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方法文章

生产一种SARS-CoV-2病毒样颗粒系统以在体外研究病毒生命周期 In Vitro

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DOI：

10.3791/68389

⸱

2025年6月6日

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提出了一种优化的体外（in vitro）方案，用于制备高度模拟真实病毒的SARS-CoV-2病毒样颗粒。该方法可在无需生物安全三级实验室的条件下，研究病毒感染、组装及释放机制。

摘要

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）病毒样颗粒（SC2-VLP）方法提供了一种强大且易于获取的工具，可用于研究SARS-CoV-2的生命周期，而无需使用生物安全三级（BSL-3）实验室。该系统通过将荧光素酶报告基因与T20信号融合，能够灵敏且精确地检测病毒颗粒的产生，有效模拟病毒生命周期中的关键阶段，包括组装、基因组包装和释放。SC2-VLP通过在HEK-293T细胞中共同表达SARS-CoV-2的结构蛋白（包括膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）、包膜蛋白（E）和刺突蛋白（S））以及RNA包装信号来生成。与传统的病毒样颗粒系统相比，SC2-VLP方法可实现更准确的定量，并更真实地还原天然病毒的生命周期。此外，相较于仅能通过将S蛋白整合到基于HIV的慢病毒颗粒中来研究病毒进入过程的慢病毒假型化方法，SC2-VLP系统为探索SARS-CoV-2生物学的多个阶段提供了更全面的研究平台。该方法避免了操作活病毒的风险，同时提高了研究的可及性。SC2-VLP方法代表了抗病毒研究及针对SARS-CoV-2治疗策略开发领域的重要进展。

引言

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情已成为现代历史上最具破坏性的全球公共卫生危机之一，已导致全球数百万人死亡1。引发该疾病的病毒SARS-CoV-2具有复杂的生命周期，包括感染、基因组复制、组装和释放等关键阶段2,3。感染过程始于病毒刺突蛋白（S）与宿主细胞受体血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，从而促进病毒基因组进入宿主细胞。随后，病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）催化基因组RNA的复制。该RNA与核衣壳蛋白（N）形成复合物，构成稳定的结构，并被膜蛋白（M）识别。M蛋白在病毒组装过程中发挥核心作用，可招募RNA-N复合物、S蛋白以及包膜蛋白（E）4,5。组装完成后，病毒颗粒通过一种非经典的溶酶体介导的运输途径完成释放6。

为应对大流行，全球已投入大量资源用于开发疫苗、中和抗体和抗病毒药物。对这些干预措施的评估对于推进SARS-CoV-2研究至关重要7。然而，研究活病毒面临显著的后勤挑战，因为涉及该病毒的实验必须在生物安全三级（BSL-3）实验室中进行。BSL-3设施的有限可及性制约了旨在理解与抗击SARS-CoV-2的研究进展速度。

为应对这些挑战，病毒样颗粒（VLP）和慢病毒假型化两种主要系统已在SARS-CoV-2研究中被广泛采用，二者均无需在BSL-3级生物安全条件下进行8。VLP系统通过将编码病毒结构蛋白（包括M、S、E和N蛋白）的基因共转染至细胞中，从而产生病毒样颗粒。这些颗粒可模拟病毒的结构和功能特性，是研究SARS-CoV-2生命周期关键过程的重要工具，甚至可作为疫苗开发的有效抗原9,10,11。

相反，慢病毒假型系统通过将慢病毒中的水疱性口炎病毒（VSV）G蛋白替换为SARS-CoV-2的S蛋白，从而能够产生可携带报告基因（如荧光素酶或GFP）的慢病毒颗粒。该系统特别适用于研究阻断S蛋白与ACE2相互作用的中和抗体12。然而，由于该系统使用HIV的结构蛋白，病毒颗粒在质膜上释放，因此无法模拟SARS-CoV-2的病毒组装或出芽过程。

