带外置回肠造口的大鼠小肠移植排斥反应模型用于纵向预后评估

摘要

本方案描述了一种基于大鼠的带有回肠造口的肠道移植模型，用于评估药物干预对移植物排斥反应的时间进程影响。

摘要

迄今为止，器官移植仍是治疗器官衰竭的主要手段。在各种实体器官中，肠移植术后的患者预后仍不理想，主要原因是移植物排斥反应。这一挑战迫切需要进一步改进外科技术，或开发新的术后药理学干预措施。本文介绍了一种大鼠肠移植排斥反应模型，可作为相关研究的实验平台。将来自Fischer 344（F344）品系大鼠的一段回肠异体移植至Lewis（LEW）大鼠体内，并按照既定剂量和时间表给予他克莫司治疗。通过构建外置式回肠造口，实现对移植物组织状态的无创性、纵向监测。利用回肠造口图像训练建立了一个三色线性回归模型，并据此构建了基于图像的评估体系，可对造口状态进行0至10分的量化评分。评估结果显示，移植术后第三周起移植物健康状况开始恶化。组织学分析证实，自术后第28天（POD 28）起，移植物出现慢性排斥反应的典型特征，与人类患者的病理表现相似，同时验证了无创性回肠造口图像评估结果的可靠性。本文所建立的肠异体移植模型及相关评估方法，有望促进肠移植治疗策略的开发。

引言

器官衰竭是指一个或多个重要器官功能欠佳，无法维持机体健康的状况。若未能及时获得医疗救治，通常会导致死亡或继发感染等并发症¹。对于大多数器官而言，替换功能异常的器官是实现长期康复的唯一可行方案。自发现体细胞可重新获得干性以来²，人们推测诱导性多能干细胞（iPSCs）或可实现完整的器官发生，从而为器官移植提供近乎无限的器官来源。通过结合胚胎发育知识与对信号通路的精确调控，已在类器官尺度上成功生成多种组织。尽管在全尺寸器官生成方面，近期已在眼睛等特定器官上取得显著进展^3,4，但对大多数重要器官而言，来自人类供体的同种异体移植仍是主流方法。

在所有内脏器官中，肠道移植的预后效果仍不理想，需要进一步的手术优化或药物干预⁵。新的干预措施很少直接在人体受试者中进行测试，通常首先在动物模型中评估其在肠道移植中的效果。本文详细介绍了一种大鼠肠道移植物排斥反应模型，可作为评估这些潜在治疗进展的平台。

为了模拟人类中观察到的细微人类白细胞抗原（HLA）错配情况，将来自雄性Fischer 344（F344）大鼠的雄性匹配小肠节段移植到Lewis（LEW）大鼠体内，并在急性期给予亚治疗剂量的免疫抑制剂他克莫司，以诱导慢性期移植物排斥反应。该供体-受体组合具有相同的主要组织相容性复合体位点，但在次要组织相容性抗原上存在差异⁶。在本方法中，将移植物的一部分黏膜外置形成回肠造口，以便对移植预后及排斥状态进行视觉上的时间序列监测。此外，本文还提出了一种基于回肠造口图像的补充性方法，用于量化排斥状态，并通过移植物相应的组织学变化加以验证。

方案

所有动物实验程序均经大阪大学医学院机构动物护理与使用委员会批准，批准编号为 04-018-003，并依照大阪大学的指导原则进行。实验使用受体雄性 Lewis（LEW）大鼠（体重 200-250 g，7-9 周龄）和供体雄性 Fischer 344（F344）大鼠（体重 200-250 g，10-12 周龄）。手术前，皮下注射 0.4 mg/kg 的美洛昔康，用剃毛器剃除腹部毛发，并用 70% 乙醇消毒腹部区域。本研究中所用试剂与仪器的详细信息列于材料表中。

