需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

透射电子显微镜作为小鼠桶状皮层昼夜节律性突触可塑性分析的可视化技术

1.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/68385

⸱

2025年8月19日

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了使用透射电子显微镜（TEM）定量分析小鼠桶状皮层中昼夜节律变化的方法，主要关注突触数量和树突棘形态的变化。

摘要

研究昼夜突触可塑性需要将小鼠饲养在不同的光照条件下（12小时光照/12小时黑暗循环，LD 12:12，以及持续黑暗，DD），提供跑轮供其活动，并在24小时内四个明确的时间点处死小鼠——分别在白天/主观白天的起始和中期，以及夜晚/主观夜晚的起始和中期。随后对脑组织进行适当固定，用于透射电子显微镜（TEM）观察。桶状皮层因其精确的躯体定位结构，是此类分析的理想模型。为获取所需脑区，使用振动切片机对脑组织进行水平切片，然后挑选包含桶状皮层的切片并将其包埋于Polybed树脂中。从含有目标桶状结构的包埋块中连续切取超薄切片。利用体视学剖分法（stereological dissector method）对电子显微照片中的兴奋性和抑制性突触密度进行分析。此外，TEM图像还用于树突棘的三维重建。树突棘形态的变化表明神经元在一天中发生重塑。在小鼠中，兴奋性突触的数量在睡眠期（白天）达到峰值，而抑制性突触则在其活跃期（夜间中期）达到高峰。

引言

昼夜节律由生物体内几乎所有生理过程中的生物钟产生。在动物和人类中，昼夜节律已在分子、细胞以及整个生物体水平上被检测到，并体现在其行为中。生物体的昼夜系统由主生物钟（起搏器）和外周生物钟组成。所有生物钟均通过钟控基因的周期性表达产生昼夜振荡，而这些基因的表达又受到其编码蛋白的调控。生物钟的分子机制所产生的节律周期约为1天（可能长于或短于24小时），但在昼夜交替的条件下，内源性节律的周期会被同步为24小时。在无脊椎动物和脊椎动物神经系统的生理过程中已发现多种昼夜节律；然而，一些研究表明，昼夜节律也存在于突触可塑性和神经元可塑性中，即突触和树突的数量与结构的变化1,2,3,4。

小鼠体感皮层因其结构清晰且与动物运动活动直接相关，是全天研究突触可塑性的理想部位5,6,7,8,9。在体感皮层的第四层中，存在明显的神经结构（桶状结构），即使在未染色的大脑中也清晰可见10,11。这些结构的排列方式反映了动物鼻部触须的形态和组织方式，从而能够精确映射感觉刺激。较大的桶状结构排列成五条规则的纵行，每行包含四到七个桶状结构。对应于大触须的桶状结构行用大写字母A至E标记，代表从眼部区域沿鼻部向下排列的触须。每个桶状结构由两个主要区域组成：空腔，即充满神经纤维网的中央部分；以及称为侧壁的外围部分，主要由星形细胞的胞体构成。桶状结构之间由细胞密度较低的区域（称为隔膜）分隔。每个桶状结构接收来自动物鼻部对侧特定触须的冲动输入10,12。

特定桶状结构按规则排列成行，这种分区方式便于快速、准确地识别所选区域10,13。选择B行桶状结构用于分析昼夜节律变化，是基于活动依赖性可塑性相关研究的依据14,15,16,17。B行具有清晰的躯体定位边界，且仅包含四个明显的大桶状结构，有利于在样本中准确定位。由于其位于中枢位置，B行神经元活动与小鼠的自然行为（如环境探索和运动活动）密切相关。在对树突棘和树突干上的突触进行计数时，应选择桶状结构的中央区域，因为该区域的细胞体较为稀疏12,15,18。

免疫组织化学结合共聚焦显微镜成像技术在阐明小鼠突触可塑性的关键机制方面发挥了重要作用。尽管共聚焦显微镜能够提供高分辨率图像，降低背景荧光并提高细胞结构的清晰度，但该技术存在光漂白问题，且需要复杂的样品制备过程，可能改变生物组织的状态。此外，其对荧光标记物的依赖性会因信号重叠而限制可同时研究的蛋白质种类。共聚焦免疫荧光显微镜通过使用抗体检测固定组织切片中的靶抗原，可实现对特定蛋白质、其表达水平及与突触活动相关定位的标记。虽然该方法在研究参与神经传递的多种蛋白质时具有特异性和灵活性，但由于涉及组织固定步骤，无法提供动态过程的实时数据。抗体结合的不一致性也可能导致结果不可靠19,20,21。

