本方案描述了使用CTAB法从分枝杆菌中提取高质量DNA的方法，克服了其富含分枝菌酸、结构坚韧的细胞壁所带来的提取困难。该过程包括酶消化、CTAB裂解细胞、以及通过有机萃取和乙醇沉淀进行DNA纯化。该方法所获得的DNA适用于分子生物学研究，是分枝杆菌研究中可靠的技术手段。
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摘要
摘要
高效且可靠的DNA提取是分子生物学中的基础步骤，可为PCR、测序和基因组分析等下游应用提供高质量的遗传物质。然而，分枝杆菌独特的细胞壁结构富含脂质和分枝菌酸，给高效DNA分离带来了显著挑战。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法因其能从包括快速和缓慢生长菌株在内的多种分枝杆菌中提取高纯度DNA而被广泛应用。该方法首先使用溶菌酶和蛋白酶K对细菌细胞进行酶解破壁，随后利用CTAB裂解细胞组分，CTAB可选择性地与多糖和蛋白质结合并形成复合物。通过有机溶剂抽提和乙醇沉淀实现DNA的纯化与浓缩。根据我们的数据，CTAB方法可获得高产量的DNA（200 – 1000 ng/µL），且质量高、污染极少，经琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop分析证实。从不同分枝杆菌物种中提取的DNA纯度高，适用于多种分子生物学研究。本研究详细展示了CTAB方法的操作步骤，突出了其在克服分枝杆菌DNA提取特有挑战方面的实用性。
引言
提取高质量DNA是分子生物学中的一项基本步骤，对于PCR、全基因组测序及其他基因组学研究等下游应用至关重要。对于分枝杆菌属（Mycobacterium）而言，由于其细胞壁厚、富含脂质且具有疏水性，DNA提取具有较大挑战性；该属包括结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tuberculosis）等致病菌种，以及耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，M. smegmatis）等非致病性环境菌种1,2,3。这种坚韧的细胞壁需要采用特殊的裂解方法，才能有效破坏细胞并释放基因组DNA。
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法已被证实可从多种分枝杆菌中可靠地分离出高质量DNA4,5。CTAB是一种阳离子表面活性剂，能够结合多糖及其他细胞组分，从而在提取过程中促进其去除6。即使对于难以处理的样本，基于CTAB的实验方案也能高效地分离出完整且纯净的DNA，尤其是在结合酶解、热处理和有机溶剂抽提时效果更佳7,8。CTAB方法在分枝杆菌DNA高效提取中发挥了关键作用，特别适用于需要高纯度和高质量DNA作为起始材料的全基因组测序、宏基因组学和分子诊断研究9,10。与其他DNA提取技术（如珠击法或商用试剂盒）相比，本文所介绍的CTAB方案在保持DNA完整性方面具有明显优势，而DNA完整性是长读长测序和表观遗传学应用中的关键因素。尽管早期研究报道CTAB法所得DNA产量低于机械破碎法，但同时也强调了其在减少DNA剪切、维持DNA完整性方面的优势11,12。为克服纯度和产量方面的局限性，本实验方案已通过缩短孵育时间、提高在不同类型样本间的一致性进行了优化。该优化得到了Opperman等人的研究支持，他们证明从Mycobacterium avium培养物中提取的CTAB-DNA浓度和质量足以满足下游应用需求，如16S rRNA测序和线探针杂交检测，进一步证实CTAB方案可作为分枝杆菌研究中一种多功能且可扩展的工具，尤其适用于需要完整基因组DNA进行高级分子分析的研究13。此外，下一代测序（NGS）通常需要100–1000 ng的高质量基因组DNA14，而对于PacBio测序等长读长测序技术，则需要≥5 µg的高质量DNA15，因此当需要大量高质量且完整的DNA时，CTAB法仍是一种有效的提取方法16。
