使用拟南芥莲座丛分离和分析叶表和质外 RNA 的分步指南

摘要

我们描述了一种简单但高度可重复的方法，用于从拟南芥植物的叶表和质外体中分离细胞外 RNA。

摘要

植物叶子的表面和叶子内的细胞间隙（质外体）是植物与其相互作用的微生物之间分子交换的关键界面。在之前的工作中，我们证明了拟南芥莲座丛的质外体中存在多种RNA物种。最近，我们的研究结果表明，拟南芥植物也积极地将 RNA 分泌到叶子表面。为了研究这一点，我们开发了一种高度可重复的方法，从同一组拟南芥植物中收集叶面洗涤液 （LSW） 和质外洗涤液 （AWF）。此外，我们还探索了一种涉及叶面拭子 （LSS） 的非侵入性技术，该技术使我们能够通过用无菌棉尖棒轻轻擦拭叶子表面来收集 RNA。为了最大限度地降低微生物污染的风险，我们在分离细胞外 RNA （exRNA） 之前过滤了 LSW、AWF 和 LSS 组分。在使用变性RNA凝胶电泳分析纯化的exRNA后，我们在LSW、LSS和AWF RNA样品中观察到各种长RNA和小RNA物种。使用可免费访问的软件 ImageJ 对 exRNA 样品和实验条件进行进一步的定量和比较分析。该协议提供了一种高效、经济高效的方法，用于从植物叶片中分离和分析少量 exRNA。这些 RNA 制剂可以通过测序和其他分子分析进一步表征，从而深入了解 exRNA 在植物-微生物相互作用中的动态作用。

引言

叶子被多种微生物定植，包括细菌、真菌、卵菌和原生生物，这可以帮助保护植物免受生物和非生物压力源的影响，最终促进植物生长发育1,2,3,4。植物叶子有两个主要隔室来容纳它们相互作用的微生物：附生（叶面）和内生（质外体）²。叶子表面由疏水角质层保护，可防止水分流失，并包括蜡和角质等成分。上部（近端）叶表面通常包括称为毛状体的特殊毛发状表皮细胞，可以防止紫外线、调节温度并对食草动物起到威慑作用。相比之下，质外体促进光合作用的气体和水交换，并提供有利于微生物定植的潮湿环境⁵。尽管存在这些差异，但两个叶室都有利于某些微生物，与内生微生物网络相比，附生微生物网络在多样性方面更为复杂⁵。这些微生物群落的组成在每个细胞外区室中是如何调节的仍然知之甚少。我们推测微生物群落结构可能部分由寄主植物分泌的细胞外 RNA （exRNA） 决定。

在我们最近的研究中，我们报告了叶子表面存在与质外体或细胞裂解物中的 RNA 不同的多种 RNA 物种⁶。虽然大多数关于植物中exRNA的研究都集中在小的非编码RNA，如microRNA（miRNA）和小干扰RNA（siRNA），但对其他RNA物种的关注较少，例如rRNA和tRNA衍生的片段，它们可以潜在地调节细胞过程，而独立于序列互补性，特别是在缺乏RNA干扰机制的物种中^7,8，9.

我们在这里描述的方法能够使用同一组拟南芥植物从叶面洗涤液 （LSW） 和质外洗涤液 （AWF） 中顺序分离 RNA。此外，我们描述了一种涉及叶面拭子（LSS）的非侵入性正交技术，该技术通过用无菌棉尖棒轻轻擦拭喷洒的叶子表面来收集^RNA6。为了最大限度地降低微生物污染的风险，我们在分离细胞外 RNA 之前过滤 LSW 和 AWF 组分。为了评估exRNA样品的数量和大小分布，我们描述了一种方案，该方案采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，并使用可免费访问的软件ImageJ进行图像分析。该协议为分离和分析少量 exRNA 提供了一种高效、经济高效的方法。这些 RNA 制剂可以通过测序和分子分析进一步表征，从而深入了解细胞外 RNA 在植物-微生物相互作用中的动态作用。

下面描述的方案不同于我们之前描述的从植物细胞外囊泡¹⁰中分离RNA的方案。目前的方案不需要任何超速离心步骤，并且能够从总细胞外洗涤液中分离 RNA，而不仅仅是从细胞外囊泡中分离 RNA。最重要的是，它提供了两种从叶子表面分离 RNA 的正交方法。据我们所知，在我们最近发表的⁶ 之前，尚未描述从叶子表面分离 RNA 的方法。