与使用光学显微镜的免疫荧光方法相比，电子显微镜能够显著提高分辨率，并在神经结构的定位选择和区分方面实现更高的精确度。连续透射电子显微镜（TEM）切片有助于在超微结构水平上可视化突触结构，并可用于研究突触的形成或消除。TEM使研究人员能够分析突触的物理特性以及突触密度和结构的变化，这些变化被称为突触可塑性。尽管样品制备和成像过程较为耗时费力，但TEM能够更详细地揭示学习、记忆形成以及感觉信息处理过程中，以及昼夜、年周期和动物年龄变化期间所发生的神经结构改变。

本方法旨在通过基于最少四个时间点的取样方案，结合连续透射电子显微镜（TEM）图像的体视学分隔器法，研究突触密度与形态的昼夜节律动态。体视学分隔器法即使仅使用少量超薄连续切片，也能对突触数量进行可靠估算22,23,24,25,26。桶状皮层明确的躯体定位组织结构可确保研究位点的精确解剖学选择，而连续TEM成像则可区分突触类型（兴奋性与抑制性）及其位置（树突棘与树突干上）。该方法为研究昼夜节律及生物钟相关神经可塑性的科研人员提供了有力工具，有助于探索环境因素与内在因素如何影响突触动态变化。本方法的各个组成部分亦可独立应用，适用于更广泛的研究中神经可塑性变化的分析，而不仅限于与昼夜节律相关的变化。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有涉及动物的实验程序均经相关机构伦理委员会批准，并依照欧洲议会和理事会关于保护用于科研目的动物的指令 2010/63/EU 以及国家法规进行。同时采取一切努力以最大程度减轻动物痛苦，并减少使用动物的数量。

1. 脑组织的制备

  1. 在光/暗循环（LD 12:12）和恒定黑暗（DD）条件下，于24小时周期内每隔6小时选择四个不同时间点处死小鼠（图1）。在LD 12:12条件下，使用授时因子时间（ZT）表示，其中ZT0对应光相开始，ZT12对应暗相开始；在恒定黑暗条件下，使用昼夜节律时间（CT）表示，其中CT0代表主观白天的开始，CT12代表主观夜晚的开始。
    注意：各时间点分别为ZT0/CT0（白天/主观白天起始）、ZT6/CT6（白天/主观白天中期）、ZT12/CT12（夜晚/主观夜晚起始）和ZT18/CT18（夜晚/主观夜晚中期）。
  2. 用含2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）灌注并固定小鼠脑组织。
  3. 将每只小鼠的脑组织从颅骨中取出，并置于固定液（含2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的0.1 M磷酸缓冲液，pH 7.4）中，在4 °C下保存24小时。
  4. 为准备切片，切除小脑，并将脑组织沿中线分为两个半球（图2A、B）。
  5. 选取其中一个半球（左或右），调整其方向，使切面与桶状皮层呈切线方向。将选定的半球固定在振动切片机的夹持器上，并牢固粘合（图2C）。
  6. 以60 µm厚度进行切片（振动切片机切速：7.10，频率：5.00）（图2D），随后将切片转移至0.1 M磷酸缓冲液与固定液的混合液（1:5比例）中。
  7. 在光学显微镜下以4倍物镜观察切片，仅收集可见桶状皮层区域的切片用于后续步骤（图2E）。使用凹面载玻片以确保切片始终浸没在液体中。