为了克服这些局限性，Syed 等人近期鉴定出了 SARS-CoV-2 RNA 基因组中的包装信号，该信号展示了 N 蛋白在识别病毒基因组时的特异性13。通过将该包装信号与报告基因融合，可高效地将这些基因整合到 SARS-CoV-2 类病毒颗粒（SC2-VLPs）中13。该策略不仅能够模拟 SARS-CoV-2 的组装和释放过程，还可实现对感染步骤的高灵敏度检测。在本研究中，我们介绍了使用 SC2-VLP 系统的实验方法，并强调了实施该方法时的关键注意事项。

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方案

1. SC2-VLP 的生成

  1. 在直径10 cm的组织培养皿中接种约3.0 × 106个HEK-293T细胞，使用添加了10% v/v胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM完全培养基。
    注意：为确保高转染效率和最佳的SC2-VLP生产效果，HEK-293T细胞应保持较低的传代次数，约为10代左右。
  2. 将HEK-293T细胞在37 °C、5% CO2条件下培养约24小时，在显微镜下检查细胞融合度。当细胞融合度达到约70%时，进行下一步操作。
  3. 将60 µL浓度为1 mg/mL的PEI用无血清培养基稀释至200 µL。
  4. 将6.7 µg N质粒、10 µg Luc-T20质粒、0.016 µg S质粒以及3.3 µg M-IRES-E质粒加入200 µL无血清培养基中（参见补充文件1）。
  5. 轻轻将步骤1.3中稀释的PEI加入步骤1.4中含病毒结构蛋白编码质粒的溶液中，室温孵育10分钟。此即为转染溶液。
  6. 将步骤1.5中的转染溶液小心滴加到HEK-293T细胞中，并轻轻晃动组织培养皿以充分混匀。
  7. 感染后6小时更换为DMEM完全培养基，将转染后的HEK-293T细胞在37 °C、5% CO2条件下继续培养48小时。
  8. 收集感染后的HEK-293T细胞上清液（其中含有SC2-VLP），然后通过0.45 µm注射器滤器过滤，以去除细胞碎片。此即为SC2-VLP培养基。
    注意：我们曾尝试在HeLa、Vero E6和Caco2细胞系中生产SC2-VLP，但未能检测到可测量的病毒滴度，表明该方案对HEK-293T细胞具有特异性。

2. SC2-VLP 有效性的检测

注意：通过慢病毒转导方法建立了稳定表达ACE2和TMPRSS2的HEK-293T细胞系14,15。采用类似于步骤3（SC2-VLP组分分析）中所述的方案，通过蛋白质印迹分析确认了ACE2和TMPRSS2的蛋白表达。

  1. 接种 4.0 × 104 在96孔板中加入稳定表达ACE2和TMPRSS2的HEK-293T细胞，并加入50 µL步骤1.8获得的SC2-VLP培养基。
  2. 将96孔组织培养板在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 24 小时。
  3. 从96孔板中移除培养基，用含有137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na的PBS缓冲液在37 °C下洗涤一次，每孔加入100 µL2HPO4，以及 1.8 mM KH2PO4.
  4. 用20 µL被动裂解缓冲液裂解HEK-293T ACE2/TMPRSS2细胞，在室温下于摇床上轻柔振荡15分钟。
    注意：裂解缓冲液含有 25 mM Tris-磷酸盐（pH 7.8）、2 mM DTT、2 mM 1,2-二氨基环己烷-N,N,N′,N′-四乙酸、1.25 mg/mL 溶菌酶、2.5 mg/mL BSA、10% 甘油和 1% Triton X-100。
  5. 将96孔板在4,000 × g条件下离心 g 在4 °C下，于制冷微量离心机中离心15分钟，随后立即将酶标板转移至冰浴中。
  6. 取100 µL重悬的荧光素酶检测试剂缓冲液至不透明白色96孔板中，加入2.5步骤中的20 µL裂解液。用移液器轻轻吹打2-3次以混匀。
  7. 使用以下参数的酶标仪测量发光值： 检测模式：发光检测；波长范围：全光谱；板型：96孔标准不透明板；积分时间：200 ms.

