我们提出了一种优化的体外（in vitro）方案，用于制备高度模拟真实病毒的SARS-CoV-2病毒样颗粒。该方法可在无需生物安全三级实验室的条件下，研究病毒感染、组装及释放机制。
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方法文章
生产一种SARS-CoV-2病毒样颗粒系统以在体外研究病毒生命周期 In Vitro
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）病毒样颗粒（SC2-VLP）方法提供了一种强大且易于获取的工具，可用于研究SARS-CoV-2的生命周期，而无需使用生物安全三级（BSL-3）实验室。该系统通过将荧光素酶报告基因与T20信号融合，能够灵敏且精确地检测病毒颗粒的产生，有效模拟病毒生命周期中的关键阶段，包括组装、基因组包装和释放。SC2-VLP通过在HEK-293T细胞中共同表达SARS-CoV-2的结构蛋白（包括膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）、包膜蛋白（E）和刺突蛋白（S））以及RNA包装信号来生成。与传统的病毒样颗粒系统相比，SC2-VLP方法可实现更准确的定量，并更真实地还原天然病毒的生命周期。此外，相较于仅能通过将S蛋白整合到基于HIV的慢病毒颗粒中来研究病毒进入过程的慢病毒假型化方法，SC2-VLP系统为探索SARS-CoV-2生物学的多个阶段提供了更全面的研究平台。该方法避免了操作活病毒的风险，同时提高了研究的可及性。SC2-VLP方法代表了抗病毒研究及针对SARS-CoV-2治疗策略开发领域的重要进展。
引言
新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情已成为现代历史上最具破坏性的全球公共卫生危机之一，已导致全球数百万人死亡1。引发该疾病的病毒SARS-CoV-2具有复杂的生命周期，包括感染、基因组复制、组装和释放等关键阶段2,3。感染过程始于病毒刺突蛋白（S）与宿主细胞受体血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，从而促进病毒基因组进入宿主细胞。随后，病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）催化基因组RNA的复制。该RNA与核衣壳蛋白（N）形成复合物，构成稳定的结构，并被膜蛋白（M）识别。M蛋白在病毒组装过程中发挥核心作用，可招募RNA-N复合物、S蛋白以及包膜蛋白（E）4,5。组装完成后，病毒颗粒通过一种非经典的溶酶体介导的运输途径完成释放6。
为应对大流行，全球已投入大量资源用于开发疫苗、中和抗体和抗病毒药物。对这些干预措施的评估对于推进SARS-CoV-2研究至关重要7。然而，研究活病毒面临显著的后勤挑战，因为涉及该病毒的实验必须在生物安全三级（BSL-3）实验室中进行。BSL-3设施的有限可及性制约了旨在理解....
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方案
1. SC2-VLP 的生成
- 在直径10 cm的组织培养皿中接种约3.0 × 106个HEK-293T细胞，使用添加了10% v/v胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM完全培养基。
注意：为确保高转染效率和最佳的SC2-VLP生产效果，HEK-293T细胞应保持较低的传代次数，约为10代左右。 - 将HEK-293T细胞在37 °C、5% CO2条件下培养约24小时，在显微镜下检查细胞融合度。当细胞融合度达到约70%时，进行下一步操作。
- 将60 µL浓度为1 mg/mL的PEI用无血清培养基稀释至200 µL。
- 将6.7 µg N质粒、10 µg Luc-T20质粒、0.016 µg S质粒以及3.3 µg M-IRES-E质粒加入200 µL无血清培养基中（参见补充文件1）。
- 轻轻将步骤1.3中稀释的PEI加入步骤1.4中含病毒结构蛋白编码质粒的溶液中，室温孵育10分钟。此即为转染溶液。
- 将步骤1.5中的转染溶液小心滴加到HEK-293T细胞中，并轻轻晃动组织培养皿以充分混匀。
- 感染后6小时更换为DMEM完全培养基，将转染后的HEK-293T细胞在37 °C、5% CO2条件下继续培养48小时。
- 收集感染后的HEK....
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结果
与感染和复制阶段相比，SARS-CoV-2 生命周期中的出胞和组装阶段研究较少17,18。在 SC2-VLP 方法建立之前，这些过程只能通过使用活体 SARS-CoV-2 进行研究，因而限制了研究必须在 BSL-3 实验室中进行13。SC2-VLP 实验流程如图1所示，概述了实验方案，并图示了 SARS-CoV-2 生命周期这些阶段所涉及的过程。该方法中，将编码 SARS-CoV-2 结构蛋白（M、E、S 和 N）以及 RNA 包装信号（T20）的质粒共转染至 HEK-293T 细胞中。将荧光素酶报告基因与 T20 信号融合，可实现对释放的 SC2-VLP 的高灵敏度检测；这些 VLP 随后可感染表达 SARS-CoV-2 受体 ACE2 和 TMPRSS2 的受体细胞，如图1所示。
为了优化编码SA.......