2. 脑组织固定与切片

  1. 使用画笔将组织轻轻转移至小型玻璃培养皿中。随后，用0.1 M卡考基缓冲液（BC，pH 7.4）冲洗脑切片，每次5分钟，共冲洗3次。
  2. 在含有1.5%铁氰化钾的0.1 M BC缓冲液中加入1%四氧化锇（OsO₄），对切片进行固定，4 °C孵育1小时。
    注意：由于四氧化锇（OsO₄）溶液需现配现用，4 不稳定，其活性随时间降低。
  3. 在室温下，用0.1 M BC溶液配制的1% OsO4对固定后的切片进行后固定，持续1小时。
    注意：操作过程中须佩戴防护手套，并在通风良好的通风橱内进行，因为四氧化锇（OsO₄）具有强毒性。
    废液应存放于带有紧密盖子的独立瓶子中。 请勿让产品进入下水道。
  4. 固定后，用蒸馏水冲洗切片，每次5分钟，共2次。
  5. 下一步，将脑切片在含有1%醋酸铀的70%乙醇溶液中孵育40分钟。混合后，使用带滤器（25 mm）的注射器，缓慢将2 mL溶液加入每个含有组织的培养皿中。
  6. 用递增浓度的酒精脱水组织：70%、80% 和 90% 乙醇各 5 分钟，100% 乙醇处理 3 次，每次 5 分钟。
    注意：组织可在 +4 °C 条件下于 70% 乙醇中保存过夜。
  7. 用丙烯酸甲酯清洗组织，每次10分钟，共2次。
    注意：环氧丙烷是一种强腐蚀性化学品，使用时需佩戴防护手套并在通风橱内操作。此步骤必须使用玻璃容器（玻璃培养皿）。
    环氧丙烷是一种极易燃的液体和蒸气。废弃物必须保存在单独的、密闭良好的玻璃容器中。 切勿让产品进入下水道，有爆炸风险。
  8. 用 Polybed 树脂与丙烯酸丙酯的混合液（1:1 比例）替代丙烯酸丙酯。将至少 2 mL 该溶液倒入含有切片的每个培养皿中，盖上皿盖，于 40 分钟内孵育。
  9. 最后，将脑组织切片浸入Polybed树脂与环氧丙烷的混合液（体积比3:1）中。每个培养皿使用至少2 mL混合液，加盖后室温孵育1.5小时。
    注意：确保组织完全浸入液体中，且不得漂浮于液面之上。
  10. 将Aclar膜裁剪成与载玻片大小相同的片状。使用塑料移液管将少量树脂滴加到Aclar膜上，然后用画笔将脑切片从培养皿转移至树脂表面。每张切片上下各覆盖一片Aclar膜，夹在中间进行包埋，随后置于65 °C烘箱中孵育48小时，以完成聚合。

3. 桶状皮层成像与切片

  1. 使用光学显微镜在2倍物镜放大倍数下拍摄脑切片照片（图2F）。
  2. 收集所有图像并导入图形处理软件。
    1. 点击文件 | 打开以打开图像，使用Shift | 打开选择多个图像。图像将在独立窗口中打开。
    2. 从皮层（最小的一片）开始堆叠图像，直至所有切片正确对齐。
    3. 在每张图像上右键点击图层 1 | 复制图层。在弹出的对话框中输入图像编号作为名称，选择一个图像作为目标文件，然后点击确定。对所有图像重复此步骤，将它们复制到同一个目标文件中。
    4. 对齐图像以重建桶状区，确保解剖结构顺序正确。使用移动工具手动调整每一图层的位置，必要时点击编辑 | 变换 | 旋转或翻转工具调整方向。为精细校准对齐，使用编辑 | 变换 | 扭曲，独立移动图像的角点以匹配解剖结构。为便于对齐，可在图层面板中将顶层的混合模式设置为叠加。
    5. 比较桶状轮廓和血管等解剖标志，以确保定位准确。保存堆叠图像时，点击文件 | 另存为，命名文件并选择格式（PSD 或 TIFF），然后点击确定。
  3. 依次检查包含桶状区的多个切片，识别每个切片中可见的桶状结构。
  4. 在新增的公共图层上手动勾画每个可见的桶状结构，确保完整重建整个桶状区。创建新图层时，点击图层 | 新建 | 图层，命名图层后点击确定。从工具栏中选择画笔工具，在新图层上手动绘制每个可见的桶状结构。
    1. 为提高精度，可使用缩放功能并根据需要调整画笔大小。使用缩放工具或按Ctrl + "+" / Ctrl + "-"来放大或缩小图像。当画笔工具处于激活状态时，右键点击画布并移动大小滑块以调整画笔尺寸。
  5. 根据上述重建结果确定所选桶状结构的位置。
  6. 根据桶状区的排列模式（五排，每排四至七个桶状结构）以及指示其位置的血管分布，在光学显微镜下找到所选的桶状结构。
  7. 在每个可见桶状皮层的切片中，使用体视显微镜识别所选桶状结构，并用剃刀片将其与相邻结构一同切下。
  8. 将小组织块从切片中取出，粘附于树脂块上并放置干燥。随后修整组织周围多余的树脂。
    注：务必确保组织块平整地贴附在树脂表面。
  9. 使用超薄切片机和钻石刀切割连续的超薄切片（3–6张，厚度65 nm）（图3A），并收集到涂有formvar的单槽镍网上（2 × 0.75 mm）。
  10. 待样品干燥后，用2%醋酸铀染色3分钟，再用0.03%柠檬酸铅染色1.5分钟。
    注：染色过程中，每一步后需多次清洗网格，并彻底干燥。 使用带滤器的注射器盛装醋酸铀和柠檬酸铅。
  11. 在透射电子显微镜（TEM）下，对所选桶状结构（例如B2）的腔隙区域连续拍摄图像（加速电压80 kV，放大倍数4K或8K，具体根据分析所需的面积和体积而定）。
    注：通常每只动物至少分析100 µm3的总体积。

