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离体 心脏和神经组织中兰尼碱受体2组装的单分子分析

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DOI：

10.3791/68408

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2025年7月15日

 , 
1Department of Chemistry, University of Kentucky

本文内容

摘要

本研究介绍了一种基于囊泡的单分子成像方法，该方法可保持受体的天然组织结构，实现精确的化学计量定量，并在受体组装、功能及疾病研究中具有广泛的应用前景。

摘要

理解受体组装对于阐明其在生理过程中功能与调控的机制至关重要。尽管传统方法 体外 单分子研究依赖于从异源表达系统中分离蛋白质，但这种方法常常无法捕捉到 体内 细胞表面蛋白组装与组织过程中涉及的生理复杂性。本方案采用全内反射荧光显微镜（TIRFM）研究包裹在纳米级囊泡中的GFP标记的兰尼碱受体2（RyR2）分子。这些囊泡来源于从动物体内快速提取的器官，能够有效捕捉受体在提取时刻的组装状态，从而实现对亚基化学计量比及受体组织结构在动物生理环境变化下响应情况的详细分析。该方法结合TIRFM与逐步光漂白分析，用于读取受体的化学计量信息。在单分子水平上对受体进行成像，有助于检测活体动物中组装受体群体内部的异质性，并可监测与疾病状态相关的组装变化。因此，该技术为研究受体组装形式的分布及其与生理环境变化之间的关联提供了强有力的工具。

引言

膜受体在人体各处的生理过程中发挥着关键作用1。其主要功能是通过将细胞外刺激信号传递至细胞内，从而介导细胞间的通讯，启动细胞内信号转导事件。由于膜受体在信号转导中的基础性作用，现有近70%的治疗药物以膜受体为靶点2。这些受体通常是由多个亚基组装而成的寡聚结构，形成具有多种化学计量比的异源复合物3,4。明确受体如何组装成功能性复合物，对于阐明其在健康与疾病状态中的作用至关重要5,6。传统的生化方法（如免疫共沉淀和蛋白质印迹）仅能提供整体平均的测量结果，因而掩盖了受体亚群中的异质性7。相比之下，单分子技术能够直接观察单个受体分子，从而量化受体群体内部的异质性8,9,10。单分子技术已成为定量分析膜受体组装、化学计量比及寡聚化状态的标准方法11,12。该方法已被广泛应用于多种具有重要生理意义的膜受体研究，通常在分离蛋白或细胞培养条件下进行。单分子研究主要依赖于体外（in vitro）表达系统，其中蛋白质可从细胞环境中分离出来。然而，这类异源表达系统并不能完全反映活体系统内的复杂性。

为了克服这些局限性，我们开发了一种方法，通过直接从心脏和神经组织来源的纳米囊泡中捕获膜受体，从而在生理相关状态下对其进行分离和成像。该方法能有效保存囊泡形成时受体的组装状态，实现对受体亚基化学计量比的直接可视化，而化学计量比是反映受体在不同生理环境中响应能力的关键指标。该方法使我们能够在无需异源表达或重组的情况下，研究活体动物复杂生物环境中发生的膜受体化学计量组装。通过采用全内反射荧光显微镜（TIRFM），我们实现了对囊泡包裹受体的单分子分辨率成像，并提取光漂白轨迹以确定其亚基组成。

全内反射荧光显微镜（TIRFM）非常适合单分子膜蛋白成像，因为它选择性地激发距离玻璃表面约150 nm范围内的荧光分子，从而减少溶液中分子产生的背景荧光3,10。这种激发光的局限性显著提高了信噪比，使得能够准确检测单个膜受体复合物。通过分析荧光标记受体的逐步光漂白过程，我们可以直接确定亚基的化学计量比，并评估受体群体内部可能存在的异质性12。这一点对于兰诺定受体2型（Ryanodine Receptor 2, RyR2）尤为重要。RyR2是一种大型胞内Ca²⁺释放通道，在心脏的兴奋-收缩耦联中发挥关键作用，此时它仅以同源四聚体形式组装；而在脑内的突触功能中，其组装方式尚未明确1,13,14。鉴于神经组织中存在多种RyR亚型，目前尚不清楚RyR2在脑内是否像在心脏中一样，仅形成由四个相同亚基组成的同源四聚体复合物，还是会在体内与RyR1或RyR3形成异源多聚体组装in vivo15,16,17,18。

