动物运动活动直接相关，是全天研究突触可塑性的理想部位5,6,7,8,9。在体感皮层的第四层中，存在明显....
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方案
所有涉及动物的实验程序均经相关机构伦理委员会批准，并依照欧洲议会和理事会关于保护用于科研目的动物的指令 2010/63/EU 以及国家法规进行。同时采取一切努力以最大程度减轻动物痛苦，并减少使用动物的数量。
1. 脑组织的制备
- 在光/暗循环（LD 12:12）和恒定黑暗（DD）条件下，于24小时周期内每隔6小时选择四个不同时间点处死小鼠（图1）。在LD 12:12条件下，使用授时因子时间（ZT）表示，其中ZT0对应光相开始，ZT12对应暗相开始；在恒定黑暗条件下，使用昼夜节律时间（CT）表示，其中CT0代表主观白天的开始，CT12代表主观夜晚的开始。
注意：各时间点分别为ZT0/CT0（白天/主观白天起始）、ZT6/CT6（白天/主观白天中期）、ZT12/CT12（夜晚/主观夜晚起始）和ZT18/CT18（夜晚/主观夜晚中期）。 - 用含2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）灌注并固定小鼠脑组织。
- 将每只小鼠的脑组织从颅骨中取出，并置于固定液（含2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的0.1 M磷酸缓冲液，pH 7.4）中，在4 °C下保存24小时。
- 为准备切片，切除小脑，并将脑组织沿中线分为两个半球（图2A
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结果
为了将本方法正确应用于昼夜节律性突触变化的分析，首先需要选择至少四个等间隔的时间点，每个活动阶段各包含两个时间点（每6小时一个）。在指定的时间点处死动物并采集其脑组织。该方法有助于识别突触可塑性的日节律或昼夜节律模式，并将其与动物运动活动的变化相关联（图1）。仅使用两个时间点虽可分析不同活动阶段间突触密度的差异，但可能无法准确反映突触变化的真实模式。用于检测昼夜节律效应的统计效能分析表明，每个时间点使用五只动物即可达到超过0.9的统计效能。该样本量在保证统计学稳健性的同时，也兼顾了动物使用的伦理考量，被视为最优选择。
小鼠体感皮层的结构使得研究位置的选择具有高度精确性和可重复性，即使在未染色的脑组织中也能清晰辨认图5A此外，我们的方法能够利用图形软件重建整个桶状皮层区，即使单个桶状列分布在连续切片上，仅通过观察单一切片难以明确识别所选的桶状结构 (图5B).......
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讨论
本文介绍了用于研究小鼠桶状皮层中突触的昼夜可塑性及树突棘重建的方法学。为确保结果可靠，昼夜可塑性研究应至少包含四个时间点。我们的研究表明，在LD 12:12条件下，分别于休息期（白天）和活动期（夜间）采集的两个时间点的数据，能够反映动物在每日不同活动阶段之间的差异。总的突触密度（包括兴奋性和抑制性突触）在休息期（睡眠期间）比活动期（运动活动期间）高出21%。此外，与活动期相比，休息期的兴奋性突触数量增加了约40%，而抑制性突触在活动期则更为丰富，高出26%5。
将分析扩展到四个时间点，能够识别出突触可塑性的日节律模式。总突触密度在一天开始后逐渐下降，在ZT18时达到最低水平，对应夜间中期。兴奋性突触也表现出类似趋势，且下降更为显著。相反，抑制性突触则呈现相反的模式，从ZT0到ZT18期间逐步增加6。
在不同光照条件下（LD 12:12 和 DD）分析突触变化也非常重要，因为比较这些结果可以推断出内在因素和光照对正在进行过程的影响。在.......
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本工作获得了波兰国家科学中心（NCN OPUS20，项目编号 UMO-2020/39/B/NZ7/03366，授予 EP）以及雅盖隆大学医学院（项目编号 N41/DBS/001129，授予 MJ）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Aclar 薄膜 | Agar scientific | AGL4458 | |
| Blender 软件 | 版本：v. 2.91.2 | ||
| 二甲胂酸钠三水合物 | Polysciences | 01131-100 | |
| 凹面载玻片 | Menzel | 9.161 151 | |
| 金刚石刀片 | Diatome | 15-US | 刀片角度：Ultra 45° |
| 数码相机 | Nikon | DXM 1200 F | |
| 十二水合磷酸氢二钠 | POCH | 799280115 | |
| 包埋树脂 | Polysciences | 08792-1 | Luft 配方 |
| 乙醇 | Pol-Aura | PA-11-0004 | |
| GIMP 软件 | 版本：v 3.0.4 | ||
| 柠檬酸铅 | TAAB | L018 | |
| 光学显微镜 | Nikon | Optiphot | |
| 四氧化锇 | Polysciences | 0223C-10 | 晶体状（99.95%） |
| 画笔 | |||
| Photoshop 软件 | 版本：CS5 | ||
| 铁氰化钾 | Sigmaaldrich | P8131 | |
| 环氧丙烷 | Sigmaaldrich | 82320 | 特纯 p.a.，≥99.5%（GC） |
| 单槽载网 | Agar scientific | AGG2525 | 2 × 0.75 mm 或 2 × 1 mm |
| 氯化钠 | Chempur | 117941206 | |
| 二水合磷酸二氢钠 | Chempur | 117991808 | |
| 体视显微镜 | pzo | ||
| 注射器滤器 | Biosens | BS25PES045 | |
| 透射电子显微镜 | Joel | JEM-2100 | |
| 超薄切片机 | Leica | UC7 | |
| 醋酸铀酰 | Lachema | ||
| 振动切片机 | Leica | VT1000 S |
参考文献
- Jasinska, M., Pyza, E. Circadian plasticity of mammalian inhibitory interneurons. Neural Plast. 2017, 1-12 (2017).
- Krzeptowski, W., Hess, G., Pyza, E. Circadian plasticity in the brain of insects and rodents. Front Neural Circuits. 12, 32(2018).
- Mansilla, ....
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重印与许可