4. 图像分析

注意：使用免费软件（如 GIMP）和商业软件（如 Photoshop）均可采用相同方法创建和对齐透射电子显微镜（TEM）图像序列。三维重建同样可以使用商业软件（如 3D Studio Max）或完全免费的程序（如 Blender）以相同方式进行。

  1. 为估算突触密度，使用图形软件叠加至少三张透射电子显微镜（TEM）图像（图6连续图像的数量越多，计算的准确性越高。
    1. 要打开图像，请单击 文件 | 打开，并使用以下方法选择图像 Shift | 开启；图像将在单独的窗口中打开。
    2. 对于每张图像，右键单击 第1层 | 复制图层在对话框中，输入图像编号作为名称，选择一幅图像作为目标，然后单击 好的对所有图像重复相同的步骤，并将其复制到同一目标位置。
    3. 要保存该图层，单击 文件 | 另存为，命名文件，选择其格式（PSD 或 TIFF），然后单击 好的.
  2. 为对齐透射电子显微镜图像，选择最上方的图像图层，并将混合模式设置为 覆盖 在 层 面板。使用 编辑 | 变换 | 旋转 或 翻转 用于调整图像方向的工具。使用 移动 用于结构比对的工具。
    1. 如需更精确的调整，请使用 编辑 | 变换 | 扭曲 独立移动图像的各个角点。为提高精度，按住 Ctrl 拖动各个角点，并利用连续透射电子显微镜图像中线粒体和轴突髓鞘的大小与形状变化，验证图像序列的正确性。
  3. 采用解剖法计数突触。
    1. 通过点击向电镜图像序列添加图层 图层 | 新建 | 图层 | 确定确保新图层为透明（无背景填充）。
    2. 要定义分析区域，请单击 图层 | 新建 | 图层 | 确定；然后选择 矩形 工具，前往 图层 | 图层样式 | 描边，设置描边颜色、粗细（大小）和位置（推荐内部），单击 好的，绘制一个矩形。选择填充：0%。标记所有存在于透射电镜图像中且未跨越该矩形两条相邻选定边（例如右侧和底侧，或顶部和左侧）的突触。
    3. 单击以添加用于注释的新图层 图层 | 新建 | 图层 | 确定. 使用 刷子 用于在新图层上标记突触的工具。使用该工具 缩放 工具和 手 精确标记工具
    4. 选择一种颜色标记兴奋性突触，另一种不同颜色标记抑制性突触。要更改颜色，请点击工具栏中的前景色框，在调色板中选择所需颜色 颜色选择器 窗口，然后单击 好的.
  4. 如果透射电镜图像中包含较大的结构（例如有髓神经纤维、大型树突或细胞体的部分），请使用具有多个方格的网格。这样可以排除完全被大型结构占据的方格。
    1. 单击以添加新的透明图层 图层 | 新建 | 图层 | 确定启用 网格视图 通过点击 查看 | 显示 | 网格，并通过点击启用对齐网格功能 查看 | 对齐到 | 网格.
    2. 通过点击设置网格间距 编辑 | 首选项 | 指南，网格 & 切片. 选择 线 工具，套件 模式 至 形状 或 像素，设置线宽（例如，1 px），并沿可见的网格绘制垂直和水平线条，覆盖整个图像区域。
  5. 定义 "顶部" 和 "底部" 对每个图像堆栈进行切片分析。仅计数在最后一张图像中缺失但在之前图像中存在的突触。这种方法可准确识别突触，避免对其数量的高估。
  6. 利用图像上的标尺计算样本（透射电镜图像序列）的体积。测量用于计数突触的区域面积，再乘以图像序列中透射电镜图像的数量以及超薄切片的厚度。