方案

1.缓冲液制备和灭菌

1. 在 1 L 蒸馏水中制备含有 20 mM 2-（N-吗啉）乙磺酸 （MES）、pH 6.0、2 mM CaCl₂ 和 0.01 M NaCl 的囊泡分离缓冲液 （VIB）。
   注意：已对VIB中NaCl的浓度进行了从0.1M到0.01M的微小调整，以模拟叶质外体的离子浓度。
2. 在121°C下高压灭菌VIB20分钟，液体循环。或者，使用 0.45 μm 真空过滤器对 VIB 进行过滤灭菌。
   注意：此步骤是为了确保缓冲液是无菌的，因为任何微生物污染都可能导致植物的诱发，进而导致结果的变异。该缓冲液可在室温下（灭菌后不打开盖子）储存以进行短期储存，或在4°C下储存以进行长期储存。

2、植物材料及生长条件

1. 将 拟南芥 Col-0 野生型 （WT） 种子播种在含有标准盆栽混合物的 4 英寸圆形塑料盆中。播种后，用生物杀菌剂（600mg/L）浸泡种子，盖上透明塑料圆顶，在4°C避光下保持3天，以诱导同步发芽。
2. 将装有种子的花盆转移到设置为24°C的温控短日生长室中，该室在植物水平上具有150μmol·m⁻²·s⁻¹ 光合光子通量密度的9 h光照/15 h暗光周期（3,500和5,000 K光谱32瓦荧光灯泡的50：50混合）。
3. 大约 10 天后，将单个幼苗转移到装有盆栽混合物的 36 细胞托盘插入物中，并用透明塑料圆顶覆盖 1-2 周。
   注意：每个基因型/处理需要 ~12-24 株健康植物。已经注意到，6-7 周龄的植物产生最佳量的 LSW 和 AWF RNA，细胞污染的风险最小。
4. 根据所使用的盆栽混合物，每 10-15 天给植物浇水一次，以避免干旱或洪水胁迫。

3. 叶表RNA的收集

1. 基于离心的方法（叶面清洗;LSW）
   1. 对于每次重复，使用 6-7 周龄的拟南芥植物。
   2. 在开始分离LSW之前，将Silwet-L77（以下简称润湿剂）以终浓度为0.001%（100mL VIB中1μL）加入无菌VIB中。
      注意：Silwet-L77 是一种润湿剂，可降低表面张力并使缓冲液能够覆盖叶子表面。
   3. 将 100 mL VIB 转移到 500 mL 喷雾瓶中。
   4. 用细剪刀小心地将拟南芥莲座丛从根部分离。
   5. 用软刷去除叶柄上多余的污垢。
   6. 将玫瑰花结放在平坦的托盘上，远轴面朝上。
   7. 使用五泵喷雾瓶用 VIB + 润湿剂喷洒远轴表面。
   8. 小心地翻转花环，用 VIB + 润湿剂喷洒近轴表面五次。
   9. 要回收LSW，请小心地将喷洒的玫瑰花结放入底部有孔的无针60mL注射器中（每个注射器最多可容纳两个6周大的玫瑰花结），放置在250mL离心瓶内。用封口膜将注射器缠绕在颈部，将注射器尖端悬挂在瓶底上方（参见 图1 ）。
      注意：有关制备带孔的 60 mL 注射器的详细信息，请参阅先前发布的协议¹¹。
   10. 将装载的瓶子在 4 °C 下以 100 g 离心 10 分钟（JA-14 转子）。
   11. 通过0.22μm注射器过滤器过滤LSW，并将滤液收集在放置在冰上的50mL离心管中。
       注意：通常，使用该协议，12 株植物最终会产生约 30 mL 的 LSW。然而，这只是基于每一步执行的喷洒次数的估计。该体积通常小于喷洒体积，因为部分喷洒缓冲液在处理过程中会丢失。
2. 叶面拭子 （LSS） 方法
   1. 如上一节所述，用VIB +润湿剂喷洒分离的花环（步骤3.1.1-3.1.7）。
   2. 要回收LSS，请使用无菌棉头棒擦拭近轴和远轴表面，并将浸泡过的尖端压在15mL离心管的内壁上以挤出液体。
      注意：可以根据实验设置和预期结果将近轴和远轴LSS样品收集在单独的管中。
   3. 通过 0.22 μm 注射器过滤器将 LSS 样品过滤到放置在冰上的 15 mL 离心管中。
      注意：根据拭子的植物数量，每个实验可以收集不同体积的LSS。