通过分离心脏和脑部特定区域的囊泡，该方法能够研究RyR2在组织特异性结构上的潜在差异。我们利用RyR2在心肌组织中仅能形成同源四聚体的特性，为离体（ex vivo）单分子亚基化学计量分析提供统计学上稳健的基础；已知的四聚体组装结构可作为研究其他器官中未知组装形式的对照。在保持受体生理相互作用的同时，对其天然状态进行成像的能力，为研究不同器官及不同生理条件下受体组装提供了可靠的框架。本实验方案描述了囊泡分离、固定及GFP标记RyR2单分子成像的工作流程，可实现对受体化学计量的精确表征。该技术不仅加深了我们对RyR2在心肌和神经组织中组织结构的理解，也为研究多种生理和病理背景下受体的组装与调控提供了广泛的应用前景19，20，21。

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方案

1. 样品制备

  1. 心脏灌注与器官提取
    1. 使用 CO₂ 麻醉小鼠直至呼吸停止。
    2. 将小鼠置于仰卧位并固定四肢。
    3. 沿腹部正中线做切口并向肋骨方向横向延伸，以暴露胸腔。
    4. 小心将针头插入左心室，并剪开右心房以允许灌注液流出。
    5. 若用于囊泡制备，用冷的 1× PBS 灌注直至循环系统中的血液完全清除。
    6. 若用于冷冻切片，在 PBS 灌注后继续用 4% 多聚甲醛（PFA）灌注以固定组织。
    7. 小心取出心脏并立即置于冰上。
    8. 使用精细剪刀沿头皮正中线剪开，并向后剥离皮肤以暴露颅骨。
    9. 在枕骨大孔附近的颅底处做一切口。
    10. 使用精细镊子沿大脑纵裂小心撬开颅骨，移除骨碎片以暴露脑组织。
    11. 用弯头镊子轻轻提起脑组织，切断颅神经以完整取出脑组织。
    12. 若用于冷冻切片，将脑组织在 4 °C 下用 4% PFA 后固定 24 小时。
    13. 若用于囊泡制备，取出脑组织后立即置于冰上，不进行固定，以供后续处理。
  2. 冷冻切片
    1. 将脑或心脏从 4% PFA 中取出并吸干表面液体。
    2. 将整个器官包埋于冷冻模具中的 OCT 包埋剂中。
    3. 将模具置于 -80 °C 超低温冰箱中，直至包埋组织完全冻结。
    4. 切片前，将冷冻切片机腔室和样本头预冷至 -20 °C。
    5. 将冻结的 OCT 包埋块从 -80 °C 冰箱转移至冷冻切片机腔室，并平衡 10 分钟。
    6. 用 70% 乙醇清洁样本夹头，干燥后涂上一层薄 OCT 作为粘合剂。
    7. 将冻结的 OCT 包埋块牢固固定在夹头上，确保方向正确。
    8. 将夹头插入冷冻切片机的样本架中，并调整刀片位置。
    9. 修切多余的 OCT，直至组织表面暴露。
    10. 以 10 µm 厚度对组织进行切片，并将切片收集到载玻片上。
    11. 切片在室温下空气干燥 1 小时后，滴加封片剂并加盖盖玻片以密封样本。
    12. 待封片剂固化后，将载玻片于 4 °C 保存，以备成像使用。
  3. 囊泡制备
    1. 心脏囊泡制备
      1. 在用 1× PBS 进行心脏灌注后取出心脏，并置于冰上。
      2. 使用无菌手术刀从心脏底部切取约 30 mg 的心室肌组织。
      3. 将组织转移至含有 4–5 mL 10 mM NaHCO₃ 与 5 mM NaN₃ 的离心管中，以维持囊泡完整性。
      4. 使用匀浆器匀浆组织，直至完全裂解。
