离体 心脏和神经组织中兰尼碱受体2组装的单分子分析

摘要

本研究介绍了一种基于囊泡的单分子成像方法，该方法可保持受体的天然组织结构，实现精确的化学计量定量，并在受体组装、功能及疾病研究中具有广泛的应用前景。

摘要

理解受体组装对于阐明其在生理过程中功能与调控的机制至关重要。尽管传统方法 体外 单分子研究依赖于从异源表达系统中分离蛋白质，但这种方法常常无法捕捉到 体内 细胞表面蛋白组装与组织过程中涉及的生理复杂性。本方案采用全内反射荧光显微镜（TIRFM）研究包裹在纳米级囊泡中的GFP标记的兰尼碱受体2（RyR2）分子。这些囊泡来源于从动物体内快速提取的器官，能够有效捕捉受体在提取时刻的组装状态，从而实现对亚基化学计量比及受体组织结构在动物生理环境变化下响应情况的详细分析。该方法结合TIRFM与逐步光漂白分析，用于读取受体的化学计量信息。在单分子水平上对受体进行成像，有助于检测活体动物中组装受体群体内部的异质性，并可监测与疾病状态相关的组装变化。因此，该技术为研究受体组装形式的分布及其与生理环境变化之间的关联提供了强有力的工具。

引言

膜受体在人体各处的生理过程中发挥着关键作用¹。其主要功能是通过将细胞外刺激信号传递至细胞内，从而介导细胞间的通讯，启动细胞内信号转导事件。由于膜受体在信号转导中的基础性作用，现有近70%的治疗药物以膜受体为靶点²。这些受体通常是由多个亚基组装而成的寡聚结构，形成具有多种化学计量比的异源复合物^3,4。明确受体如何组装成功能性复合物，对于阐明其在健康与疾病状态中的作用至关重要^5,6。传统的生化方法（如免疫共沉淀和蛋白质印迹）仅能提供整体平均的测量结果，因而掩盖了受体亚群中的异质性⁷。相比之下，单分子技术能够直接观察单个受体分子，从而量化受体群体内部的异质性^8,9,10。单分子技术已成为定量分析膜受体组装、化学计量比及寡聚化状态的标准方法^11,12。该方法已被广泛....

方案

1. 样品制备

1. 心脏灌注与器官提取
   1. 使用 CO₂ 麻醉小鼠直至呼吸停止。
   2. 将小鼠置于仰卧位并固定四肢。
   3. 沿腹部正中线做切口并向肋骨方向横向延伸，以暴露胸腔。
   4. 小心将针头插入左心室，并剪开右心房以允许灌注液流出。
   5. 若用于囊泡制备，用冷的 1× PBS 灌注直至循环系统中的血液完全清除。
   6. 若用于冷冻切片，在 PBS 灌注后继续用 4% 多聚甲醛（PFA）灌注以固定组织。
   7. 小心取出心脏并立即置于冰上。
   8. 使用精细剪刀沿头皮正中线剪开，并向后剥离皮肤以暴露颅骨。
   9. 在枕骨大孔附近的颅底处做一切口。
   10. 使用精细镊子沿大脑纵裂小心撬开颅骨，移除骨碎片以暴露脑组织。
   11. 用弯头镊子轻轻提起脑组织，切断颅神经以完整取出脑组织。
   12. 若用于冷冻切片，将脑组织在 4 °C 下用 4% PFA 后固定 24 小时。
   13. 若用于囊泡制备，取出脑组织后立即置于冰上，不进行固定，以供后续处理。
2. 冷冻切片
   1. 将脑或心脏从 4% PFA 中取出并吸干表面液体。
   2. 将整个器官包埋于冷冻模具中的 OCT 包埋剂中。
   3. 将模具置于 -80 °C 超低温冰箱中，直至包埋组织完全....

结果

为验证该方法的适用性，我们首先通过共聚焦成像对心脏和神经组织冰冻切片中的GFP-RyR2表达及定位进行了验证（图1）。心脏组织中的荧光信号呈现出横向条纹状分布，符合RyR2在心肌细胞中的预期定位；而在脑组织中，某些区域（特别是皮层、海马和小脑）显示出较强的荧光强度，表明其表达具有区域特异性。

采用优化的制备方案从这些组织中生成囊泡后（图2A），我们利用纳米颗粒追踪分析（NTA）确认了各样本间囊泡尺寸分布的一致性，从而确保心脏来源与脑来源囊泡之间的可比性（图2B）。对固定化囊泡进行全内反射荧光（TIRF）显微成像显示，囊泡群体分布均匀且分散良好，背景荧光极低，验证了基于BAM的固定化策略在维持受体可及性方面的有效性（图3A

讨论

本研究建立了一种详细且可重复的方案，用于离体（ex vivo）包封膜受体并对其进行单分子成像，以GFP标记的RyR2为模型系统。该方案通过直接从天然组织中实现受体复合物的化学计量分析，显著改进了现有方法，同时保留了膜蛋白的生理环境。与传统的体外表达系统相比，该方法减少了因过表达或去垢剂溶解所引入的人为假象，从而能够更真实地揭示受体组装的生物学信息^5,8。

该方法的重要性在于其能够利用光漂白步数在单分子水平上检测受体化学计量比，从而分辨异质性群体并检测细微的结构变异。以往的单分子研究依赖于细胞培养或纯化的蛋白质；相比之下，本方法采用 freshly prepared vesicles，保留了靶向受体天然的脂质与蛋白质微环境，可提供受体结构的瞬时快照 体内.

我们改进了若干常见的实验步骤，以提高实验的可重复性和数据质量。首先，通过在酸性和碱性溶液中进行加热超声处理来优化玻璃表面的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 培养皿 | No. 1.5 盖玻片 | 14 mm 玻璃直径	Mattek	P35G-1.5-14-C
Andwin Scientific Tissue-Tek Cryomold 包埋模具/适配器	Fisher Scientific	NC9542860
APTES	Millipore Sigma	440140-100ML	(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷
Bio-Gen PRO200 实验室匀浆器	Pro Scientific	1204B59
cellSENS	Olympus Scientific Solutions	n/a
EMCCD 相机	Andor	n/a	iXon Ultra 897
分子生物学级无水乙醇 ≥100% (v/v) USP（200 证明度）	VWR	71006-012
Leica CM1860	Leica	n/a	冷冻切片机
MetaMorph Advanced	Molecular Devices	n/a
Nanosight NS300（配备 Nanosight NTA 软件）	Malvern Panalytical	n/a
Nikon AXR 倒置共聚焦显微镜	Nikon	n/a
Olympus IX83 电动自动对焦倒置荧光显微镜	Olympus	n/a	TIRFM
4% 多聚甲醛 PBS 即用型固定剂	VWR	76221-378
磷酸盐缓冲液 (PBS) 20x，超纯级	VWR	97062-950
氢氧化钠，珠状，试剂级	VWR	97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +	NOF America Corporation	n/a	油酰基-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Sakura	M71484
VectaMount AQ 水性封片介质	Vector Laboratories	H-5501-60