建立高效、稳定且有效的DNA提取方法，从难以裂解的微生物中提取DNA，对于确保实验室间结果的可重复性和可靠性至关重要，尤其是在菌株鉴定和流行病学研究中5,7。本方案详细介绍了利用CTAB法从分枝杆菌中提取全基因组DNA的步骤。当前方案旨在帮助研究人员克服分枝杆菌独特细胞壁所带来的技术难点和挑战，从而在分子生物学实验流程中获得稳定且可靠的结果17。
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方案
代表性结果的获得已得到斯泰伦博斯大学BES伦理委员会（BES-2024-22504）的批准。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 分枝杆菌培养物悬液的制备
注意：根据所检测的物种，该步骤必须在生物安全二级（BSL-2）或生物安全三级（BSL-3）实验室中进行。培养时间及培养条件也取决于分枝杆菌物种的生长需求，因其生长速率和生理特性各不相同。
- 分别准备5 mL或8 mL的细菌培养物，使用添加了OADC的Middlebrook 7H9液体培养基或MGIT培养基，并在37 °C下孵育所需时间以促进细菌生长。缓慢生长的分枝杆菌需要10–14天，而快速生长的分枝杆菌大约需要2–5天。
注意：如果起始培养物来自固体琼脂平板（例如Middlebrook 7H10琼脂），可通过将一环菌落刮入无菌双蒸水中来制备分枝杆菌细胞悬液。 - 将液体培养物倒入15 mL离心管中。
- 在培养箱中于80 °C加热灭活培养物1小时。
- 对于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）或其他需要在BSL-3条件下操作的病原菌种，将加热灭活后的培养物转移至BSL-2实验室。
2. 细胞壁消化与DNA提取
注意：培养物经热灭活后，后续步骤可在生物安全二级（BSL-2）实验室中安全进行。若提取目的是用于长读长测序或其他需要高分子量 DNA 的应用，请务必使用宽口吸头；在涡旋步骤中，应以颠倒混匀或移液器混匀代替涡旋振荡。
- 将15 mL离心管在室温下以3220 × g 离心15–30分钟。弃去澄清的上清液（确保完全去除所有培养基）。
- 用300 µL Tris-EDTA（TE）缓冲液充分重悬菌体沉淀。
- 将重悬后的沉淀转移至2 mL离心管中。
- 加入100 µL溶菌酶（10 mg/mL），通过移液器上下吹打5次混匀，然后轻轻弹击管壁以确保均匀分散。
- 将混合物置于37 °C旋转孵育器中过夜孵育（约16小时；孵育时间较短可能会降低裂解效率，从而导致DNA得率降低）。
- 次日，配制5 µL蛋白酶K（10 mg/mL）与70 µL 10% SDS的混合液。例如，若有五个样品，则配制350 µL 10% SDS和25 µL蛋白酶K。通过翻转离心管混匀，避免产生泡沫。
- 向每个样品中加入75 µL上述混合液。
- 轻轻弹击混匀，然后在65 °C孵育器或加热块中孵育10分钟，期间间歇性翻转混匀。
- 加入100 µL 5 M NaCl。
- 加入100 µL预热至65 °C的CTAB/NaCl溶液。
注意：由于该物质在室温下黏稠，为确保移液准确性，应在使用前将CTAB/NaCl溶液加热至65 °C。 - 轻轻弹击混匀，直至溶液变为乳白色。
- 在65 °C孵育器或加热块中孵育10分钟，期间间歇性翻转混匀。
- 向每个样品中加入等体积（约675 µL）的氯仿/异戊醇溶液（24:1），并通过弹击管壁混匀。
注意：此步骤应在通风橱中进行，因为氯仿具有毒性，吸入有害，操作时需谨慎。 - 将样品在室温下以12000 × g 离心10分钟。
- 小心吸取550–600 µL水相（上层）至无菌的1.5 mL离心管中，并做好相应标记。
注意：注意不要扰动其他层。若不慎破坏分层，需再次离心。
3. DNA 沉淀与洗脱
- 加入等体积（550–600 µL）预冷的异丙醇，通过倒置离心管混匀。
注意：若DNA浓度较高，混匀过程中可能形成白色沉淀。 - 将离心管置于 -20 °C 孵育 30 分钟至 1 小时。
注意：延长孵育时间可增强DNA沉淀18，但也可能导致盐类共沉淀。因此，若预期DNA浓度较低，可进行过夜孵育。 - 在室温下以最高速度（约 21130 × g）离心 30 分钟，使不溶性DNA形成沉淀。