      5. 以 10,000 × g 离心 20 分钟，去除大颗粒碎片，收集上清液。
      6. 以 37,000 × g 超速离心 65 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于 3–4 mL 含 0.6 M KCl 的 20 mM Tris-马来酸缓冲液（pH 6.8）中。
      7. 再次以 37,000 × g 超速离心 65 分钟，以去除可溶性肌动球蛋白。
      8. 将最终沉淀重悬于 0.5 mL 含 50 mM KCl 的 20 mM Tris-马来酸缓冲液（pH 6.8）中，获得心脏囊泡溶液，并于 -80 °C 保存。
    2. 脑囊泡制备
      1. 在用 1× PBS 进行心脏灌注后取出脑组织，并置于冰上。
      2. 使用 1 mm 小鼠脑冠状切片模具将脑组织切成 1 mm 厚的切片。
      3. 从嗅球起数第三和第四片切片中，仔细分离：1）双侧半球最外层的皮质层；2）位于切片中央区域的海马体。
      4. 从后端开始，在小脑基部做一横向切口，分离出小脑。
      5. 合并五只小鼠的相同脑区组织，以确保获得足够的囊泡产量。
      6. 立即使用 Dounce 匀浆器在 2 mL 冷匀浆缓冲液（0.32 M 蔗糖，10 mM HEPES，2 mM EDTA，蛋白酶抑制剂，pH 7.4）中匀浆组织。
      7. 加入 3 mL 额外匀浆缓冲液，以 200 × g 离心 15 分钟，去除大块组织碎片。
      8. 收集上清液，于 4 °C 以 1,000 × g 离心 15 分钟，去除细胞核组分。
      9. 将上清液于 4 °C 以 10,000 × g 进一步离心 20 分钟，去除线粒体。
      10. 将所得上清液于 4 °C 以 100,000 × g 超速离心 2 小时，沉淀囊泡。
      11. 将最终的囊泡沉淀重悬于 1× PBS 中，获得脑囊泡溶液，并于 -80 °C 保存。
  4. 通过纳米颗粒追踪分析（NTA）表征纳米囊泡
    1. 按照制造商说明组装检测池。
    2. 打开仪器并启动配套软件。
    3. 用去离子水（DI 水）填充 1 mL 注射器，手动冲洗系统管路，直至背景无污染物。
    4. 将纳米囊泡样品用 1× PBS 稀释，制备待测样品。
    5. 将约 1 mL 稀释后的纳米囊泡样品装入洁净的 1 mL 注射器中，确保无气泡。
    6. 手动将样品注入检测池，并调节焦距，直至囊泡清晰可见。
    7. 将注射器固定在注射泵上，在硬件面板中将流速设置为200 µL/s。
    8. 在SOP面板中，将测量时长设为60 s，循环次数设为5，确认温度控制已启用并设定为25 °C。点击保存 SOP，将设置另存为新的 SOP 文件并命名（例如 "nanovesicle_standard.sop"）。
    9. 在“采集”面板中，通过选择相机水平为13和初始检测阈值为3来配置仪器参数。
    10. 点击运行，并选择之前保存的 SOP。软件将根据设定自动执行测量。
    11. 测量完成后，点击分析以处理每段视频。调整检测阈值以确保所有颗粒清晰可见，批量分析完成后点击完成。点击导出数据 | 所有测量导出结果，并保存为 CSV 文件以供后续使用。
    12. 实验结束后，用约 2 mL 去离子水冲洗系统，直至无残留囊泡。
    13. 通过管路注入空气以排出残留液体，确保系统干燥，以便下次使用。

