透射电子显微镜作为分析小鼠桶状皮层昼夜节律突触可塑性的可视化技术

Summary

所提出的协议描述了使用透射电子显微镜（TEM）来量化小鼠桶状皮层的昼夜节律变化，主要关注突触数和树突棘形态。

Abstract

检查昼夜节律突触可塑性需要将小鼠饲养在不同的照明条件下（明/暗周期，LD 12：12和恒定黑暗，DD），提供对行走轮的访问，并在24小时内的四个定义时间点牺牲它们-在一天的开始和中午/主观白天以及在夜的开始和中午/主观夜晚。然后正确固定大脑以进行透射电子显微镜 （TEM）。桶状皮层具有精确的体位组织，为此类分析提供了理想的模型。为了获得所需的大脑区域，用振动切开器切切大脑，然后选择包含桶皮层的切片并将其嵌入Polybed树脂中。从包含所选桶的准备好的块中，切割出连续的超薄部分。突触密度，兴奋性和抑制性，使用立体解剖法从电子显微照片中进行分析。此外，TEM 图像用于树突棘的 3D 重建。树突棘形状的变化表明白天神经元的重塑。小鼠兴奋性突触的数量在睡眠（白天）达到峰值，而抑制性突触在其活动阶段（半夜）达到峰值。

Introduction

昼夜节律是由生物体中几乎所有过程中的生物钟产生的。在动物和人类中，它们已在分子、细胞和整个生物体水平以及它们的行为中被检测到。生物体的昼夜节律系统由主要的昼夜节律时钟（起搏器）和外周时钟组成。所有生物钟都通过时钟基因的循环表达产生昼夜节律振荡，这些基因由其蛋白质控制。时钟的分子机制产生周期为~1天（长于或短于24小时）的昼夜节律，但在昼/夜条件下，内源性节律的周期与24小时同步。在无脊椎动物和脊椎动物的神经系统生理学中检测到了许多昼夜节律;然而，一些研究表明，它们也存在于突触和神经元可塑性中，即突触和树突数量和结构的变化 1,2,3,4。

小鼠体感皮层因其明确的组织和与动物运动活动的直接联系而为全天研究突触可塑性提供了一个极好的场所 5,6,7,8,9。在体感皮层的第四层，存在独特的神经结构（桶），即使在未染色的大脑中也非常明显^10,11。它们的排列反映了动物鼻子上胡须的形态和组织，从而可以精确映射感官刺激。大桶分为五排规则，每排包含四到七个桶。与大胡须相对应的一排排桶用A到E的大写字母标记，代表从眼部区域向下沿鼻子排列的胡须。每个桶由两个主要区域组成：中空区域，中央部分充满神经细胞，以及称为侧面的墙壁，以星状细胞的体为主。桶之间由细胞密度较低的区域（称为隔膜）彼此隔开。每个桶都接收来自位于动物鼻子对侧的特定胡须的脉冲^10,12。

划分为规则排排列的特定桶，可以快速轻松地识别所选区域^10,13。从B行中选择桶来分析昼夜节律变化是基于对活动依赖性可塑性的研究14,15,16,17。B 行的特点是体位边界明确，仅包含四个不同的大桶，简化了其在样品中的位置。由于其中心位置，B 行神经元活动与自然小鼠行为相关，例如环境探索和运动活动。为了计算树突棘和轴上的突触，重要的是要选择桶的中心部分，其中细胞体稀疏 12,15,18。

免疫组化结合共聚焦显微镜成像是一种在阐明小鼠突触可塑性关键机制方面发挥了至关重要作用的技术。虽然使用共聚焦显微镜可以提供高分辨率图像，减少背景荧光并提高细胞结构清晰度，但它存在光漂白问题，需要复杂的样品制备，这可能会改变生物组织的状态。它对荧光标记物的依赖会限制可以同时研究的蛋白质类型，因为它们重叠。共聚焦免疫荧光显微镜通过使用抗体检测固定组织切片中的靶抗原，提供了一种标记特定蛋白质、其表达水平和与突触活性相关的定位的方法。尽管该方法为研究参与神经传递的各种蛋白质提供了特异性和灵活性，但由于涉及固定步骤，它无法提供动态过程的实时数据。抗体结合的不一致也可能导致结果不可靠19,20,21。