注意：确保1.5 mL离心管的正面朝向离心转子内侧。此步骤中，DNA沉淀位于管底及管壁后侧。此方向至关重要，以便在下一步中避免扰动可能不可见的沉淀。若DNA浓度较高，可能观察到白色沉淀或团块；但无可见沉淀并不表示提取失败，应继续后续步骤。 - 从管的正面小心吸取上清液，避免扰动DNA沉淀，或快速倾倒上清液，同时确保沉淀不被破坏。
注意：若起始培养物体积较小且预期DNA浓度较低，建议采用吸取方式去除上清液。 - 向每管中加入 1000 µL 预冷的 75% 乙醇。
- 通过反复倒置离心管进行混匀。
- 以 12000 × g 离心 30 分钟（离心方向与步骤3相同）。
- 小心吸取或倾倒去除全部乙醇，避免扰动沉淀。
注意：若预期存在较高程度的盐类共沉淀，可重复步骤5–8。 - 将离心管在室温下静置晾干，过夜或至少 30 分钟。
- 向每管中加入 25–50 µL TE 缓冲液（pH 8），以重悬DNA。
注意：若下游应用对EDTA敏感，可用Tris缓冲液（10 mM，pH 8）或无核酸酶水替代TE缓冲液重悬DNA。 - 将DNA沉淀在 4 °C 下静置过夜，使其充分重悬。
- 在进行质量控制评估前，于 4 °C 保存 2–3 天。
- 长期保存应置于 -80 °C。
4. DNA 定量与质量控制
注意：DNA 质量控制通常使用微量分光光度计和凝胶电泳进行。也可采用基于荧光的定量系统对提取的 DNA 进行定量。
- 分光光度计法
- 按照制造商说明书测定DNA浓度并评估其质量。
注意：理想的DNA样品其260/280比值应在1.7至2.0之间。通常认为1.8为DNA纯度较高的数值。低于该范围的数值可能表明存在残留蛋白质、胍盐或其他在280 nm附近有强吸收的试剂污染。260/230比值在2.0–2.2之间为最佳。若该比值低于预期，则可能表明存在在230 nm处有吸收的污染物，如EDTA、苯酚和碳水化合物。同时应检查样品所获得的吸光度图谱。
- 按照制造商说明书测定DNA浓度并评估其质量。
- 凝胶电泳
- 进行琼脂糖凝胶电泳19，以评估DNA完整性，并判断是否发生片段化或降解。
- 在紫外凝胶成像系统下观察DNA时，使用含SYBR Safe染料的1.0%琼脂糖凝胶。以80 V电压电泳45分钟。
注意：目标是获得清晰、分明、高于DNA Marker最高条带的高分子量条带。每次均应使用新鲜的1× TAE缓冲液。
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结果
本研究采用CTAB法（图1）对包括结核分枝杆菌（M. tuberculosis）、脓肿分枝杆菌（M. abscessus）和嗜铬分枝杆菌（M. chelonea）在内的多种分枝杆菌进行了DNA提取。对所提取DNA的产量、纯度及完整性在不同样本间进行了比较分析。
不同分枝杆菌物种的DNA浓度存在差异，范围在190–600 ng/µL之间，某些情况下超过>1000 ng/µL，表明CTAB法可提取高产量的DNA。260/280和260/230比值分别在1.9–2.0和1.8–2.2之间，表明DNA纯度较高（表1）。分光光度计显示在260 nm处出现单一吸收峰（图2B）。这些结果表明，CTAB法能够从多种分枝杆菌物种中有效提取高产量且高纯度的DNA。此外，还采用琼脂糖凝胶电泳评估所分离DNA的完整性。一条清晰、分明、高分子量且完整的条带（
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讨论
代表性结果表明，CTAB 法在提取分枝杆菌属 DNA 以及应对从这些生物体中提取 DNA 所面临的挑战方面具有实用价值。分枝杆菌 以其结构复杂且富含脂质的细胞壁而著称2。本研究结果突出了该技术取得成功所依赖的多个关键方面，能够获得高浓度、高质量的完整 DNA，适用于 PCR、测序及其他基因组学研究等下游应用。
