一种基于 GFP 互补的双表达系统，用于评估活果 蝇 翅假想盘中细胞介素介导的细胞间接触

Summary

我们描述了一种协议，用于使用基于GFP重建的方法测量活果蝇翅假想盘中相邻上皮层细胞之间的接触。

Abstract

胚胎组织的生长和图案化在很大程度上由组织本身内细胞群之间局部交换的信号控制。细胞介素是一种信号丝状伪足，首先在果蝇中发现，它连接和介导信号产生细胞和信号接收细胞之间的交换。在发育中的果蝇翅假想盘中，细胞介素参与椎间盘内不同细胞群之间的信号交换，这将形成成体翅，以及 DP 细胞和相邻椎间盘相关组织中的细胞之间的信号交换。细胞介素与靶细胞突触形成亲密的膜接触。

在这里，我们提出了一种方案，用于量化DP细胞与相邻足周膜（PerM）上皮细胞之间的细胞介导的接触，该细胞通过椎间盘腔与DP细胞分离，在活翼盘中使用GFP重建方法。使用 GAL4-UAS 和 LexA-LexAop 系统，分裂 GFP 的互补片段（spGFP1-10、spGFP11）在椎间盘腔的两侧表达，每个片段都融合到 CD4 的跨膜结构域。然后通过共聚焦显微镜对活翼盘制备中重构的GFP荧光进行成像，以生成图像堆栈，从中可以定位和量化重构的GFP荧光。使用该系统，可以在产生细胞介素的细胞或靶细胞中共表达蛋白质编码或RNA干扰转基因，以衡量它们对DP-PerM细胞接触的影响。该系统易于适应其他组织，因此能够识别对细胞介素形成或功能很重要的因素。

Introduction

胚胎组织的发育由位于“组织中心”的细胞控制，这些细胞向组织内的远处细胞发出信号，控制它们增殖（即生长和分裂）或采用特定命运的决定¹。这种细胞非自主信号传导是由组织中心细胞产生的配体介导的，这些配体通过组织形成浓度梯度并引发浓度依赖性反应。在许多情况下，这些配体要么通过称为细胞介素的长肌动蛋白信号丝状伪足递送或拾取，细胞介素^{连接组织中的}信号发送和接收细胞^2,3。细胞介素首次发现于果蝇翅想象盘⁴，在哺乳动物和其他脊椎动物中也被鉴定出 5,6,7,8,9。在早期阶段，更好地了解细胞介素在细胞非自主信号传导中的作用对于破译细胞如何通讯以组织成组织以及这些通讯线如何在各种病理条件下（包括发育畸形和癌症）中被修饰至关重要。

细胞介素可以从源细胞延伸至将配体递送至靶细胞，或从靶细胞延伸至接收靠近其来源的配体^2,3。细胞介素与其靶标进行密切接触，它们被认为形成突触样结构，其中可以发生配体转移 ^3,10,11。这种接触可以发生在源细胞素和靶细胞素的尖端之间或细胞素素和细胞体之间^3。尽管尚未得到广泛表征，但在某些情况下，通过粘附分子或通过受体-配体相互作用进行细胞粘附是正确激活下游信号传导事件所必需的 12,13,14，这使其成为细胞介素生物学的一个重要方面。

几项研究已将“跨突触伴侣的 GFP 重建”（GRASP） 技术应用于细胞介素接触的分析。该方法用于识别和绘制复杂神经系统中的突触伙伴¹⁵。它基于分裂 GFP 的两个互补片段（spGFP1-10 和 spGFP11）的表达，每个片段都融合到跨膜结构域（例如 CD4）的细胞外区域，在不同的细胞群中。如果这两个群体中细胞的质膜直接接触，则会使 spGFP 的互补结构域接近，从而导致 GFP 荧光的重建。这种方法已用于果蝇，以识别翼盘内细胞之间以及翼盘与其他紧密并置的组织之间是否存在细胞介素接触 12,16,17,18,19,20,21。