图1：用于叶面清洗和质外洗涤液分离的工具。 （A）为了收集LSW和AWF，将两个完整的 拟南芥 莲座丛放入一个60 mL注射器中，注射器中有八个额外的孔，这些孔用加热的镊子熔化到注射器的末端，以形成洗涤液流过的通道。（B）然后，如图所示，将无针注射器用封口膜包裹在颈部区域。（C） 此步骤允许注射器装入 250 mL 离心瓶中，而无需接触瓶底。 请点击此处查看此图的大图。

4. 质外化清洗液 （AWF） 的收集

1. 将用于 LSW 或 LSS 分离的同一组植物放入烧杯中，并用蒸馏水轻轻冲洗两次。
2. 用 VIB 真空浸润莲座丛 20 秒，如下所示：
   注意：尽管真空浸润的过程在先前发表的协议¹¹中得到了很好的描述，但为了使本协议清晰，已在此处复制。
   1. 小心地将玫瑰花结放入装有 300-500 mL VIB 的法式压榨咖啡机中。盖上法式压榨壶的盖子，轻轻降低柱塞，直到植物完全淹没。
   2. 将带有植物和缓冲液的法式压榨机放入真空室中。使用真空泵施加真空 20 秒。缓冲液应该刚开始沸腾。
   3. 释放真空，从真空室中取出法式压榨机，取下盖子，将 VIB 倒入单独的 500 mL 塑料烧杯中。从法式压榨机中取出玫瑰花结。
      注意：对于一种基因型，VIB 可以在同一天重复使用多次，但一旦用于真空浸润，VIB 就不应储存以备另一天使用。
   4. 轻轻摇晃，然后用纸巾刷叶子，去除植物中多余的 VIB。
3. 用吸墨纸轻轻吸干，去除叶子表面多余的缓冲液。
4. 要收集质外洗涤液（AWF），请将玫瑰花结放入放置在250mL离心瓶内的60mL无针注射器内，如LSW收集所述，并在4°C下以600×g缓慢加速离心 30分钟。
5. 通过0.22μm注射器过滤器过滤混合的AWF，并将滤液收集在放置在冰上的15mL离心管中。
   注意：通常，使用该协议，12 株植物最终会产生约 6 mL 的 AWF。过滤后的 LSW、AWF 和 LSS 可以立即使用或储存在 -80 °C 直至进一步使用。
6. 记录AWF分离后用于每次重复的植物的新鲜重量（FW）。随后，使用此读数对每个样品中的 RNA 量进行归一化（图 2）。

图2：方案和叶面拭子方法的示意图。（A）使用拟南联莲座丛分离叶面洗涤液和质外体洗涤液的逐步方案示意图。（B）叶面拭子（LSS）分离叶表RNA的方法示意图。图改编自图 S1 和图 S4 of Borniego et al.， 2025^6.请点击此处查看此图的大图。

5. RNA的沉淀

1. 通过在 15 mL 离心管中将所需体积的 AWF、LSW 或 LSS 与 0.1 体积的 3 M 乙酸钠 （pH 5.2） 和 1.0 体积的冷异丙醇混合来沉淀 RNA。
2. 加入糖原（20 mg/mL 储备液）至终浓度为 20 μg/mL。
   注意：确保用于沉淀RNA的离心管可以以13,000 × g的高速离心。在此步骤中试管破裂会导致 RNA 样品丢失。
3. 将混合物在-20°C下孵育至少1小时或过夜。
4. 在4°C（JA-25.50转子）下以13,000 × g 离心管30分钟。
5. 用冰冷的 70% EtOH 洗涤沉淀两次，并让其风干不超过 10 分钟。
6. 将沉淀重悬于 100 μL 超纯无 DNase/RNase 水或 VIB 中，并将 RNA 转移到 1.5 mL 离心管中。
   注意：在此步骤之后，沉淀的RNA可以在-80°C下储存长达2周。