CTAB-DNA 提取方法已被证实是一种有效且可靠的方案，可安全地从多种分枝杆菌中获得高质量、完整的基因组 DNA4,10。该方案中的若干关键步骤直接影响 DNA 的提取质量和产量。分枝杆菌的细胞壁具有多层分枝菌酸和疏水性成分，这给 DNA 的释放带来了显著挑战。本方法中的一个关键步骤是使用溶菌酶、SDS 和蛋白酶 K 进行初始细胞裂解，这对于破坏富含脂质、结构坚韧的分枝杆菌细胞壁至关重要20。此外，在 65 °C 下进行热处理有助于裂解，尤其适用于细胞壁...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者们诚挚感谢结核病基因组学团队：Nabila Ismail、Melanie Grobbelaar、Emylin Costa 和 Rob M Warren，感谢他们对本实验方案的开发与优化所做出的贡献，以及在本研究过程中提供的宝贵支持。本研究工作及相关研究人员得到了南非医学研究理事会（SAMRC）、国家研究基金会（NRF）和斯泰伦博斯大学（SU）的资助。资助方在研究设计、数据收集、分析以及论文撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 移液器吸头 | 任何供应商 | ||
| 10 µL型移液器吸头 | 任何供应商 | ||
| 10% 十二烷基硫酸钠（SDS） | 默克（Sigma-Aldrich） | 71736-100 ML | |
| 15 mL 聚丙烯管 | 任何供应商 | ||
| 2 ml 离心管和 1.5 ml 离心管 | 任何供应商 | ||
| 200 µ移液器吸头 | 任何供应商 | ||
| 2-丙醇，分子生物学试剂&& | 默克（Sigma-Aldrich） | I9516-1L | -20℃保存 °C |
| 37°C孵箱 | 任何供应商 | ||
| 5 M NaCl | 默克（Sigma-Aldrich） | S6546 - 100 mL | |
| 65°C孵箱 | 任何供应商 | ||
| 琼脂糖凝胶 | 默克（Sigma-Aldrich） | ||
| 伯乐（Bio-Rad）紫外凝胶成像系统， | 伯乐（BioRad） | ||
| 离心机（适用于15 ml或50 ml离心管）和微型离心机（适用于2 ml离心管） | 任何供应商 | ||
| 分析用氯仿 EMPARTA® 美国化学会 | 默克（Sigma-Aldrich） | 1070242500 | |
| 氯仿/异戊醇（24:1） | 在通风橱中，混合 384 ml 氯仿和 16 ml 异戊醇 | ||
| CTAB/NaCl 溶液 | 默克（Sigma-Aldrich） | 52370-100 G | 将4.1 g NaCl溶解于80 ml蒸馏水中。在搅拌条件下加入10 g CTAB。将溶液在65°C 培养箱。用蒸馏水定容至 100 ml。室温保存，可稳定存放长达 6 个月。 |
| DNA 1 Kb Ladder | 赛默飞世尔科技 | ||
| 纯乙醇，200 证明，用于分子生物学&& | 默克（Sigma-Aldrich） | E7023-500ML | 将75 ml无水乙醇与25 ml蒸馏水混合 |
| 溶菌酶（10 mg/ml） | 默克（Sigma-Aldrich） | 10837059001 | 将冻干溶菌酶（恢复至室温）用蒸馏水重悬至 10 mg/ml |
| Middlebrook 7H9 培养基 | 默克（Sigma-Aldrich） | M0178 | 遵循制造商的说明制备液体培养基 |
| MIDDLEBROOK OADC 增菌液 6 × 100 ml F | BD | 212240 | |
| 分枝杆菌生长指示管（MGIT）培养基 | BD | 245122 | |
| NanoDrop 系统 | 赛默飞世尔科技 | ||
| P10 移液器 | 任何供应商 | ||
| P1000 移液器 | 任何供应商 | ||
| P200 移液器 | 任何供应商 | ||
| 蛋白酶K，重组，PCR级 2x250mg | 默克（Sigma-Aldrich） | 3115801001 | 将冻干的蛋白酶K小瓶用蒸馏水重悬至10 mg/ml。分装后于-20℃在2 ml离心管中冷冻保存 °C |
| SYBR-safe | 赛默飞世尔科技 | ||
| Tris/EDTA（TE）缓冲液，pH 8.0 | 默克（Sigma-Aldrich） | 8890-OP 或 382499997 | |
| 涡旋混合 | 任何供应商 |
参考文献
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