使用电子显微镜代替免疫荧光方法和光学显微镜，可以在定位选择和神经结构区分方面实现显着更高的分辨率和更高的精度。连续透射电子显微镜 （TEM） 切片有助于在超微结构水平上可视化突触结构，并具有用于研究突触形成或消除的优点。TEM 使研究人员能够分析突触的物理特性以及密度和结构的变化，即称为突触的可塑性。尽管样品制备和成像是劳动密集型的，但 TEM 可以更详细地了解在学习、记忆形成和感觉信息处理过程中以及白天、年份和动物年龄期间发生的变化。

我们的方法旨在通过使用基于最小四个时间点的方法结合基于连续 TEM 图像的立体解剖方法来研究突触密度和形态的昼夜节律动力学。立体解剖法允许可靠地估计突触数，即使仅使用几个超薄序列切片 22,23,24,25,26。桶状皮层明确的体位组织确保了研究位置的精确解剖选择，而连续 TEM 允许区分突触类型（兴奋性和抑制性）及其位置（在树突棘和轴上）。该方法为研究人员研究昼夜和昼夜节律神经可塑性提供了宝贵的工具，能够探索环境和内部因素如何影响突触动力学。我们方法的各个组成部分使其能够在更广泛的研究中应用于分析神经可塑性变化，而不一定局限于昼夜节律相关的变化。

Protocol

所有涉及动物的实验程序均由适当的机构伦理委员会批准，并根据欧洲议会和理事会关于保护用于科学目的的动物的指令 2010/63/EU 以及国家法规进行。尽一切努力尽量减少动物的痛苦并减少使用的动物数量。

1. 脑组织的准备

1. 在24小时周期内，每6小时在四个不同的时间点处死小鼠，在明暗（LD 12：12）和恒暗（DD）条件下（图1）。在 LD 12：12 条件下，参考蔡特格伯时间 （ZT），其中 ZT0 对应于光相的开始，ZT12 对应于暗相的开始。在持续黑暗中，参考昼夜节律时间（CT），其中CT0代表主观一天的开始，CT12表示主观夜晚的开始。
   注意：时间点为 ZT0/CT0（一天的开始，主观的一天）、ZT6/CT6（中午，主观的白天）、ZT12/CT12（夜的开始，主观的夜晚）和 ZT18/CT18（半夜，主观的夜晚）。
2. 在0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中用2.5%戊二醛和2%多聚甲醛灌注并固定小鼠大脑。
3. 从头骨中取出每个大脑，并将其留在固定溶液（2.5%戊二醛和2%多聚甲醛在0.1M磷酸盐缓冲液中，pH 7.4）中，在4°C下24小时。
4. 为了准备大脑进行切片，切掉小脑并将大脑分成两个半球（图2A，B）。
5. 选择一个半球（右或左）并调整其方向，使这些部分与桶皮层相切切割。将选定的半球安装在振动刀卡盘上并紧紧粘合（图2C）。
6. 以60μm厚度切割切片（振动切片速度：7.10，频率：5.00）（图2D），然后将切片转移到0.1M磷酸盐缓冲液和固定溶液（1：5比例）的混合物中。
7. 在光学显微镜下以4倍放大倍率检查切片，并仅收集具有可见桶场皮层的切片以进行下一步（图2E）。使用凹形滑轨确保该部分始终保持在液体中。