本文描述了 GRASP 在果蝇翅假想盘的两个形态不同的上皮层、圆盘本身 （DP） 和足膜 （PerM） 之间的接触表征中的应用。这些上皮层形成一个围绕中央管腔的囊，假复层柱状DP细胞位于一侧，鳞状PerM细胞位于另一侧，两者的顶端膜都朝向内朝向管腔（图1A）。有一些证据表明两层^{22、23、24、25} 之间存在透腔信号传导，我们最近记录了来自 DP 的信号传导，以控制由 DP²¹ 中顶端细胞介素介导的 PerM 细胞的增殖。该协议涉及使用 GAL4/UAS 和 LexA/LexAop 转基因表达系统在 DP 和 PerM 细胞膜上表达与 CD4 融合的 spGFP 互补片段。它使用重构的 GFP 荧光来读出两个细胞群之间的膜接触。

Protocol

nubbin-GAL4 驱动器用于在 DP 的翼袋区域特异性表达 CD4-spGFP1-10（图 1A）。PerM-LexA驱动程序²¹用于在PerM中特异性表达CD4-spGFP11（图1A）。这两个表达系统彼此独立，允许在DP和PerM中同时和特异性表达不同的转基因（图1B，C）。

基本遗传方案包括杂交苍蝇产生基因型 nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10的幼虫;PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11。作为阴性对照，我们省略了 LexAop-CD4-spGFP11 转基因。其他转基因（例如，蛋白质编码，双链RNA）可以根据需要在DP层（ 在UAS 序列的控制下）或PerM（ 在LexA操作员的控制下）中表达。

这是一种无法中断的实时成像协议。材料准备估计为 ~10 分钟。成像前一次进行解剖的时间不应超过 20 分钟。成像需要~30分钟，持续时间不应超过~1小时。对于多种条件或大量样品，该程序必须分多轮进行，以确保最佳结果。

1、材料准备

1. 在解剖之前，清洁镊子、9孔玻璃凹陷点板（或其他适合收集和清洁幼虫的容器）和可重复使用的Sylgard（硅胶）涂层培养皿，用于用70%乙醇进行解剖。
2. 通过进行 70% 乙醇洗涤，然后将 成像垫片 粘贴到干燥的载玻片上来制备显微镜载玻片。用剪刀从8孔条上切下单个孔，然后切成两半（图2A）。从每一半的一侧取下保护背衬，并将垫片粘在载玻片上，稍微分开，以在中间创建一个将放置光盘的遮蔽空间（图 2B）。
   注意：根据我们的经验，这简化了样品安装，因为转移到载玻片的介质的精确体积不太重要。任何少量多余的体积都会在盖玻片时从间隙流出。由于我们只成像了相对较短的时间（通常为 ~1 小时），因此我们在中等干燥时没有遇到任何问题。
3. 解冻活体成像培养基（未补充的施耐德果 蝇 培养基，储存在冷冻的 10 mL 等分试样中）并将其放在冰桶中。
4. 在 2 mL 微量离心管中，将 1.5 mL 培养基与 20 μL 200 μg/mL Hoechst 33342（终浓度 2.7 μg/mL）混合。将管子放在冰上。
   注意：使用这种特定形式的 Hoechst 染料是因为它具有高度膜渗透性。注意： 处理 Hoechst 33342 时应戴手套。工具使用后应清洗。