2. 成像

  1. 组织冷冻切片的共聚焦成像
    1. 启动激光扫描共聚焦显微镜，并打开配套软件。
    2. 选择合适的物镜（20倍空气镜或60倍油镜），并将制备好的冷冻切片载玻片放置于显微镜载物台上。
    3. 配置GFP激发所需的激光参数，使用488 nm激光线和535/70 nm发射滤光片。
    4. 优化成像参数，包括针孔大小（28.9 µm）、激光强度（17%）和探测器增益（15.3），以提高信噪比，同时尽量减少光漂白。
    5. 如有需要，通过设定顶部和底部焦平面，并定义适当的步长（0.275 µm），采集Z轴层扫图像（Z-stack）。
    6. 在采集大视野图像时，启用自动图像拼接功能，并设置15%的图像重叠区域。
    7. 根据需要调整图像分辨率并应用帧平均处理，以降低背景噪声。
    8. 采集图像并以'.nd2'格式保存，用于后续分析。
  2. 全内反射荧光（TIRF）成像
    1. 通过生物相容性膜锚定（BAM）方法固定囊泡22
      1. 将35 mm玻璃底培养皿在5 M NaOH溶液中于45 °C超声处理1小时，随后用去离子水彻底冲洗三次。
      2. 再将培养皿在0.1 M HCl中于45 °C超声处理1小时，之后再用去离子水冲洗三次。
      3. 将清洗后的玻璃表面用含2% 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）的乙醇溶液在室温下处理30分钟，以引入氨基官能团。
      4. 用去离子水和乙醇各冲洗3次，去除多余的APTES，并使其自然干燥。
      5. 将培养皿与100 µM Oleyl-O(CH₂CH₂)nCO-CH₂CH₂-COO-NHS（Sunbright OE-020CS）在1×PBS中孵育10分钟。
      6. 用PBS洗涤培养皿，以去除未反应的试剂。
      7. 加入所需浓度的囊泡，孵育15分钟，使其结合到表面。
      8. 用PBS轻轻冲洗培养皿，去除未结合的囊泡，同时确保已固定的囊泡仍附着在表面。
    2. TIRF成像系统设置与图像采集
      1. 启动倒置荧光显微镜的488 nm激光光源和EMCCD相机。
      2. 运行Metamorph和CellSens软件，初始化成像控制系统。
      3. 用甲醇清洁60倍油浸物镜（1.49 NA APO），以去除灰尘和残留油渍。
      4. 在物镜前端滴加少量折射率（RI）匹配的浸油。
      5. 将制备好的囊泡培养皿放置于显微镜载物台上，确保其中心对准，以实现最佳光路对齐。
      6. 在落射荧光模式下，通过将激发光束对准物镜后焦平面中心来调节激光焦点。
      7. 使用步进电机调节激光入射角度，直至达到临界角，确保在玻璃表面发生全内反射。
      8. 通过Z轴扫描确定焦平面，区分：1）第一个焦点平面，对应玻璃底表面；2）第二个焦点平面，对应囊泡固定表面。
      9. 当囊泡处于清晰焦点时，在CellSens中启用自动对焦功能，锁定物镜在此平面的位置，防止成像过程中发生漂移。
      10. 暂时关闭激光，并将显微镜载物台移动至一个尚未暴露于激发光的新视野区域。
      11. 开始记录的同时重新打开激光，确保完整捕获光漂白全过程，避免预先曝光。
      12. 以以下参数采集图像：曝光时间：每帧100 ms，采集模式：每个视野连续采集900帧，增益设置：1,400。
      13. 对多个视野重复该过程，以确保获得足够的数据量。
      14. 将图像序列以TIFF格式保存，用于后续处理。

3. 图像处理与数据分析

  1. 共聚焦图像处理
    1. 在关联软件中打开获取的共聚焦图像。
    2. 调整查找表（LUT）设置，以优化亮度和对比度。
    3. 对所有图像统一应用相同的LUT调整，以保持视觉一致性。
  2. TIRF视频处理与荧光强度分析
    1. 用于可视化的视频处理
      1. 在ImageJ中打开获取的TIRF图像堆栈（TIFF格式）以进行可视化。
      2. 调整亮度和对比度以增强信号清晰度，确保荧光囊泡能够与背景清晰区分。
      3. 导出调整后的图像用于展示或进一步的定性分析。
    2. 光漂白步数分析
      1. 提取时间轨迹
        1. 打开名为 "getTimeTraces.m" 的MATLAB脚本（见补充文件1）并运行。在图形 用户界面（GUI）中，点击Load Movie，选择TIRF成像的.tiff文件以导入囊泡图像序列。
        2. 点击Find Peaks，自动识别单分子荧光信号。信号区域将在预览窗口中以圆圈标记。
        3. 点击Populate Data。这将把每个斑点的时间-强度轨迹导出为一个.xlsx文件，用于后续分析。
      2. 手动步数计数
        1. 运行"simpleGraph.m"脚本（见补充文件1）以启动GUI，点击Load Data Files，并选择在步骤3.2.2.1.3中生成的.xlsx文件。
        2. 检查左侧面板中显示的每条时间轨迹的光漂白步数。确保仅接受满足以下条件的轨迹进行分析：1）时间轨迹中至少包含一个明显的光漂白步；2）每步持续时间至少为1秒；3）步间强度差至少为漂白后强度标准差的3倍。
        3. 在右侧找到Step #字段，使用+或-按钮输入每条轨迹的光漂白步数。
        4. 完成每条轨迹的输入后，点击Next进入下一条轨迹。当所有轨迹处理完毕后，软件将自动生成并保存一个.txt文件，记录每条轨迹的步数。
      3. 步数统计汇总
        1. 运行"CombinedFiles.m"脚本（见补充文件1）以打开GUI。
        2. 在文本框中输入期望的汇总输出文件名称。
        3. 点击Combine multiple simpleGraph Results to one file。在文件浏览器中选择一个或多个由步骤3.2.2.2.3生成的.txt文件。脚本将自动整合所有步数数据，并生成一个汇总的.xlsx文件，显示单步、双步……等轨迹的出现频率。