2. 脑固定和切片

1. 使用画笔轻轻地将纸巾转移到一个小玻璃培养皿中。接下来，在0.1 M二甲胂酸缓冲液（BC，pH 7.4）中冲洗脑切片3 x 5分钟。
2. 在0.1 M BC中用1.5%铁氰化钾固定切片于1%四氧化锇（OsO4）中，并在+4°C下放置1小时。
   注意：使用前立即制备 OsO4 溶液，因为 OsO₄ 不稳定并且其活性会随着时间的推移而降低。
3. 在室温下将切片在0.1 M BC溶液中的1%OsO4中固定1小时。
   注意：在戴防护手套和通风橱下执行所有这些步骤，通风功能良好，因为 OsO4 毒性很大。
   废物应保存在一个单独的瓶子中，并盖紧盖子。请 勿让产品进入排水管。
4. 固定后，用蒸馏水冲洗切片2 x 5分钟。
5. 在下一步中，将脑切片在含有1%醋酸铀酰的70%乙醇溶液中孵育40分钟。混合后，使用带有过滤器（25 mm）的注射器，将 2 mL 溶液缓慢倒入装有组织的每个培养皿中。
6. 在酒精浓度递增下脱水组织：70%、80%和90%乙醇各5分钟，100%乙醇各3 x 5分钟。
   注意：可以在+4°C下将组织留在70%乙醇中过夜。
7. 在环氧丙烷中洗涤纸巾 2 x 10 分钟。
   注意：环氧丙烷是一种高腐蚀性化学品;戴防护手套并在通风柜下工作时请谨慎使用。使用玻璃容器（玻璃培养皿）对于这一步至关重要。
   环氧丙烷是一种极易燃的液体和蒸气。废物必须保存在单独的密闭玻璃容器中。请 勿让产品进入排水管;有爆炸危险。
8. 用聚床树脂和环氧丙烷的混合物（1：1 比例）代替环氧丙烷。将至少 2 mL 溶液倒入每个培养皿中，盖上盖子，孵育 40 分钟。
9. 最后，将脑切片嵌入聚床树脂和环氧丙烷的混合物中（比例为3：1）。每个培养皿至少使用2mL混合物，盖上盖子并放置1.5小时。
   注意：确保组织完全浸入水中，并确保它们没有漂浮在液体上方。
10. 将 Aclar 胶片切割成与载玻片尺寸相匹配的碎片。使用塑料移液器，将少量树脂涂在 Aclar 薄膜上，然后用画笔将大脑切片从培养皿转移到树脂上。将每个部分嵌入两个 Aclar 薄膜之间，并在 65°C 烘箱中孵育 48 小时以聚合。

