本方案描述了使用CTAB法从分枝杆菌中提取高质量DNA的方法，克服了其富含分枝菌酸、结构坚韧的细胞壁所带来的提取困难。该过程包括酶消化、CTAB裂解细胞、以及通过有机萃取和乙醇沉淀进行DNA纯化。该方法所获得的DNA适用于分子生物学研究，是分枝杆菌研究中可靠的技术手段。
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摘要
摘要
高效且可靠的DNA提取是分子生物学中的基础步骤，可为PCR、测序和基因组分析等下游应用提供高质量的遗传物质。然而，分枝杆菌独特的细胞壁结构富含脂质和分枝菌酸，给高效DNA分离带来了显著挑战。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法因其能从包括快速和缓慢生长菌株在内的多种分枝杆菌中提取高纯度DNA而被广泛应用。该方法首先使用溶菌酶和蛋白酶K对细菌细胞进行酶解破壁，随后利用CTAB裂解细胞组分，CTAB可选择性地与多糖和蛋白质结合并形成复合物。通过有机溶剂抽提和乙醇沉淀实现DNA的纯化与浓缩。根据我们的数据，CTAB方法可获得高产量的DNA（200 – 1000 ng/µL），且质量高、污染极少，经琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop分析证实。从不同分枝杆菌物种中提取的DNA纯度高，适用于多种分子生物学研究。本研究详细展示了CTAB方法的操作步骤，突出了其在克服分枝杆菌DNA提取特有挑战方面的实用性。
引言
提取高质量DNA是分子生物学中的一项基本步骤，对于PCR、全基因组测序及其他基因组学研究等下游应用至关重要。对于分枝杆菌属（Mycobacterium）而言，由于其细胞壁厚、富含脂质且具有疏水性，DNA提取具有较大挑战性；该属包括结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tuberculosis）等致病菌种，以及耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，M. smegmatis）等非致病性环境菌种1,2,3。这种坚韧的细胞壁需要采用特殊的裂解方法，才能有效破坏细胞并释放基因组DNA。
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法已被证实可从多种分枝杆菌中可靠地分离出高质量DNA4,5。CTAB是一种阳离子表面活性剂，能够结合多糖及其他细胞组分，从而在提取过程中促进其去除6。即使对于难以处理的样本，基于CTAB的实验方案也能高效地分离出完整且纯净的DNA，尤其是在结合酶解、热处理和有机溶剂抽提时效果更....
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方案
代表性结果的获得已得到斯泰伦博斯大学BES伦理委员会（BES-2024-22504）的批准。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 分枝杆菌培养物悬液的制备
注意：根据所检测的物种，该步骤必须在生物安全二级（BSL-2）或生物安全三级（BSL-3）实验室中进行。培养时间及培养条件也取决于分枝杆菌物种的生长需求，因其生长速率和生理特性各不相同。
- 分别准备5 mL或8 mL的细菌培养物，使用添加了OADC的Middlebrook 7H9液体培养基或MGIT培养基，并在37 °C下孵育所需时间以促进细菌生长。缓慢生长的分枝杆菌需要10–14天，而快速生长的分枝杆菌大约需要2–5天。
注意：如果起始培养物来自固体琼脂平板（例如Middlebrook 7H10琼脂），可通过将一环菌落刮入无菌双蒸水中来制备分枝杆菌细胞悬液。 - 将液体培养物倒入15 mL离心管中。
- 在培养箱中于80 °C加热灭活培养物1小时。
- 对于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）或其他需要在BSL-3条件下操作的病原菌种，将加热灭活后的培养物转移至BSL-2实验室。
2. 细....