  7. 将突触数量除以体积，以确定单位体积内的突触密度。
  8. 利用所有包含树突棘的透射电镜图像（通常为10–12张连续的电子显微照片）来重建树突棘及其形成的突触结构。
    1. 在图形软件中打开图像堆栈。选择 作物 工具，标记图像序列中包含树突棘的区域，然后按压 输入所选区域将裁剪所有可见图层。每次仅保留一个图层可见，使用 眼睛 图标位于 层 面板
    2. 单击以分别保存每张裁剪后的图像 文件 | 另存为，命名文件，选择格式（推荐 JPG），然后单击 好的对堆叠中的每一层重复此步骤。
      注意：在将图像传输至3D重建软件之前，最好先用颜色标记出需要重建的结构。
    3. 通过点击添加注释的新图层 图层 | 新建 | 图层 | 确定.
    4. 设定 图层不透明度 至30-50% 层 面板
    5. 选择 刷子 工具，为每个结构（例如，树突棘、突触）选择不同的颜色，并标记相应元素。仅在新图层上操作，以保护原始图像。完成后，将注释图层与图像合并，右键点击最上方图层，选择“向下合并”。对每张包含树突棘横截面的透射电镜图像重复上述步骤。
  9. 将可见树突棘横截面的透射电镜图像导入3D重建软件。右键单击默认的立方体对象并删除，以将其移除。在上传图像前对齐视口视角时，单击导航控件上的Z轴或按下 数字键盘 7要上传图像，请单击 添加 | 图像 | 参考文献，选择第一张图像，双击以确认。对每张图像重复此操作，确保视口视角始终保持一致。1
    注意：要旋转视图，请按住鼠标中键并移动鼠标，或使用导航控件。要平移视图，请按住 Shift + 鼠标中键，移动鼠标，或使用 移动视图.
  10. 根据超薄切片的厚度，将透射电子显微镜图像排列在适当的距离处图 4A）。要沿 Z 轴定位最后一张透射电子显微镜（TEM）图像，请单击该图像，然后单击 物体属性 （右侧边栏），并在“位置Z”中输入数值。此时，图像可分布在第一张与最后一张图像之间。要实现分布，请先选中所有图像，然后按 N 打开 N-面板，然后单击 编辑 N 面板中的标签 距离 Z.
    注意：在进行任何调整之前，先对齐视口视角，并单击导航控件上的 Z 或按下 小键盘 7.
    这 分配 必须启用该工具才能分发图像。要激活它，请前往 编辑 | 首选项 | 获取扩展程序，搜索 "分配"，然后单击 安装启用后，只要使用相同版本的程序，分发工具将在各会话中保持激活状态，无需重新启用。
  11. 在每张透射电镜图像上，使用单条曲线手动勾勒树突棘的轮廓形状（图4B，C).
    1. 确保仅第一个透射电子显微镜图像可见。在 场景采集，使用以下方法隐藏所有其他对象 眼睛 图标。要为轮廓创建基线曲线，请单击 添加 | 曲线 | 圆形. 移动 BézierCircle 对象  保持 G，移动鼠标并单击以 接受 变化。
    2. 为了匹配树突棘轮廓的大小，缩放对象并按住 S，移动鼠标并单击。输入 建模 选择 BézierCircle 对象的选项卡。重新对齐视口视角，然后单击 Z 在导航控件上或按 数字键盘 7.
    3. 为调整曲线的形状，选择一个控制点，按住 G，移动鼠标并单击。
    4. 要调整控制柄的方向和强度，请选择一个控制点，然后按住 G 移动或 S 按比例缩放，然后单击以确认。对每个点重复此操作。
