Method Article

一种基于 GFP 互补的双表达系统，用于评估活果 蝇 翅假想盘中细胞介素介导的细胞间接触

DOI:

10.3791/68411

⸱

August 22nd, 2025

 , 
1Institut de recherches cliniques de Montréal (IRCM), 2Programmes de biologie moléculaire, Université de Montréal, 3Département de Médecine, Université de Montréal

In This Article

Summary

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我们描述了一种协议，用于使用基于GFP重建的方法测量活果蝇翅假想盘中相邻上皮层细胞之间的接触。

Abstract

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胚胎组织的生长和图案化在很大程度上由组织本身内细胞群之间局部交换的信号控制。细胞介素是一种信号丝状伪足，首先在果蝇中发现，它连接和介导信号产生细胞和信号接收细胞之间的交换。在发育中的果蝇翅假想盘中，细胞介素参与椎间盘内不同细胞群之间的信号交换，这将形成成体翅，以及 DP 细胞和相邻椎间盘相关组织中的细胞之间的信号交换。细胞介素与靶细胞突触形成亲密的膜接触。

在这里，我们提出了一种方案，用于量化DP细胞与相邻足周膜（PerM）上皮细胞之间的细胞介导的接触，该细胞通过椎间盘腔与DP细胞分离，在活翼盘中使用GFP重建方法。使用 GAL4-UAS 和 LexA-LexAop 系统，分裂 GFP 的互补片段（spGFP1-10、spGFP11）在椎间盘腔的两侧表达，每个片段都融合到 CD4 的跨膜结构域。然后通过共聚焦显微镜对活翼盘制备中重构的GFP荧光进行成像，以生成图像堆栈，从中可以定位和量化重构的GFP荧光。使用该系统，可以在产生细胞介素的细胞或靶细胞中共表达蛋白质编码或RNA干扰转基因，以衡量它们对DP-PerM细胞接触的影响。该系统易于适应其他组织，因此能够识别对细胞介素形成或功能很重要的因素。

Introduction

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胚胎组织的发育由位于“组织中心”的细胞控制，这些细胞向组织内的远处细胞发出信号，控制它们增殖（即生长和分裂）或采用特定命运的决定1。这种细胞非自主信号传导是由组织中心细胞产生的配体介导的，这些配体通过组织形成浓度梯度并引发浓度依赖性反应。在许多情况下，这些配体要么通过称为细胞介素的长肌动蛋白信号丝状伪足递送或拾取，细胞介素连接组织中的信号发送和接收细胞2,3。细胞介素首次发现于果蝇翅想象盘4，在哺乳动物和其他脊椎动物中也被鉴定出 5,6,7,8,9。在早期阶段，更好地了解细胞介素在细胞非自主信号传导中的作用对于破译细胞如何通讯以组织成组织以及这些通讯线如何在各种病理条件下（包括发育畸形和癌症）中被修饰至关重要。

细胞介素可以从源细胞延伸至将配体递送至靶细胞，或从靶细胞延伸至接收....

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Protocol

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nubbin-GAL4 驱动器用于在 DP 的翼袋区域特异性表达 CD4-spGFP1-10（图 1A）。PerM-LexA驱动程序21用于在PerM中特异性表达CD4-spGFP11（图1A）。这两个表达系统彼此独立，允许在DP和PerM中同时和特异性表达不同的转基因（图1B，C）。

基本遗传方案包括杂交苍蝇产生基因型 nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10的幼虫;PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11。作为阴性对照，我们省略了 LexAop-CD4-spGFP11 转基因。其他转基因（例如，蛋白质编码，双链RNA）可以根据需要在DP层（ 在UAS 序列的控制下）或PerM（ 在LexA操作员的控制下）中表达。

这是一种无法中断的实时成像协议。材料准备估计为 ~10 分钟。成像前一次进行解剖的时间不应超过 20 分钟。成像需要~30分钟，持续时间不应超过~1小时。对于多种条件或大量样品，该程序必须分多轮进行，以确保最佳结果。