6. 基于TRIzol的RNA分离

1. 向每个试管中加入 1 mL TRIzol 试剂，并在旋转器上摇晃混合。
   注意： 处理 TRIzol 时，请在通风橱中使用，戴上手套和护目镜。
2. 将试管放在桌面旋转器上，在室温 （RT） 下 10 分钟。
3. 向每个试管中加入 200 μL 氯仿，然后进行简短但剧烈的涡旋步骤。
   注意：处理氯仿时，请在通风橱中使用，戴上手套和护目镜。
4. 让试管在室温下静置约3分钟，然后在4°C下以13,000 × g 离心15分钟。
5. 将水相转移到标记的 1.5 mL 离心管中，并加入 10 μg 无 RNase 糖原和一体积冷异丙醇。
   注意： 对于产生的生物危害废物（例如苯酚废物），请根据机构指南将有机溶剂收集在指定的废物容器中。
6. 将试管在-20°C下孵育不超过1小时。
   注意：在此步骤中沉淀RNA超过1小时会降低RNA分离的效率，并导致RNA浓度非常低。
7. 要沉淀 RNA，请将试管在 13,000 × g 在 4 °C 下离心 20 分钟。
8. 使用冰冷的 70% EtOH 洗涤 RNA 沉淀两次，让它们风干，然后重悬于 10-20 μL 超纯无 DNase/RNase 水中。
9. 将重悬的RNA分别储存在-20°C或-80°C，以进行短期或长期储存。

7. 去除苯酚或胍污染

1. 要去除 RNA 样品中的苯酚或胍污染，请使用 96% EtOH 和醋酸铵进行一次或两次连续沉淀。
2. 将 1 μg 糖原添加到 10 μL RNA 样品中，并与 0.5 体积的 7.5 M 醋酸铵混合，然后加入 2.5 体积的 96-100% EtOH 。
   注意：在此步骤中，EtOH的最终浓度应为整个体积中的70-75%。
3. 将混合物在-80°C下孵育30分钟，并在4°C下以13,000 × g 离心20分钟。
4. 用 70% EtOH 洗涤 RNA 沉淀两次，并重悬于 10 μL 超纯无 DNase/RNase 水中。

8. 用于定量和比较的RNA凝胶电泳

1. 使用 40% 丙烯酰胺/双溶液，37.5：1 制备含有 10% 或 15% 聚丙烯酰胺和 7 M 尿素的微型凝胶 （7.2 cm x 8.6 cm x 0.75 mm），在 1x Tris-硼酸 EDTA（TBE，pH 8.4）中。或者，可以使用商业变性微型凝胶（15% TBE-尿素凝胶）来运行 RNA 样品。
2. 将RNA样品（1：1）与2x变性上样缓冲液（95%甲酰胺，10mM EDTA，0.02%SDS，0.02%溴酚蓝和0.01%二甲苯氰）混合，在65°C下变性5分钟，然后立即置于冰上。
3. 在 220 V 室温下在 0.5x TBE 运行缓冲液中分离 RNA 样品约 1 小时 15 分钟。
4. 对于大小标准品，请使用低范围 ssRNA 和 14-30 nt ssRNA 分子量标准品的 1：1 混合物。
5. 用 1x SYBR 金核酸凝胶染色剂在 0.5x TBE 中染色凝胶 10 分钟，用蒸馏水洗涤两次，并使用成像系统成像（图 3）。
6. 要量化每个泳道中分离的 RNA，请使用 ImageJ 文档中“凝胶分析”副标题下概述的凝胶分析方法：https://imagej.net/ij/docs/menus/analyze.html
7. 由于每次加载 100 ng/μL 的 CL RNA 以比较 CL 和 exRNA 样品之间的条带模式，因此估计 exRNA 样品相对于 CL RNA 的浓度（图 4）。

图 3：植物叶子涂有多种 RNA。 将 100 ng 来自叶细胞裂解物 （CL） 的 RNA 和从 AWF 和 LSW 中分离的 2 μL RNA 分离在 15% 变性聚丙烯酰胺凝胶上，并用 SYBR Gold 核酸染色剂染色，以可视化和比较 RNA 条带模式。RNA 大小标准品显示在最左侧的泳道中。使用 ImageJ 凝胶分析获得的密度测定测量值显示在每个泳道的底部，并指示相对于总叶细胞裂解物泳道中 RNA 的 RNA 量。 请点击此处查看此图的大图。