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结果

为验证该方法的适用性，我们首先通过共聚焦成像对心脏和神经组织冰冻切片中的GFP-RyR2表达及定位进行了验证（图1）。心脏组织中的荧光信号呈现出横向条纹状分布，符合RyR2在心肌细胞中的预期定位；而在脑组织中，某些区域（特别是皮层、海马和小脑）显示出较强的荧光强度，表明其表达具有区域特异性。

采用优化的制备方案从这些组织中生成囊泡后（图2A），我们利用纳米颗粒追踪分析（NTA）确认了各样本间囊泡尺寸分布的一致性，从而确保心脏来源与脑来源囊泡之间的可比性（图2B）。对固定化囊泡进行全内反射荧光（TIRF）显微成像显示，囊泡群体分布均匀且分散良好，背景荧光极低，验证了基于BAM的固定化策略在维持受体可及性方面的有效性（图3A

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讨论

本研究建立了一种详细且可重复的方案，用于离体（ex vivo）包封膜受体并对其进行单分子成像，以GFP标记的RyR2为模型系统。该方案通过直接从天然组织中实现受体复合物的化学计量分析，显著改进了现有方法，同时保留了膜蛋白的生理环境。与传统的体外表达系统相比，该方法减少了因过表达或去垢剂溶解所引入的人为假象，从而能够更真实地揭示受体组装的生物学信息5,8。

该方法的重要性在于其能够利用光漂白步数在单分子水平上检测受体化学计量比，从而分辨异质性群体并检测细微的结构变异。以往的单分子研究依赖于细胞培养或纯化的蛋白质；相比之下，本方法采用 freshly prepared vesicles，保留了靶向受体天然的脂质与蛋白质微环境，可提供受体结构的瞬时快照 体内.

我们改进了若干常见的实验步骤，以提高实验的可重复性和数据质量。首先，通过在酸性和碱性溶液中进行加热超声处理来优化玻璃表面的...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

我们感谢肯塔基大学光学显微镜核心设施以及生物电子学与纳米医学中心提供设施支持。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）（项目编号：GM138837 和 GM138882）的资助。图2（https://BioRender.com/s69w811）和 图3（https://BioRender.com/y54b47）使用BioRender软件绘制。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35 mm 培养皿 | No. 1.5 盖玻片 | 14 mm 玻璃直径MattekP35G-1.5-14-C
Andwin Scientific Tissue-Tek Cryomold 包埋模具/适配器Fisher ScientificNC9542860
APTESMillipore Sigma440140-100ML(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷
Bio-Gen PRO200 实验室匀浆器Pro Scientific1204B59
cellSENSOlympus Scientific Solutionsn/a
EMCCD 相机Andorn/aiXon Ultra 897
分子生物学级无水乙醇 ≥100% (v/v) USP（200 证明度）VWR71006-012
Leica CM1860Leican/a冷冻切片机
MetaMorph AdvancedMolecular Devicesn/a
Nanosight NS300（配备 Nanosight NTA 软件）Malvern Panalyticaln/a
Nikon AXR 倒置共聚焦显微镜Nikonn/a
Olympus IX83 电动自动对焦倒置荧光显微镜Olympusn/aTIRFM
4% 多聚甲醛 PBS 即用型固定剂VWR76221-378
磷酸盐缓冲液 (PBS) 20x，超纯级VWR97062-950
氢氧化钠，珠状，试剂级VWR97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +NOF America Corporationn/a油酰基-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂SakuraM71484
VectaMount AQ 水性封片介质Vector LaboratoriesH-5501-60

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