2. 翼盘解剖和载玻片准备

1. 在遗传杂交并在25°C下饲养后，从管中挑选游荡的三龄幼虫，并在9孔玻璃凹陷点板中的冷活成像培养基中洗涤它们。
   注意：细胞介素非常脆弱。在以下步骤中，应注意作椎间盘周围的组织，尽量避免椎间盘和解剖工具之间的直接接触。我们一次准备三到四个幼虫，因为损坏几个圆盘是不可避免的，这可能只有在成像步骤中才会变得明显。
2. 在解剖显微镜下，将幼虫转移到涂有硅胶的培养皿上的一滴活成像培养基中，并使用两个解剖镊子开始解剖。为此，首先用一对镊子在体长的三分之一左右（从前部）捏住幼虫，以稳定头部和身体前部。使用第二对镊子，捏住第一个镊子后方的身体。然后，将幼虫的后部拉开以隔离前部“一半”。
3. 用一对镊子固定在切口两侧，然后用另一对镊子将头部推过（就像把袜子翻过来一样），将前半部分倒置，以暴露内部结构，包括假想盘、气管、唾液腺、脂肪体和肠道。
4. 小心地去除唾液腺、脂肪体和肠道，注意不要干扰气管的外侧干，气管的外侧干应覆盖并保护翼盘。
5. 使用镊子小心地将带有翼盘的清洁前半部分转移到一滴带有Hoechst的干净活成像介质中，放置在准备好的载玻片上的垫片之间（图2C）。使用解剖镊子的一根刀片或连接到解剖针架的细钨丝，轻轻地钝性解剖翼盘，将它们从连接到椎间盘的气管细支上分离出来，将翼盘与其余组织隔离开。丢弃其余的胴体。
6. 使用解剖镊子或钨丝解剖针的一个刀片定向圆盘。由于其扁平的泪滴状形状，翼盘会在 DP 或 PerM 朝上时落下。对于此协议，将所有光盘的 PerM 面朝上定向。
7. 根据需要添加或移除培养基，调整培养基体积以完全填充孔，使其略高于成像垫片的水平。从每个成像间隔片的顶部取下保护背衬，然后小心地将盖玻片放在样品上。轻轻按压盖玻片与成像垫片接触的地方（例如，与解剖镊子的圆形端），以确保盖玻片粘附在垫片上。
   注意：中等水平应略高于垫片高度，以避免捕获气泡，但不要太高，以免在降低盖玻片时产生大量流量。

3. 成像

1. 使用配备 40x/1.30 NA 油浸透镜和显微镜软件的共聚焦显微镜（GFP 波长为 488 nm 的氩离子激光器，Hoechst 的 Hoechst 为波长 350 nm 的紫外激光器）在室温下对样品进行成像。获取步长为 1 μm 的图像堆栈，其范围从略高于 PerM 的最高水平（Hoechst 荧光减弱）到 DP 的基底侧，通常每个堆栈超过 100 张图像。获取重复的图像堆栈以生成延时电影。
   注意：我们对载玻片进行成像不超过 ~1-2 小时。
2. 对于显微镜软件设置，使用 8 位编码、线平均 2、探测器增益通常在 650 到 750 之间以及分离的通道轨迹来获取图像以减少信号渗漏。对所有条件使用相同的激光器和探测器设置，通过事先对每种条件进行测试来预先确定。
   注意：在 40 倍放大倍率下，我们的图像分辨率为每 μm 5.0386 像素（像素大小：0.1985 x 0.1985 μm²）。在我们的设置中，最佳共聚焦显微镜设置包括尽可能高的激光强度（不损坏组织）以捕获尽可能多的信号，同时几乎不产生饱和度;以及通过降低检测器偏移和采集速度（如果需要）来实现对阴性对照评估的尽可能低的噪声。我们通常使用低于 5% 的激光功率和最大扫描头速度（Zen 软件设置中的“9”）。单个图像堆栈通常需要 ~1 分 45 秒才能采集，并且每 2-3 分钟拍摄一次图像以进行延时分析。

4. 图像分析

1. 使用 ImageJ 软件包的最大 强度投影 功能进行项目堆栈（点击 图片 |堆栈 |Z 项目，在菜单中选择 最大强度 ）。
2. 在 MIP 图像中，使用 多边形选择根据翼盘折叠模式（使用 Hoechst 通道）确定翼袋面积。在GFP通道上使用相同的选择和 清除外部功能 （单击 编辑|清除外部）将每个外部像素值设置为 0。
3. 在MIP图像中，使用Hoechst通道清理GFP图像，特别是通过将相关像素值设置为0（单击多 边形选择，然后单击 编辑|清除）来删除两个通道中出现的任何伪影斑点。
4. 在清理后的 MIP 图像中，使用 直方图 函数（单击 Analyze |直方图 |List） 获取所有像素值的列表并将其复制到电子表格中的表格中。
5. 根据对阴性对照中背景信号的分析设置阈 值 （然后在其他样品中验证;参见讨论）。
6. 使用以下公式计算 GFP 阳性表面的百分比：
   %GFP 阳性表面 = × 100
7. 通过将每个值除以参考条件的平均值（设置为 1），对末尾的数据进行归一化。
   注意：有效像素 = 值≥ 1 的像素，有效地忽略值设置为 0 的任何已删除像素。像素值为 0 不会自然出现。
8. 为了确定重建的 GFP 信号在椎间盘中定位的位置，请使用图像堆栈的 XZ 重切片来查看椎间盘上皮的顶基底轴。在斐济执行不插值的重新切片，并使用带有双线性插值的 缩放 函数增加 Z 轴的图像高度，以提高可见性。