图4：LSW RNA的重复提取。 首先使用不含 Silwet L-77 或不同浓度的 Silwet L-77（0.001% 或 0.01%）的 VIB 分离 LSW。可以使用同一组拟南芥植物重复分离LSW，以使用VIB + Silwet L-77（0.001%）富集LSW RNA。L1、L2 和 L3 表示使用 LSW 分离的 RNA 样品，在喷洒同一组植物后通过连续三轮离心收集。将润湿剂的浓度从0.001%增加到0.01%并没有增强LSW RNA的分离。使用 ImageJ 凝胶分析获得的密度测量值显示在每条泳道的底部。 请点击此处查看此图的大图。

9. 使用基于微量滴定板的方法定量 RNA 的替代方法

1. 使用不含 RNase/DNase 的超纯水中的 CL RNA 制备标准 RNA 溶液。根据样品的预期浓度确定标准品的适当浓度范围。使用以下 RNA 浓度：0、6.75、12.5、25、50、100、200 ng/μL，并制备足够体积的每种标准品以允许两次技术重复。
2. 在 500 mM Tris HCl pH = 8 中制备 1.5x SYBR Gold 核酸凝胶染色剂。
   注意：SYBR Gold 具有 pH 依赖性，并且在 pH = 7.0 和 8.0 之间具有最佳染色灵敏度。
3. 微孔板设置：
   1. 向每个孔中加入 99 μL dH₂O。
   2. 向每个孔中加入 1 μL RNA。RNA 样品和 RNA 标准品均使用 1 μL。
   3. 向每个孔中加入 50 μL 1.5x SYBR 金。
4. 在酶标仪上设置参数如下：
   摇动 - 线性或轨道：0：03 （MM：SS）
   读取 - 荧光终点，激发波长设置为 496 nm，发射波长设置为 540 nm。
5. 使用标准值构建校准线。使用校准线方程，计算样品中的 RNA 浓度。
   注意：替代染料可用于定量TRIzol分离样品中的RNA。Ribo488 RNA定量试剂也获得了类似的结果。该公司为这种染料提供了详细的手册。简而言之，使用 200 mM Tris pH = 8 将染料稀释 1000 倍（1 至 1000）。然后进行测量，向每个孔中加入 99 μL 高压灭菌的 dH₂O + 1 μL RNA（样品或标准品）+ 100 μL Ribo488 稀释液，孵育 5 分钟，并使用酶标仪使用 480 nm 激发和 520 nm 发射定量荧光。使用两种RNA染料获得的标准曲线如 图5所示。

图 5：使用基于微量滴定板的 RNA 定量方法获得的标准曲线。 两种不同的 RNA 染料 SYBR Gold（左）和 Ribo488（右）通过每个样品的两次技术重复产生一致的结果。这两种方法都可用于进行RNA定量。然而，每次需要定量RNA时都应获得标准曲线。 请点击此处查看此图的大图。

结果

图 2A显示了上述从拟南芥植物中分离叶面洗涤（LSW）和质外体洗涤部分（AWF）的逐步方案的示意图。该方法允许每次重复从三到六株植物中提取 LSW 和 AWF，同时从两个部分中始终产生等量的 RNA。为了测量细胞裂解物中的 RNA 浓度，我们利用 NanoDrop 分光光度法。然而，对于源自 LSW、LSS 和 AWF 的 RNA 样品，我们依赖于 SYBR 金染色聚丙烯酰胺凝胶的密度定量。此定量步骤是必要的，因为细胞外组分含有未知污染物（可能是多糖），有时会共纯化并干扰基于吸光度的 RNA 定量方法，从而导致 RNA 浓度被高估。为了克服这一限制，我们计划在未来的工作中使用非苯酚基的RNA纯化方法。

变性RNA凝胶分析显示，LSW和AWF中存在多种RNA物种，包括长RNA和小RNA（图3）。值得注意的是，从叶表和质外体部分成功分离出等效的 RNA 数量，每个植物的新鲜重量 （FW） 的 RNA 量归一化。令人惊讶的是，LSW 和 AWF 组分的 RNA 大小谱彼此之间以及总细胞裂解物 （CL） RNA 的谱显着不同。这些差异表明 exRNA 组分没有被细胞 RNA 污染。在3个组分中，质外RNA（AWF）的大小分布多样性最大，表明质外RNA比叶表RNA更降解。