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Results

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为了测试GRASP程序在测量DP和PerM细胞之间接触方面的有用性，我们检查了四种不同基因型的翼盘：野生型阴性对照盘（基因型： w1118），它只会在GFP通道中显示自发荧光的背景水平;在DP层中表达CD4-spGFP1-10的圆盘，但缺乏CD4-spGFP11转基因，这将显示单独由GFP1-10产生的荧光水平（我们预计可以忽略不计，因为GFP1-10不应发出荧光26）;CD4-spGFP1-10和CD4-spGFP11分别在DP和PerM中表达的光盘（图3A），这将揭示DP-PerM接触的“正常”水平;以及除了 CD4-spGFP1-10 和 CD4-spGFP11 之外，还在 UAS 控制下的 DP 细胞中表达 Ser/Thr 蛋白激酶 Slik 的椎间盘。DP 细胞中的 Slik 表达驱动 PerM 细胞的非自主增殖27。它还驱动 DP 细胞中顶端细胞介素的形成，这些细胞穿过椎间盘腔并似乎与 PerM 细胞接触，通常稳定.......

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Discussion

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细胞介素在配体的分布中起着重要作用，控制发育中组织的生长和组织。信号交换发生在细胞介素尖端与其靶标进行密切膜接触的地方。在本协议中，我们描述了一种使用GRASP技术分析翼盘上皮层之间细胞介导的接触的简单方法。

这里介绍的技术至少需要四个组件——一个 GAL4 驱动程序、一个 LexA 驱动程序以及在 UAS 和 LexAop 控制下编码互补 spGFP 片段的 CD4 融合的两个转基因。使用我们选择的驱动因素，我们没有检测到与任何一种 CD4-spGFP 蛋白的表达相关的任何可辨别的影响或致死率。因此，可以构建一个稳定地包含所有四个组件的通用驱动单元。该储备液可以杂交到携带其他 UAS 和 LexAop 转基因任意组合的储备液中，以纵 DP 和/或 PerM 细胞中的基因表达，以测试对细胞介素接触形成的影响。在储备构建过程中（特别是在制造携带两种成分的重组染色体时），可能需要仅检测一个互补 spGFP 片段的表达。我们的抗 GFP 抗体似乎没有.......

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Disclosures

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作者没有需要声明的竞争利益。

Acknowledgements

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这项工作得到了 CIHR 对 DH 的资助 （PJT-162109） 的支持。MJ 获得了蒙特利尔倩碧研究所基金会和蒙特利尔大学分子生物学项目的博士奖学金。作者非常感谢 IRCM 显微镜和成像平台的帮助。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Discovery V12 解剖显微镜蔡司解剖显微镜
Dumont #55 镊子，生物学技巧精细科学工具11255-20解剖镊子
EP-Slik （slik20358）BDSC的Panneton 等人，2015 用于表达 Slik 的苍蝇菌株
斐济Schindelin， J. 等人 （2012） 图像分析软件
霍克斯特 33342 赛默飞世尔科技H3570 活体成像核染色 
LexAop-CD4-spGFP11 BDSC的93018苍蝇应损
LSM 700共聚焦显微镜 蔡司共聚焦显微镜
nub-GAL4布卢明顿果蝇种群中心 （BDSC）86108苍蝇应损
PerM-LexARambaud， Joseph 等人，2025 年苍蝇应损
PYREX 9-凹陷玻璃点板销售康宁生命科学7220-85用于收集和清洗幼虫
施耐德果蝇培养基赛默飞世尔科技21720024实时成像培养基
SecureSeal 成像垫片，8 孔，0.12 mm 厚 格雷斯生物实验室654008间隔
SYLGARD 184 硅胶弹性体套件西尔加德3097358-1004用于制作解剖板
UAS-CD4-spGFP1-10 BDSC的93017苍蝇应损
禅黑蔡司采集软件

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development. Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).
  2. Kornberg, T. B. Cytonemes and the dispersion of morphogens. Wiley Interdiscip....

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Cytoneme Mediated ContactDrosophila Wing DiscGFP ComplementationLive ImagingConfocal MicroscopySplit GFP SystemCell Cell ContactPeripodial MembraneTissue Growth SignalingProtein Expression

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