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结果
本研究采用CTAB法（图1）对包括结核分枝杆菌（M. tuberculosis）、脓肿分枝杆菌（M. abscessus）和嗜铬分枝杆菌（M. chelonea）在内的多种分枝杆菌进行了DNA提取。对所提取DNA的产量、纯度及完整性在不同样本间进行了比较分析。
不同分枝杆菌物种的DNA浓度存在差异，范围在190–600 ng/µL之间，某些情况下超过>1000 ng/µL，表明CTAB法可提取高产量的DNA。260/280和260/230比值分别在1.9–2.0和1.8–2.2之间，表明DNA纯度较高（表1）。分光光度计显示在260 nm处出现单一吸收峰（图2B）。这些结果表明，CTAB法能够从多种分枝杆菌物种中有效提取高产量且高纯度的DNA。此外，还采用琼脂糖凝胶电泳评估所分离DNA的完整性。一条清晰、分明、高分子量且完整的条带（
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讨论
代表性结果表明，CTAB 法在提取分枝杆菌属 DNA 以及应对从这些生物体中提取 DNA 所面临的挑战方面具有实用价值。分枝杆菌 以其结构复杂且富含脂质的细胞壁而著称2。本研究结果突出了该技术取得成功所依赖的多个关键方面，能够获得高浓度、高质量的完整 DNA，适用于 PCR、测序及其他基因组学研究等下游应用。
CTAB-DNA 提取方法已被证实是一种有效且可靠的方案，可安全地从多种分枝杆菌中获得高质量、完整的基因组 DNA4,10。该方案中的若干关键步骤直接影响 DNA 的提取质量和产量。分枝杆菌的细胞壁具有多层分枝菌酸和疏水性成分，这给 DNA 的释放带来了显著挑战。本方法中的一个关键步骤是使用溶菌酶、SDS 和蛋白酶 K 进行初始细胞裂解，这对于破坏富含脂质、结构坚韧的分枝杆菌细胞壁至关重要20。此外，在 65 °C 下进行热处理有助于裂解，尤其适用于细胞壁.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者们诚挚感谢结核病基因组学团队：Nabila Ismail、Melanie Grobbelaar、Emylin Costa 和 Rob M Warren，感谢他们对本实验方案的开发与优化所做出的贡献，以及在本研究过程中提供的宝贵支持。本研究工作及相关研究人员得到了南非医学研究理事会（SAMRC）、国家研究基金会（NRF）和斯泰伦博斯大学（SU）的资助。资助方在研究设计、数据收集、分析以及论文撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 移液器吸头 | 任何供应商 | ||
| 10 µL型移液器吸头 | 任何供应商 | ||
| 10% 十二烷基硫酸钠（SDS） | 默克（Sigma-Aldrich） | 71736-100 ML | |
| 15 mL 聚丙烯管 | 任何供应商 | ||
| 2 ml 离心管和 1.5 ml 离心管 | 任何供应商 | ||
| 200 µ移液器吸头 | 任何供应商 | ||
| 2-丙醇，分子生物学试剂&& | 默克（Sigma-Aldrich） | I9516-1L | -20℃保存 °C |
| 37°C孵箱 | 任何供应商 | ||
| 5 M NaCl | 默克（Sigma-Aldrich） | S6546 - 100 mL | |
| 65°C孵箱 | 任何供应商 | ||
| 琼脂糖凝胶 | 默克（Sigma-Aldrich） | ||
| 伯乐（Bio-Rad）紫外凝胶成像系统， | 伯乐（BioRad） | ||
| 离心机（适用于15 ml或50 ml离心管）和微型离心机（适用于2 ml离心管） | 任何供应商 | ||
| 分析用氯仿 EMPARTA® 美国化学会 | 默克（Sigma-Aldrich） | 1070242500 | |
| 氯仿/异戊醇（24:1） | 在通风橱中，混合 384 ml 氯仿和 16 ml 异戊醇 | ||
| CTAB/NaCl 溶液 | 默克（Sigma-Aldrich） | 52370-100 G | 将4.1 g NaCl溶解于80 ml蒸馏水中。在搅拌条件下加入10 g CTAB。将溶液在65°C 培养箱。用蒸馏水定容至 100 ml。室温保存，可稳定存放长达 6 个月。 |
| DNA 1 Kb Ladder | 赛默飞世尔科技 | ||
| 纯乙醇，200 证明，用于分子生物学&& | 默克（Sigma-Aldrich） | E7023-500ML | 将75 ml无水乙醇与25 ml蒸馏水混合 |
| 溶菌酶（10 mg/ml） | 默克（Sigma-Aldrich） | 10837059001 | 将冻干溶菌酶（恢复至室温）用蒸馏水重悬至 10 mg/ml |
| Middlebrook 7H9 培养基 | 默克（Sigma-Aldrich） | M0178 | 遵循制造商的说明制备液体培养基 |
| MIDDLEBROOK OADC 增菌液 6 × 100 ml F | BD | 212240 | |
| 分枝杆菌生长指示管（MGIT）培养基 | BD | 245122 | |
| NanoDrop 系统 | 赛默飞世尔科技 | ||
| P10 移液器 | 任何供应商 | ||
| P1000 移液器 | 任何供应商 | ||
| P200 移液器 | 任何供应商 | ||
| 蛋白酶K，重组，PCR级 2x250mg | 默克（Sigma-Aldrich） | 3115801001 | 将冻干的蛋白酶K小瓶用蒸馏水重悬至10 mg/ml。分装后于-20℃在2 ml离心管中冷冻保存 °C |
| SYBR-safe | 赛默飞世尔科技 | ||
| Tris/EDTA（TE）缓冲液，pH 8.0 | 默克（Sigma-Aldrich） | 8890-OP 或 382499997 | |
| 涡旋混合 | 任何供应商 |
参考文献
- FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
- Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the ....
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