    5. 要添加新的控制点，请选择两个已有的控制点，按住 移位 并单击每个点，右键单击，选择 细分当曲线与树突棘轮廓的边界充分吻合时，输入 布局 标签，右键点击 贝塞尔圆对象 和 复制对象，单击鼠标但不移动。创建与用于重建的透射电子显微镜（TEM）图像数量相同的 BézierCircle 副本。使用 分配 工具操作同步骤 4.10。
    6. 调整每个 BézierCircle 曲线 建模 使用制表符在每张图像中匹配树突棘轮廓。确保每次仅显示当前正在编辑的 BézierCircle 对象及对应的透射电镜图像。
      注意：某些步骤所需的全部右键操作必须在场景边界内执行。连续的曲线必须对应于连续的树突棘截面的边界，并且包含相同数量的控制点。
  12. 使用3D重建功能连接相邻线条，形成连续表面，并创建最终的3D形状（图4D).
    1. 确保仅 BézierCircle 对象可见。在 场景采集，使用以下方法隐藏所有其他对象 眼睛 侧边栏中的图标。
    2. 要创建树突棘对象，请前往 布局 选项卡中，选择所有 BézierCircle 对象，右键单击，然后点击合并。通过右键单击并选择将合并后的对象转换为网格 转换为 |Mesh.
    3. 为了连接所合并对象的边缘，请输入 建模 标签，按下 2 进入 边选择模式 | 选择 | 全部 | 右键单击 | 桥接边循环.
    4. 为填补物体顶部的空隙，点击物体旁边取消所有选中状态，按住 替代 并单击顶部凸缘的一个边缘部分，右键单击，选择 挤出边，沿 Z 轴向上拖动，按 S 并移动鼠标以缩小新的边缘环，单击以确认更改。在新边缘环仍处于选中状态时，右键单击并选择 从边缘重构新面孔使用相同方法填充底部间隙。
    5. 为了使物体表面平滑，请输入 布局 标签，右键点击并选择 阴影平滑. 为进一步平滑形状，请前往 修饰因子 （右侧边栏） |添加修改器 |生成 |细分曲面. 设置两个 视口 和 渲染 将水平调整至相同值（推荐） 1).
  13. 重复步骤 4.11–4.12 以进行突触重建图4E，F).
  14. 为每个结构分配一种颜色，并使用渲染功能准备最终图像（图 4G，H）。前往 视口着色 菜单并选择 渲染完成 预览材质变化。选择要着色的对象并单击 材料 （右侧边栏） |新增 |调整基础颜色.
    1. 为了优化材料外观，调整 粗糙度 或 金属的 根据需要调整滑块。使用此方法为每个结构分配不同的颜色。
    2. 要调整场景照明，请单击光源对象，按住 G，移动鼠标以重新定位。要更改光照强度，请前往 数据 （右侧边栏）并调整 功率 值
    3. 为定位相机，调整视口方向使其正对重建后的脊柱（即最终图像中脊柱应有的朝向），然后按下 Ctrl + Alt + 小键盘 0选择可见的相机帧，按住 G 键并移动鼠标以必要时重新定位。
    4. 为准备渲染，请前往 输出 （右侧边栏），更改 分辨率 X 和 Y 值以匹配所需图像。为提高图像质量，请前往 渲染 （右侧边栏） 渲染，将样本值调整至120到250之间。若需透明背景，请前往 渲染 | 电影 |检查 透明要渲染图像，请按 F12 或前往 渲染 （上方菜单） 渲染图像.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