3. 桶状皮层成像和切片

1. 用光学显微镜以2倍物镜放大倍率拍摄大脑切片（图2F）。
2. 收集所有图像并将它们导入图形软件。
   1. 要打开图像，请单击 文件 |打开并使用 Shift |打开。图像将在单独的窗口中打开。
   2. 从皮层（最小的部分）开始堆叠图像，然后继续，直到所有部分都正确对齐。
   3. 右键单击 Layer 1 | 在每张图像上复制图层。在对话框中，输入图像编号作为名称，选择一张图像作为目标文件，然后单击 确定。对所有图像重复这些步骤，将它们复制到同一个目标文件中。
   4. 对齐图像以重建桶场，确保正确的解剖顺序。使用移动工具手动定位每个图层，然后单击编辑 |变换 |旋转或翻转工具可根据需要调整方向。要微调对齐方式，请使用“编辑”|变换 |扭曲和移动图像的角以独立匹配解剖结构。为了使对齐更容易，请在“图层”面板中将顶层的混合模式设置为“叠加”。
   5. 比较桶形轮廓和血管等解剖标志，以确保正确定位。要保存堆栈，请单击 文件 |另存为，为文件命名，然后选择其格式（PSD 或 TIFF）;然后，单击 确定。
3. 按顺序查看包含桶字段的多个部分，识别每个部分中的可见桶。
4. 在额外的公共层上手动勾勒出每个可见的桶的轮廓，确保重建整个桶场。要创建额外的图层，请单击 图层 |新 |图层，为图层命名，然后单击 确定。从工具栏中选择 画笔 工具，然后在新图层上手动绘制每个可见的桶。
   1. 为了获得更高的精度，请使用 缩放 并根据需要调整画笔大小。要放大和缩小图像，请使用 缩放 工具或按 Ctrl + “+” / Ctrl + “-”。要更改画笔大小，请在 画笔 工具处于活动状态时右键单击画布，然后移动 大小滑 块。
5. 根据此重建确定所选枪管。
6. 根据桶场的图案（五排，每排有四到七个桶）和指示其在桶场内位置的血管排列，在光学显微镜下找到所选的桶。
7. 在具有可见桶皮层的每个部分中，在体视显微镜下识别所选桶，并使用剃须刀片将其与相邻的桶一起切出。
8. 从该部分取下小块，将其粘在树脂块上，然后收起来晾干。然后，修剪组织周围多余的树脂。
   注意：确保将纸巾平放在树脂表面。
9. 使用超切片机和金刚石刀切割超薄连续切片（3-6 个切片，65 nm 厚）（图 3A），并收集在 formvar 涂层的单槽镍网格（2 x 0.75 mm）上。
10. 干燥后，用 2% 乙酸铀酰和 0.03% 柠檬酸铅对比样品 3 分钟和 0.03% 柠檬酸铅 1.5 分钟。
    注意：相比之下，重要的是清洗网格几次，并在每一步后让它们完全干燥。使用带有醋酸铀酰和柠檬酸铅过滤器的注射器。
11. 在 TEM（80K 或 8K 放大倍率下的 80 kV 加速电压，取决于分析所需的面积和体积）下，从所选桶的空心（例如 B2）拍摄连续图像。
    注意：通常，分析每只动物至少100μm³ 的总体积。

4. 图像分析

注意：可以使用免费软件（如 GIMP）和商业软件（例如 Photoshop）以相同的方式创建和对齐 TEM 图像堆栈。使用商业软件（例如 3D Studio Max）和完全免费的程序（例如 Blender）也可以以相同的方式执行重建。