Results

为了测试GRASP程序在测量DP和PerM细胞之间接触方面的有用性，我们检查了四种不同基因型的翼盘：野生型阴性对照盘（基因型： w¹¹¹⁸），它只会在GFP通道中显示自发荧光的背景水平;在DP层中表达CD4-spGFP1-10的圆盘，但缺乏CD4-spGFP11转基因，这将显示单独由GFP1-10产生的荧光水平（我们预计可以忽略不计，因为GFP1-10不应发出荧光²⁶）;CD4-spGFP1-10和CD4-spGFP11分别在DP和PerM中表达的光盘（图3A），这将揭示DP-PerM接触的“正常”水平;以及除了 CD4-spGFP1-10 和 CD4-spGFP11 之外，还在 UAS 控制下的 DP 细胞中表达 Ser/Thr 蛋白激酶 Slik 的椎间盘。DP 细胞中的 Slik 表达驱动 PerM 细胞的非自主增殖²⁷。它还驱动 DP 细胞中顶端细胞介素的形成，这些细胞穿过椎间盘腔并似乎与 PerM 细胞接触，通常稳定...

Discussion

细胞介素在配体的分布中起着重要作用，控制发育中组织的生长和组织。信号交换发生在细胞介素尖端与其靶标进行密切膜接触的地方。在本协议中，我们描述了一种使用GRASP技术分析翼盘上皮层之间细胞介导的接触的简单方法。

这里介绍的技术至少需要四个组件——一个 GAL4 驱动程序、一个 LexA 驱动程序以及在 UAS 和 LexAop 控制下编码互补 spGFP 片段的 CD4 融合的两个转基因。使用我们选择的驱动因素，我们没有检测到与任何一种 CD4-spGFP 蛋白的表达相关的任何可辨别的影响或致死率。因此，可以构建一个稳定地包含所有四个组件的通用驱动单元。该储备液可以杂交到携带其他 UAS 和 LexAop 转基因任意组合的储备液中，以纵 DP 和/或 PerM 细胞中的基因表达，以测试对细胞介素接触形成的影响。在储备构建过程中（特别是在制造携带两种成分的重组染色体时），可能需要仅检测一个互补 spGFP 片段的表达。我们的抗 GFP 抗体似乎没有...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Discovery V12 解剖显微镜	蔡司		解剖显微镜
Dumont #55 镊子，生物学技巧	精细科学工具	11255-20	解剖镊子
EP-Slik （slik20358）	BDSC的	Panneton 等人，2015	用于表达 Slik 的苍蝇菌株
斐济		Schindelin， J. 等人 （2012）	图像分析软件
霍克斯特 33342	赛默飞世尔科技	H3570	活体成像核染色 
LexAop-CD4-spGFP11	BDSC的	93018	苍蝇应损
LSM 700共聚焦显微镜	蔡司		共聚焦显微镜
nub-GAL4	布卢明顿果蝇种群中心 （BDSC）	86108	苍蝇应损
PerM-LexA		Rambaud， Joseph 等人，2025 年	苍蝇应损
PYREX 9-凹陷玻璃点板销售	康宁生命科学	7220-85	用于收集和清洗幼虫
施耐德果蝇培养基	赛默飞世尔科技	21720024	实时成像培养基
SecureSeal 成像垫片，8 孔，0.12 mm 厚	格雷斯生物实验室	654008	间隔
SYLGARD 184 硅胶弹性体套件	西尔加德	3097358-1004	用于制作解剖板
UAS-CD4-spGFP1-10	BDSC的	93017	苍蝇应损
禅黑	蔡司		采集软件