为了将本方法正确应用于昼夜节律性突触变化的分析，首先需要选择至少四个等间隔的时间点，每个活动阶段各包含两个时间点（每6小时一个）。在指定的时间点处死动物并采集其脑组织。该方法有助于识别突触可塑性的日节律或昼夜节律模式，并将其与动物运动活动的变化相关联（图1）。仅使用两个时间点虽可分析不同活动阶段间突触密度的差异，但可能无法准确反映突触变化的真实模式。用于检测昼夜节律效应的统计效能分析表明，每个时间点使用五只动物即可达到超过0.9的统计效能。该样本量在保证统计学稳健性的同时，也兼顾了动物使用的伦理考量，被视为最优选择。

小鼠体感皮层的结构使得研究位置的选择具有高度精确性和可重复性，即使在未染色的脑组织中也能清晰辨认图5A此外，我们的方法能够利用图形软件重建整个桶状皮层区，即使单个桶状列分布在连续切片上，仅通过观察单一切片难以明确识别所选的桶状结构 (图5B)...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文介绍了用于研究小鼠桶状皮层中突触的昼夜可塑性及树突棘重建的方法学。为确保结果可靠，昼夜可塑性研究应至少包含四个时间点。我们的研究表明，在LD 12:12条件下，分别于休息期（白天）和活动期（夜间）采集的两个时间点的数据，能够反映动物在每日不同活动阶段之间的差异。总的突触密度（包括兴奋性和抑制性突触）在休息期（睡眠期间）比活动期（运动活动期间）高出21%。此外，与活动期相比，休息期的兴奋性突触数量增加了约40%，而抑制性突触在活动期则更为丰富，高出26%5。

将分析扩展到四个时间点，能够识别出突触可塑性的日节律模式。总突触密度在一天开始后逐渐下降，在ZT18时达到最低水平，对应夜间中期。兴奋性突触也表现出类似趋势，且下降更为显著。相反，抑制性突触则呈现相反的模式，从ZT0到ZT18期间逐步增加6。

在不同光照条件下（LD 12:12 和 DD）分析突触变化也非常重要，因为比较这些结果可以推断出内在因素和光照对正在进行过程的影响。在...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本工作获得了波兰国家科学中心（NCN OPUS20，项目编号 UMO-2020/39/B/NZ7/03366，授予 EP）以及雅盖隆大学医学院（项目编号 N41/DBS/001129，授予 MJ）的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Aclar 薄膜Agar scientificAGL4458
Blender 软件 版本：v. 2.91.2
二甲胂酸钠三水合物Polysciences01131-100
凹面载玻片Menzel9.161 151
金刚石刀片 Diatome15-US刀片角度：Ultra 45° 
数码相机 Nikon DXM 1200 F
十二水合磷酸氢二钠POCH799280115
包埋树脂Polysciences08792-1Luft 配方 
乙醇Pol-AuraPA-11-0004
GIMP 软件版本：v 3.0.4
柠檬酸铅TAABL018
光学显微镜 Nikon Optiphot
四氧化锇 Polysciences0223C-10晶体状（99.95%）
画笔
Photoshop 软件版本：CS5
铁氰化钾SigmaaldrichP8131
环氧丙烷 Sigmaaldrich82320特纯 p.a.，≥99.5%（GC）
单槽载网Agar scientificAGG25252 × 0.75 mm 或 2 × 1 mm
氯化钠 Chempur117941206
二水合磷酸二氢钠Chempur117991808
体视显微镜pzo
注射器滤器 BiosensBS25PES045
透射电子显微镜 JoelJEM-2100
超薄切片机LeicaUC7
醋酸铀酰Lachema
振动切片机LeicaVT1000 S