1. 要估计突触的密度，请在图形软件中堆叠至少三个TEM图像（图6）。串行图像的数量越多，计算的准确性就越高。
   1. 要打开图像，请单击 文件 |打开并使用 Shift |打开;图像将在单独的窗口中打开。
   2. 对于每个图像，右键单击 Layer 1 |复制图层。在对话框中，输入图像编号作为名称，选择一张图像作为目标 ，然后单击确定。对所有图像重复相同的步骤，并将它们复制到同一目标位置。
   3. 要保存堆栈，请单击 文件 |另存为，命名文件，选择其格式（PSD 或 TIFF），然后单击 确定。
2. 要对齐 TEM 图像，请选择顶部图像层，然后在“层”面板中将混合模式设置为“叠加”。使用编辑 |变换 |旋转或翻转工具调整图像方向。使用移动工具对齐结构。
   1. 要进行更精确的调整，请使用 “编辑”|变换 |扭曲以独立 移动图像的角。要提高精度，请按住 Ctrl 并拖动各个角点。在连续的 TEM 图像之间使用线粒体和轴突髓鞘大小和形状的变化来验证图像的正确序列。
3. 使用解剖法对突触进行计数。
   1. 通过单击 图层 |新 |图层 |好的。确保新图层是透明的（没有背景填充）。
   2. 要定义分析区域，请单击 图层 |新 |图层 |好的;然后选择 矩形 工具，转到 图层 |图层样式 |描边，设置描边颜色、粗细（大小）和位置（推荐内侧），单击 确定，绘制一个矩形。选择填充：0%。标记TEM图像中存在的所有突触，这些突触不穿过矩形的两个相邻选定边缘（例如，右侧和底部或顶部和左侧）。
   3. 通过单击 图层 |新 |图层 |好的。使用 画笔 工具在新图层上标记突触。使用 缩放 工具和 手动 工具进行精确标记。
   4. 选择一种颜色来标记兴奋性突触，选择另一种颜色来标记抑制性突触。要更改颜色，请单击工具栏中的前景色框，在 “颜色选择器” 窗口中选择一种颜色，然后单击 “确定”。
4. 如果 TEM 图像包含大型结构（例如，有髓神经纤维、大树突或细胞体的一部分），请使用具有多个正方形的网格。这允许排除任何完全被大型结构占据的方块。
   1. 通过单击 图层 |新 |图层 |好的。通过单击“查看”启用 网格视图 |展会 |网格，并通过单击“ 视图”|对齐到 |网格。
   2. 通过单击编辑 |首选项 |参考线、网格和切片。选择 线 条工具，将 模式 设置为 形状 或 像素，设置线宽（例如，1 像素），然后沿可见网格绘制垂直线和水平线以覆盖整个图像区域。
5. 定义每个图像堆栈的“顶部”和“底部”部分。仅计算上一张图像中不存在但存在于前一张图像中的突触。这样可以准确识别突触，而不会高估其数量。
6. 使用图像上的刻度并计算样品的体积（TEM 图像堆栈）。测量计数突触的面积，并乘以堆栈中TEM图像的数量和超薄切片的厚度。
7. 将突触数除以体积，以确定每单位体积的突触密度。
8. 使用所有包含树突棘的 TEM 图像（通常为 10-12 张连续的电子显微照片）来重建树突棘及其形成的突触。
   1. 在图形软件中打开图像堆栈。选择裁剪工具，标记堆栈中包含树突棘的区域，然后按 Enter。所选区域将在所有可见图层中被裁剪。一次仅显示一个图层，使用图层面板中的眼睛图标隐藏其他图层。
   2. 通过单击“文件”单独保存每个裁剪后的图像 |另存为，为文件命名，选择格式（推荐 JPG），然后单击 确定。对堆栈中的每个图层重复此作。
      注意：在将图像传输到 3D 重建软件之前，最好先用颜色标记正在重建的元素。
   3. 通过单击图层 |新 |图层 |好的。
   4. 在图层面板中将图层不透明度设置为 30-50%。
   5. 选择 画笔 工具，为每个结构（例如树突棘、突触）选择不同的颜色，并标记元素。仅在新图层上工作以保留原始图像。完成后，将注释图层与图像合并，右键单击顶层，然后合并向下。对每个包含树突棘横截面的TEM图像重复这些步骤。
9. 将具有树突棘可见横截面的 TEM 图像传输到 3D 重建软件。要删除默认的 Cube 对象，请右键单击该对象，然后删除。要在上传图像之前对齐视口透视，请单击导航小工具上的 Z 或按 数字键盘7。要上传图片，请点击 添加 |图片 |参考，选择第一张图片，双击确认。对每个图像重复此作，确保视口透视始终保持一致。
   注意：要旋转视图，请按住鼠标中键，然后移动鼠标或使用导航小工具。要平移视图，请按住 Shift + 鼠标中键，移动鼠标或使用 移动视图。
10. 将TEM图像排列在适当的距离，同时考虑到超薄切片的厚度（图4A）。要沿Z轴定位最后一个TEM图像，请单击图像，单击 对象属性 （右侧边栏），然后在位置Z中输入值。图像现在可以分布在第一张和最后一张图像之间。要分发它们，请选择所有图像，按 N 打开 N 面板，然后单击 编辑 选项卡（在 N 面板中） |Z 区。