为了进一步检查拟南芥叶子表面是否存在 RNA，我们使用了棉签。这种方法使我们能够分别依次地从近轴（上部）和远轴（下部）叶表面收集 RNA⁶。这些分析表明，两个叶子表面含有相似数量的 RNA。此外，无需离心即可通过从叶子表面吸收缓冲液来收集 RNA 的能力进一步支持了 RNA 确实位于叶子表面，而不是在离心过程中通过气孔提取的结论。

使我们能够提取大量叶子表面 RNA 的一项主要调整是添加润湿剂。在VIB中加入润湿剂（浓度极低，为0.001%）后，我们回收的RNA几乎是原来的两倍。使用和不使用 Silwet L-77 获得的 RNA 浓度的这种差异表明，使用润湿剂可以改善 RNA 在叶子表面的溶解。然而，将润湿剂的浓度从 0.001% 增加到 0.01% 并没有增强 LSW RNA 分离（图 4）。值得注意的是，从相同的叶子中重复分离LSW RNA会产生额外的RNA（约占第一次洗涤获得的回收率的63%），这表明叶子不断将RNA分泌到表面，其中近三分之二在处理叶子所需的大约30分钟内被替换。为了在植物材料有限时提高总LSW RNA产量，因此可以连续多次洗涤相同的叶子。不过，我们不建议洗涤超过三次，因为所涉及的处理可能会导致叶子材料的累积损坏，如洗涤液的绿色所评估的那样。对于这些实验，使用基于RNA凝胶的密度测定分析来估计RNA浓度。然而，在一次评估多个样品时，上述基于微量滴定板的RNA定量方法可用于RNA的准确定量（图5）。

讨论

该协议详细介绍了如何从健康的拟南芥莲座丛中分离叶表洗涤液（LSW），叶表拭子（LSS）和质外洗涤液（AWF），然后进行RNA提取。关键步骤包括在进行实验之前对 VIB 进行制备和灭菌，在受控条件下种植植物，以及使用 Silwet-L77 确保 VIB 正确覆盖叶子表面。这些程序应从 LSW 和 AWF 中产生等量的 RNA，并按叶鲜重归一化。从这些细胞外组分中回收 RNA 需要小心处理，特别是对于沉淀步骤后的 RNA 沉淀。

尽管上述协议已针对拟南芥叶子进行了优化，但我们也成功地将其用于其他植物物种，只需稍作修改。从叶片表面提取RNA可以通过实施两个主要调整来优化：首先，通过进行多轮LSW分离，其次，通过增加润湿剂的浓度。叶表面具有非常疏水性的植物物种，例如水稻^12,13，可能需要更高浓度的润湿剂。

此外，我们还描述了一种使用棉签收集叶子表面RNA的非侵入性方法。通过这种叶面RNA分离方法，我们确保将收集管放置在冰桶中。考虑到叶子表面的 RNA 在室温下分泌和积累，我们假设即使在收集过程中它也会保持稳定。我们还比较了LSW和LSS RNA的条带模式，它们在降解方面没有太大差异。

上述方案使用 TRIzol 试剂从 LSW、LSS 或 AWF 中纯化 RNA。该试剂使用苯酚去除蛋白质。然而，我们发现基于TRIzol的纯化不会去除LSW和AWF⁶中丰富的果胶等多糖。这种共纯化分子可能会导致使用分光光度法或荧光法进行 RNA 定量问题。因此，我们依靠基于RNA凝胶的密度测定分析来评估exRNA浓度。我们目前正在研究基于柱的纯化方法，这些方法应该可以更好地从多糖中分离 RNA。然而，这些方法通常限制了小 RNA 的回收，因为硅胶膜经过优化以结合大于 ~200 个核苷酸的 RNA 分子。小 RNA 可能会在结合过程中穿过膜或在洗涤步骤中丢失。因此，到目前为止，我们仅依靠基于TRIzol的方法来更全面地回收所有RNA大小，包括小RNA，尽管它需要小心处理和相分离。

此外，在进行RNA凝胶分析时，与AWF和LSW RNA相比，我们没有看到总细胞RNA样品的片段小于80 nt，这主要是由于相对于大量的rRNA和tRNA来说丰度较低。AWF和LSW中较小条带的存在是由于丰富的rRNA和tRNA的降解，这是在植物细胞外区室中RNA分泌后自然发生的，并且它不是在植物收集和处理过程中引入的伪影，如测序和Northern 印^迹分析所证实的6。