参考文献

  1. Jasinska, M., Pyza, E. Circadian plasticity of mammalian inhibitory interneurons. Neural Plast. 2017, 1-12 (2017).
  2. Krzeptowski, W., Hess, G., Pyza, E. Circadian plasticity in the brain of insects and rodents. Front Neural Circuits. 12, 32(2018).
  3. Mansilla, A., et al. Molecular mechanisms that change synapse number. J Neurogenet. 32 (3), 155-170 (2018).
  4. Frank, M. G. Renormalizing synapses in sleep: the clock is ticking. Biochem Pharmacol. 191, 114533(2021).
  5. Jasinska, M., et al. Daily rhythm of synapse turnover in mouse somatosensory cortex. Acta Neurobiol Exp. 74 (1), 104-110 (2014).
  6. Jasinska, M., et al. Circadian rhythmicity of synapses in mouse somatosensory cortex. Eur J Neurosci. 42 (8), 2585-2594 (2015).
  7. Jasinska, M., et al. Circadian clock regulates the shape and content of dendritic spines in mouse barrel cortex. PLOS ONE. 14 (11), e0225394(2019).
  8. Jasinska, M., et al. Circadian changes of dendritic spine geometry in mouse barrel cortex. Front Neurosci. 14, 578881(2020).
  9. Jasinska, M., et al. Light-modulated circadian synaptic plasticity in the somatosensory cortex: link to locomotor activity. Int J Mol Sci. 25 (23), 12870(2024).
  10. Woolsey, T. A., Vander Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
  11. Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the Sml-face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
  12. Armstrong-James, M., Fox, K. Spatiotemporal convergence and divergence in the rat SI barrel cortex. J Comp Neurol. 263 (2), 265-281 (1987).
  13. Barrel cortex. Fox, K. , Cambridge University Press. (2008).
  14. Jasinska, M., et al. Rapid, learning-induced inhibitory synaptogenesis in murine barrel field. J Neurosci. 30 (3), 1176-1184 (2010).
  15. Knott, G. W., Quairiaux, C., Genoud, C., Welker, E. Formation of dendritic spines with GABAergic synapses induced by whisker stimulation in adult mice. Neuron. 34 (2), 265-273 (2002).
  16. Jasinska, M., et al. Effect of associative learning on memory spine formation in mouse barrel cortex. Neural Plast. 2016, 1-11 (2015).
  17. Jasinska, M., et al. Fear learning increases the number of polyribosomes associated with excitatory and inhibitory synapses in the barrel cortex. PLOS ONE. 8 (2), e54301(2013).
  18. White, E. L. Ultrastructure and synaptic contacts in barrels of mouse SI cortex. Brain Res. 105 (2), 229-251 (1976).
  19. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing whole-brain activity and development at the single-cell level using light-sheet microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
  20. Serrano, M. E., Kim, E., Petrinovic, M. M., Turkheimer, F., Cash, D. Imaging synaptic density: the next holy grail of neuroscience. Front Neurosci. 16, 796129(2022).
  21. Woelfle, S., et al. CLARITY increases sensitivity and specificity of fluorescence immunostaining in long-term archived human brain tissue. BMC Biol. 21 (1), 113(2023).
  22. Weibel, E. R. Stereological methods. Vol. 1: practical methods for biological morphometry. , Academic Press. London. (1979).
  23. Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134 (2), 127-136 (1984).
  24. Gundersen, H. J. G. Stereology of arbitrary particles. J Microsc. 143 (1), 3-45 (1986).
  25. Fiala, J. C., Harris, K. M. Cylindrical diameters method for calibrating section thickness in serial electron microscopy. J Microsc. 202 (3), 468-472 (2001).
  26. Napper, R. M. A. Total number is important: using the disector method in design-based stereology to understand the structure of the rodent brain. Front Neuroanat. 12, 16(2018).
  27. Perez-Cruz, C., Simon, M., Czéh, B., Flügge, G., Fuchs, E. Hemispheric differences in basilar dendrites and spines of pyramidal neurons in the rat prelimbic cortex: activity- and stress-induced changes. Eur J Neurosci. 29 (4), 738-747 (2009).
  28. Kasthuri, N., et al. Saturated reconstruction of a volume of neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
  29. Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nat Methods. 9 (12), 1198-1201 (2012).
  30. Videnovic, A., Zee, P. C. Consequences of circadian disruption on neurologic health. Sleep Med Clin. 10 (4), 469-480 (2015).
  31. Logan, R. W., McClung, C. A. Rhythms of life: circadian disruption and brain disorders across the lifespan. Nat Rev Neurosci. 20 (1), 49-65 (2018).
  32. Nassan, M., Videnovic, A. Circadian rhythms in neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurol. 18 (1), 7-24 (2021).
  33. Shen, Y., et al. Circadian disruption and sleep disorders in neurodegeneration. Transl Neurodegener. 12 (1), 8(2023).
  34. Dufort-Gervais, J., Mongrain, V., Brouillette, J. Bidirectional relationships between sleep and amyloid-beta in the hippocampus. Neurobiol Learn Mem. 160, 108-117 (2019).
  35. Adler, P., et al. Aging disrupts the circadian patterns of protein expression in the murine hippocampus. Front Aging Neurosci. 11, 368(2020).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

小鼠脑突触密度树突棘重建兴奋性突触抑制性突触体视学分隔器法切向脑切片
透射电子显微镜作为小鼠桶状皮层昼夜节律性突触可塑性分析的可视化技术
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。