    注意：在进行任何调整之前，请对齐视口透视，然后单击导航小工具上的 Z 或按 数字键盘 7。
    必须启用 分发 工具才能分发图像。要激活它，请转到 编辑 |首选项 |获取扩展，搜索 “分发”，然后单击 安装。启用后，分发工具在会话中保持活动状态，只要使用相同版本的程序，就不需要重新激活。
11. 使用每张 TEM 图像的单条曲线手动勾勒出每张图像上树突棘的形状（图 4B，C）。
    1. 确保只有第一个 TEM 图像可见。在 场景集合中，使用 眼睛 图标隐藏所有其他对象。要为轮廓创建基础曲线，请单击 “添加”|曲线 |圆圈。移动 BézierCircle 对象，按住 G，移动鼠标，然后单击以 接受 更改。
    2. 要匹配树突棘轮廓的大小，请缩放对象，按住 S，移动鼠标，然后单击。进入 “建模” 选项卡，并选择 BezierCircle 对象。再次对齐视口透视，然后单击导航小工具上的 Z（Z ） 或按 数字键盘 7。
    3. 要调整曲线的形状，请选择一个控制点，按住 G，移动鼠标，然后单击。
    4. 要调整手柄的方向和强度，请选择一个手柄点，按 G 移动或按 S 缩放，然后单击确认。对每个点重复此作。
    5. 要添加新控制点，请选择两个现有控制点，按住 Shift 键并单击每个点，右键单击，选择 细分。当曲线与树突棘轮廓的边界足够对应时，进入 布局 选项卡，右键单击 BezierCircle 对象 和 复制对象，单击而不移动鼠标。创建与用于重建的 TEM 图像相同数量的 BézierCircle 副本。使用“ 分布” 工具将它们与排列的 TEM 图像对齐，如步骤 4.10 所示。
    6. 调整 建模选项卡中的 每条 BezierCircle 曲线，以匹配每个图像中的树突棘轮廓。确保一次只有当前编辑的 BézierCircle 对象和相应的 TEM 图像可见。
       注意：某些步骤所需的所有右键单击作都必须在场景边界内执行。连续的曲线必须对应于连续树突棘切片的边界，并包含相同数量的控制点。
12. 使用 3D 重建功能连接相邻线以形成连续表面并创建最终的 3D 形状（图 4D）。
    1. 确保只有 BézierCircle 对象可见。在 场景集合中，使用侧边栏中的 眼睛 图标隐藏所有其他对象。
    2. 要创建树突棘对象，请转到 布局选项卡 ，选择所有 BezierCircle 对象，单击鼠标右键，然后单击连接。通过右键单击并选择 转换为 |网格。
    3. 要连接连接对象的边缘，请进入 建模 选项卡，按 2 进入 边缘选择模式 |选择 |全部 |右键点击 |桥边环。
    4. 要填充对象顶部的间隙，请通过单击对象旁边取消选择所有，按住 Alt 并单击顶部壁架的一个边缘部分，右键单击，选择 挤出边缘，在 Z 轴上向上拖动，按 S 并移动鼠标以收缩新的边缘循环，单击以接受更改。当新循环边仍处于选中状态时，单击鼠标右键并选择“ 从边新建面”（New Face from Edges）。使用相同的方法填充底部间隙。
    5. 要平滑对象，请进入 “布局” 选项卡，单击鼠标右键，然后选择“ 平滑着色”。要进一步平滑形状，请转到 修饰符 （右侧边栏） |添加修饰符 |生成 |细分曲面。将 视口（Viewport ） 和 渲染（Render） 级别设置为相同的值（建议为 1）。
13. 重复步骤4.11-4.12以重建突触（图4E，F）。
14. 为每个结构分配一种颜色，并使用渲染功能准备最终图像（图4G，H）。转到 视口着色（Viewport Shading） 菜单，然后选择 渲染（Rendered） 以预览材质更改。选择要着色的对象，然后单击材质（右侧边栏）|新增 |adjust 基色。
    1. 要优化材质外观，请根据需要调整 粗糙度（Roughness ） 或 金属色（Metallic ） 滑块。使用此方法为每个结构分配不同的颜色。
    2. 要调整场景照明，请单击光源对象，按住 G，然后移动鼠标以重新定位它。要更改光强度，请转到 数据 （右侧边栏）并调整 功率 值。
    3. 要定位摄像机，请将视口定向到重建的脊柱，因为它应该出现在最终图像中，按 Ctrl + Alt + Numpad 0。选择可见的摄像机框架，按住 G，然后根据需要移动鼠标以重新定位它。
    4. 要准备渲染，请转到 输出（ 右侧边栏），更改 分辨率 X 和 Y 值以匹配所需的图像。要提高图像质量，请转到 渲染 （右侧边栏） |渲染，将 Samples 值调整为 120 到 250 之间。对于透明背景，请转到 渲染 |电影 |选中 透明。要渲染图像，请按 F12 或转到 渲染 （上方菜单） |渲染图像。