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讨论
一种简单且有效的方法，可在细胞培养系统中模拟SARS-CoV-2的生命周期，同时无需依赖BSL-3实验室的限制条件，这为抗SARS-CoV-2研究带来了关键性进展。SC2-VLP方法满足了这一需求，提供了一个稳健且易于获取的研究平台。在本研究中，我们提供了SC2-VLP方法的详细实验方案，阐述了生产SC2-VLPs的关键实验步骤。此外，我们还强调了该方法的多功能性及其在深化SARS-CoV-2生物学认知、推动抗病毒策略开发方面的潜在应用价值。
传统的SARS-CoV-2病毒样颗粒（VLP）和慢病毒假型化方法在抗SARS-CoV-2研究中被广泛应用8,25。在传统VLP方法中，SARS-CoV-2的结构蛋白M、N、E和S共同表达以生成病毒颗粒26，其丰度通常通过WB分析进行检测。然而，病毒结构蛋白也会被整合到其他膜结构（如外泌体）中，从而增加了对病毒颗粒进行WB分析的复杂性27
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到了北京中医药大学（BUCM）启动基金项目（90011451310011）的支持。我们衷心感谢北京中医药大学马博士实验室的所有成员在实验讨论与实施过程中提供的宝贵帮助与支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白（BSA） | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus | FV3000 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| 胎牛血清（FBS） | Thermofisher | A5670402 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）抗体 | Invitrogen | A11001 | 稀释比例：IF 1:1000 |
| 山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 594）抗体 | Abcam | ab150080 | 稀释比例：IF 1:1000 |
| HEK-293T细胞系 | 国家细胞资源库（NICR） | NICR-293T-001 | 为确保高转染效率和最佳SC2-VLP产量，HEK-293T细胞应保持在低代次（≤ P10）。 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 工作浓度：2.5 μg/mL |
| 荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1500 | |
| Luc-T20 | Addgene | 177941 | |
| 小鼠单克隆抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | 稀释比例：WB 1:20,000 |
| 小鼠单克隆抗S RBD抗体 | Abclonal | A23771 | 稀释比例：IF 1:200 |
| OptiMEM | Thermofisher | 31985070 | 用于转染的无血清培养基 |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | P3635 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P2139 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermofisher | 15140122 | |
| 聚乙烯亚胺（PEI） | Thermofisher | 43896.01 | |
| Promega被动裂解缓冲液 | Promega | E1941 | |
| 兔多克隆抗ACE2抗体 | Proteintech | 21115-1-AP | 稀释比例：WB 1:1000 |
| 兔多克隆抗ERGIC53抗体 | Proteintech | 13364-1-AP | 稀释比例：IF 1:200 |
| 兔多克隆抗GM130抗体 | Proteintech | 11308-1-AP | 稀释比例：IF 1:200 |
| 兔多克隆抗S抗体 | Abcam | ab272504 | 稀释比例：WB 1:1000 |
| 兔多克隆抗Sec61β抗体 | Proteintech | 15087-1-AP | 稀释比例：IF 1:200 |
| 兔多克隆抗TMPRSS2抗体 | Abcam | ab109131 | 稀释比例：WB 1:1000 |
| SARS-CoV-2 M-IRES-E质粒 | Addgene | 177938 | |
| SARS-CoV-2 N质粒 | Addgene | 177959 | |
| SARS-CoV-2核蛋白兔单克隆抗体 | Abclonal | A21042 | 稀释比例：WB 1:4000 |
| SARS-CoV-2 S质粒 | Addgene | 177960 | |
| 二抗，HRP标记，山羊抗小鼠IgG（H+L） | Invitrogen | 31460 | 稀释比例：WB 1:5000 |
| 二抗，HRP标记，山羊抗兔IgG（H+L） | Invitrogen | 31430 | 稀释比例：WB 1:5000 |
| SpectraMax i3x酶标仪 | Molecular Devices | SpectraMax i3x |
参考文献
- Narayanan, S. A., et al. A comprehensive SARS-CoV-2 and COVID-19 review, Part 2: host extracellular to systemic effects of SARS-CoV-2 infection. Eur J Hum Genet. 32 (1), 10-20 (2024).
- Shang, J., et al. Structural basis of rece....
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重印与许可