我们的叶面清洗分离方法是一种多功能工具，在广泛的研究应用中具有巨大的潜力。它应该能够从叶子表面分离出生物分子，例如 RNA、蛋白质和其他代谢物，这些代谢物可能对理解植物和微生物之间的相互作用至关重要。如果需要鉴定AWF和LSW中存在的微生物，可以通过消除通过0.22μm过滤器的过滤来实现。

植物与多种微生物相互作用，包括细菌、真菌和病毒，这些微生物在其表面形成复杂的群落¹。这些微生物群落可以对植物生长、抗病性和养分获取产生深远的影响^2,3,4。通过使用这种方法分离和分析叶子表面的洗涤，研究人员可以分离出 exRNA、微生物代谢物，识别叶子表面存在的微生物群落，并研究这些群落如何在分子水平上受到调节。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14-30 nt ssRNA 分子量标准品标记	宝	3416
1.5 mL 微量离心管	大众	20170-038
10 mL 无针注射器	屋宇 署	303347
15 mL 猎鹰管	大众	89039-668
15% Mini-PROTEAN TBE-尿素凝胶，10 孔/12 孔，30 和微量;L/20 & 微;L	生物辐射	4566053 / 4566055
36 单元托盘插件	真叶市场
40% 丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液，37.5：1	生物辐射	1610148
4英寸圆盆	真叶市场
50 mL 猎鹰管	大众	89039-656
50 mL 无针注射器	屋宇 署	309653
96孔板黑底	格雷尼尔	655090
Acrodisc 0.22 μM 针头过滤器	阴云	4192
Acrodisc 0.45 μM 针头过滤器	阴云	4454
过硫酸铵（APS）	西格玛-奥尔德里奇	A3678
氯化钙	西格玛-奥尔德里奇	C1016型
氯仿（不含 RNase）	马克龙精细化学品	MK444110
透明塑料圆顶	悍马国际	11 3348	任何塑料圆顶都可用于覆盖植物并保持湿度
医用级棉头棒	优林	型号：S-21102
乙醇（不含 Rnase）	德康实验室公司	2716GEA
法式压榨咖啡机，24 液量盎司	雪峰	CS-111型
无孔生长盘 10 x 20	真叶市场
冰桶	Schuett-Biotech， 海绵	3-680 052
异丙醇	Thermo Scientific	149320050
JA-14 固定角转子	贝克曼·库尔特;型号：JA-14	339247
金巾	KCWW，金佰利-克拉克	34120
低范围 ssRNA 梯子	NEB	N0364S型
MES水合物	西格玛-奥尔德里奇	型号M8250
酶标仪	百泰克	协同 H1
奇迹-格罗	奇迹-格罗	24-8-16	它是一种通用植物性食品。根据用于种植植物的土壤来源，可以调整施用。
Nalgene centifuge 瓶 250 mL（不带盖）	纳尔金	3120
纸巾
ParaFilm M Lab 薄膜	封口膜	型号：S-25929
塑料烧杯 （500 mL）	优林	型号：S-21658
无 RNase 糖原 （20 mg/mL）	Thermo Scientific	R0561
RootShield Plus WP 生物杀菌剂	生物工厂	68539-9
剪刀
西尔韦特 L-77	植物技术实验室	S7777	可以使用任何品牌的 Silwet L-77。然而，随着时间的推移，Silwet 会失去其功效。最好每年更换一次。
氯化钠	西格玛-奥尔德里奇	S7653
柔软的尼龙发刷	我们。艺术用品	第6号
喷雾瓶	优林	S-7272型	可以使用任何喷雾瓶，但喷雾设置应在淋浴时进行。
Sungro 专业种植混合物	Sungro
Sungro 繁殖混合物	Sungro
SYBR Gold 核酸凝胶染色剂（10,000 倍 DMSO 浓缩液）	Thermo Scientific	S11494
特梅德	Thermo Scientific	17919
TRIzol 试剂	Invitrogen	15596026
超纯 Dnase/无 Rnase 水	Invitrogen	10977015
尿素	西格玛-奥尔德里奇	U5378
真空室，0.20 立方英尺	SP Scienceware - Bel-Art 产品 - H-B 仪器	F42031-0000
真空泵，3.5 CFM	理想的真空产品	P101532
秤	埃斯卡利	WBB480535	这只是一个例子。可以使用任何体重秤。