Results

为了正确地将我们的方法应用于昼夜节律突触变化的分析，有必要首先以相等的间隔选择至少四个时间点，动物活动的每个阶段（每 6 小时）有两个时间点。在这些指定的时间点，动物被牺牲，它们的大脑被收集。这种方法可以识别突触可塑性的日常或昼夜节律模式，并将其与动物运动活动的变化联系起来（图1）。仅使用两个时间点可以分析活动阶段之间突触密度的差异，但可能无法准确反映突触变化的真实模式。检测昼夜节律效应的功效分析表明，每个时间点五只动物的群体规模足以达到超过 0.9 的统计功效。该样本量被认为是平衡统计稳健性与动物使用的伦理考虑的最佳选择。

小鼠体感皮层的结构允许精确和可重复地选择研究位置，即使在未染色的大脑中也是可见的（图5A）。此外，我们的方法能够使用图形软件重建整个枪管区域，即使单个枪管行分布在连续的部分中，因此很难通过检查单个部分来明确识别所选枪管 （图5B）。<...

Discussion

在这里，我们介绍了用于研究突触昼夜节律可塑性和小鼠桶状皮层树突棘重建的方法。为确保结果可靠，昼夜节律可塑性研究应包括至少四个时间点。我们的研究表明，来自两个时间点的数据——一个在休息阶段（白天），一个在活动阶段（夜间）——提供了有关 LD 12：12 条件下动物活动阶段之间每日差异的信息。与活动（运动活动）阶段相比，休息阶段（睡眠）的总突触密度（兴奋性和抑制性）高出 21%。此外，与活动阶段相比，休息阶段兴奋性突触的数量增加了约 40%，而抑制性突触在活动阶段的丰度增加了²⁶% 5。

将分析扩展到四个时间点，能够识别突触可塑性的每日模式。突触总密度在白天开始后逐渐降低，在ZT18达到最低水平，对应于半夜。兴奋性突触也观察到类似的趋势，下降更为明显。相比之下，抑制性突触表现出相反的模式，从 ZT0 逐渐增加到 ZT18⁶。

分析不同光照条件下的突触变化（LD 12：1...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aclar 薄膜	琼脂科学	AGL4458
搅拌机软件			版本： v. 2.91.2
二甲肟酸、三水钠盐	理科	01131-100
凹滑轨	门泽尔	9.161 151
金刚石刀	硅藻	15-美国	刀角：超45度;
数码相机	尼康	DXM 1200 华氏度
磷酸氢二钠十二水合物	波奇	799280115
嵌入树脂	理科	08792-1	Luft配方
乙醇	波尔光环	PA-11-0004
GIMP 软件			版本： v 3.0.4
柠檬酸铅	塔布	L018
光学显微镜	尼康	奥普蒂福特
四氧化锇	理科	0223C-10型	结晶 （99.95%）
画笔
Photoshop软件			版本：CS5
铁氰化钾	西格玛德里奇	第 8131 页
环氧丙烷	西格玛德里奇	82320	puriss。p.a.， ≥99.5% （GC）
单槽网格	琼脂科学	AGG2525	2 x 0.75 毫米或 2 x 1 毫米
氯化钠	Chempur	117941206
磷酸二氢钠二水合物	Chempur	117991808
体视显微镜	PZO的
注射器过滤器	Biosens 生物	BS25PES045
TEM	乔尔	JEM-2100型
超切片机	徕卡	UC7
醋酸铀酰	拉切马
振动切片机	徕卡	VT1000 小号