3. SC2-VLP 成分的检测

  1. 向步骤1.8中的10 mL SC2-VLP培养基中加入1.36 mL PEG 8000溶液（含50% PEG 8000和2.2% NaCl）。
  2. 将混合物置于摇床中，在4 °C下缓慢振荡过夜。
  3. 在 4 °C 下以 2,000 × g 离心溶液 g 孵育30分钟，收集SC2-VLP沉淀物用于蛋白质印迹分析16.
    注意：对于蛋白质印迹分析，所有关于抗体的信息均提供于下文中 材料表.

4. SC2-VLP 产生细胞中 S 蛋白及其突变体的亚细胞定位分析

  1. 在直径为 15 mm 的玻璃底培养皿中均匀接种约 3.0 × 106 个 HEK-293T 细胞，转染前培养至细胞贴壁并生长至约 70% 汇合度。
  2. 重复步骤 1.3 至 1.7 中所述的转染程序，仅修改质粒用量如下：N 质粒：1.3 µg，Luc-T20 质粒：2 µg，S 质粒：0.0032 µg，M-IRES-E 质粒：0.66 µg。
  3. 用 1 mL 冰冷的 PBS 轻柔洗涤培养皿两次，然后在室温（RT）下加入 1 mL 4% 多聚甲醛（PFA）固定液，固定 15 分钟。
  4. 在室温下用 1 mL PBS 洗涤细胞 2 次，每次 5 分钟，然后在室温下加入 1 mL 0.25% Triton X-100 处理 10 分钟以通透细胞。
  5. 在室温下用 1 mL PBS 洗涤细胞 2 次，每次 5 分钟，然后在室温下加入 1 mL 5% 牛血清白蛋白（BSA）封闭 1 小时，以阻断非特异性抗体结合。
  6. 加入约 200 µL 一抗溶液（足以覆盖玻璃底面），于 4 °C 孵育过夜。
    注：一抗溶液使用含 5% BSA 的 PBS 缓冲液按以下稀释比例配制：小鼠抗 S 抗体 1:200，兔抗 Sec61β 抗体 1:200，兔抗 GM130 抗体 1:200，兔抗 ERGIC53 抗体 1:200。5% BSA/PBS 溶液既作为稀释液，也作为封闭缓冲液，以最大限度减少后续免疫荧光染色过程中的非特异性结合。
  7. 移除一抗溶液，然后在室温下用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
  8. 在室温下加入荧光标记的二抗溶液孵育 1 小时，然后在室温下用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
    注：所有后续操作必须在避光或极低光照条件下进行，以防止荧光偶联物发生光漂白，确保信号完整性。使用两种荧光标记的二抗（分别来源于小鼠或兔）对 S 蛋白或细胞器标志蛋白进行染色。
  9. 在室温下用 2.5 µg/mL Hoechst 溶液染核 5 分钟，然后在室温下用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
  10. 使用共聚焦显微镜观察 S 蛋白或细胞器染色情况并采集图像，设置如下参数：PMT 模式设为VBF（无平均化，逐线扫描），自动共焦孔径。对于通道 1（FITC），使用488 nm 激光，功率25%，发射波长500 - 548 nm，HV 525 V，增益 1x，偏移 5%。对于通道 2（Alexa Fluor 594），使用594 nm 激光，功率25%，发射波长610 - 670 nm，HV 500 V，增益 1x，偏移 5%。对于通道 3（DAPI），使用405 nm 激光，功率25%，发射波长430 - 470 nm，HV 490 V，增益 1x，偏移 5%。

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结果

与感染和复制阶段相比，SARS-CoV-2 生命周期中的出胞和组装阶段研究较少17,18。在 SC2-VLP 方法建立之前，这些过程只能通过使用活体 SARS-CoV-2 进行研究，因而限制了研究必须在 BSL-3 实验室中进行13。SC2-VLP 实验流程如图1所示，概述了实验方案，并图示了 SARS-CoV-2 生命周期这些阶段所涉及的过程。该方法中，将编码 SARS-CoV-2 结构蛋白（M、E、S 和 N）以及 RNA 包装信号（T20）的质粒共转染至 HEK-293T 细胞中。将荧光素酶报告基因与 T20 信号融合，可实现对释放的 SC2-VLP 的高灵敏度检测；这些 VLP 随后可感染表达 SARS-CoV-2 受体 ACE2 和 TMPRSS2 的受体细胞，如图1所示。

为了优化编码SA...

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讨论

一种简单且有效的方法，可在细胞培养系统中模拟SARS-CoV-2的生命周期，同时无需依赖BSL-3实验室的限制条件，这为抗SARS-CoV-2研究带来了关键性进展。SC2-VLP方法满足了这一需求，提供了一个稳健且易于获取的研究平台。在本研究中，我们提供了SC2-VLP方法的详细实验方案，阐述了生产SC2-VLPs的关键实验步骤。此外，我们还强调了该方法的多功能性及其在深化SARS-CoV-2生物学认知、推动抗病毒策略开发方面的潜在应用价值。

传统的SARS-CoV-2病毒样颗粒（VLP）和慢病毒假型化方法在抗SARS-CoV-2研究中被广泛应用8,25。在传统VLP方法中，SARS-CoV-2的结构蛋白M、N、E和S共同表达以生成病毒颗粒26，其丰度通常通过WB分析进行检测。然而，病毒结构蛋白也会被整合到其他膜结构（如外泌体）中，从而增加了对病毒颗粒进行WB分析的复杂性27

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到了北京中医药大学（BUCM）启动基金项目（90011451310011）的支持。我们衷心感谢北京中医药大学马博士实验室的所有成员在实验讨论与实施过程中提供的宝贵帮助与支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛血清白蛋白（BSA）Cell Signaling Technology9998S
共聚焦激光扫描显微镜OlympusFV3000
DMEMCorning10-013-CV
胎牛血清（FBS）ThermofisherA5670402
山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488）抗体InvitrogenA11001稀释比例：IF 1:1000
山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 594）抗体Abcamab150080稀释比例：IF 1:1000
HEK-293T细胞系国家细胞资源库（NICR）NICR-293T-001为确保高转染效率和最佳SC2-VLP产量，HEK-293T细胞应保持在低代次（≤ P10）。
Hoechst 33342InvitrogenH1399工作浓度：2.5 μg/mL
荧光素酶报告基因检测系统PromegaE1500
Luc-T20Addgene177941
小鼠单克隆抗GAPDH抗体Proteintech60004-1-Ig稀释比例：WB 1:20,000
小鼠单克隆抗S RBD抗体AbclonalA23771稀释比例：IF 1:200
OptiMEMThermofisher31985070用于转染的无血清培养基
PEG3350Sigma-AldrichP3635
PEG8000Sigma-AldrichP2139
青霉素-链霉素Thermofisher15140122
聚乙烯亚胺（PEI）Thermofisher43896.01
Promega被动裂解缓冲液PromegaE1941
兔多克隆抗ACE2抗体Proteintech21115-1-AP稀释比例：WB 1:1000
兔多克隆抗ERGIC53抗体Proteintech13364-1-AP稀释比例：IF 1:200
兔多克隆抗GM130抗体Proteintech11308-1-AP稀释比例：IF 1:200
兔多克隆抗S抗体Abcamab272504稀释比例：WB 1:1000
兔多克隆抗Sec61β抗体Proteintech15087-1-AP稀释比例：IF 1:200
兔多克隆抗TMPRSS2抗体Abcamab109131稀释比例：WB 1:1000
SARS-CoV-2 M-IRES-E质粒Addgene177938
SARS-CoV-2 N质粒Addgene177959
SARS-CoV-2核蛋白兔单克隆抗体AbclonalA21042稀释比例：WB 1:4000
SARS-CoV-2 S质粒Addgene177960
二抗，HRP标记，山羊抗小鼠IgG（H+L）Invitrogen31460稀释比例：WB 1:5000
二抗，HRP标记，山羊抗兔IgG（H+L）Invitrogen31430稀释比例：WB 1:5000
SpectraMax i3x酶标仪 Molecular DevicesSpectraMax i3x

参考文献

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