1. 供体手术

1. 术前 12 小时禁食供体大鼠。
2. 使用吸入式异氟烷对供体大鼠进行麻醉（遵循机构批准的方案）。将大鼠置于与操作者垂直的位置。手术过程中将体视显微镜调至 5 倍放大倍数。使用 5-0 丝线进行结扎。
   注：异氟烷流速为 1.5 L/min。在腹部初始切口期间异氟烷浓度为 2.5%，术中维持在 1.5%。通过夹捏足趾无反射确认麻醉深度。如需要，在确认麻醉后涂抹兽用眼膏以防止眼睛干涩。
3. 无菌准备大鼠后，确认其处于手术麻醉水平，然后做一条 8 cm 的腹正中切口以打开腹腔。将上方切口延伸至剑突，以充分暴露门静脉（PV）。
4. 解剖 Treitz 韧带，并将小肠顺时针旋转 180 度，以逆转肠道旋转。
5. 观察肠系膜血管袢，选择一个血供良好的移植区域，该区域距回肠约 10 cm（图 1A1）。
6. 解剖远端肠系膜，并结扎远端回肠的肠系膜上动脉（SMA）和肠系膜上静脉（SMV）。确保 SMA/SMV 的切断位置远离近端结扎处。不当结扎可能导致出血并影响移植物灌注。
7. 将胃和脾向头侧移位，以清晰暴露门静脉（PV）。
8. 解剖并结扎位于 SMA/SMV 左侧的中结肠动脉/静脉和右结肠动脉/静脉。
9. 解剖 SMA/SMV 右侧的肠系膜，并结扎空肠分支。避免在靠近 SMV 处结扎，以防扭曲（图 1A2）。
10. 用棉签轻柔分离 SMA 起始部，并结扎 SMA 上方主动脉与门静脉之间的肠系膜组织。该区域包含肠系膜上淋巴结和大量淋巴管。
11. 识别并结扎位于主动脉右侧的右肾动脉（图 1A3）。
12. 经阴茎静脉注射肝素化生理盐水（200 U / 2 mL）。
13. 确定最终移植物长度，并结扎多余的肠系膜分支。在移植物近端和远端均结扎直行动脉。
14. 在 SMA 下方结扎主动脉，然后在 SMA 上方结扎主动脉，并连同主动脉的一小块圆形组织一并切除 SMA 起始部。在肝门处切断门静脉，切口应呈斜面，以形成较大的吻合口。
    1. 继续切断近端和远端血管袢及肠道。将取出的移植物置于冷生理盐水（4 °C）中（图 1A4）。
15. 移除近端主动脉结扎以诱导放血，并处死供体大鼠（遵循机构批准的方案）。

2. 移植物处理

1. 识别肠系膜上动脉（SMA）和门静脉（PV）。
2. 用15 mL冷生理盐水轻轻灌注移植物 通过 脊髓性肌萎缩症（SMA）图1B1）。确认所有血液已被替换，移植物颜色变为苍白或白色。
3. 冲洗肠段移植物的管腔并清除粪便内容物。
4. 保持移植物浸没在新鲜的冷生理盐水中，直至移植。

3. 受体手术

1. 使用吸入式异氟烷对受体大鼠进行麻醉（遵循机构批准的方案）。用含碘/氯己定的消毒液和70%酒精对术区进行消毒。无菌准备大鼠后，将大鼠垂直于操作者放置。
   1. 将体视显微镜在常规操作时设为5×，在血管吻合期间设为12.5×。使用5-0丝线进行结扎，8-0合成聚丙烯缝线进行血管吻合。将大鼠置于加热垫上，以防止术中低体温。
      注：异氟烷流速为1.5 L/min。初始腹腔切口期间异氟烷浓度为2.5%，术中降至1.5%。通过夹捏脚趾无反射确认麻醉深度。确认麻醉平面后，涂抹眼用软膏以防止眼睛干涩。
2. 术前肌肉注射0.5 mg/kg他克莫司。沿中线做一切口（约5 cm），打开腹腔。
3. 将肠管和结肠向头侧移位，并解剖Treitz韧带。用湿润纱布包裹肠管和结肠，并将其置于大鼠体表。
4. 解剖覆盖下腔静脉（IVC）和主动脉的腹膜（图1B2）。识别并结扎右侧性腺动脉和静脉。定位右侧输尿管。
5. 将大鼠连同麻醉面罩逆时针旋转90°，使头部朝向操作者左侧。使用弯型Bulldog血管夹夹闭右肾静脉上方的下腔静脉。
6. 用剪刀切开下腔静脉壁，形成椭圆形开口。用生理盐水冲洗，并在下腔静脉尾侧边缘放置牵引缝线（图1B3-1）。确保静脉吻合口足够大（约1 cm），并在吻合处充分拉伸门静脉（PV）管壁。
7. 将移植物置于大鼠左侧，使门静脉（PV）和肠系膜上动脉（SMA）靠近下腔静脉和主动脉。将远端回肠朝向头部方向定位。用无菌、低温、湿润的纱布包裹移植物，并敷上无菌冰块以维持低温状态。
8. 将牵引缝针（8-0合成聚丙烯缝线）穿过门静脉（PV）尾侧边缘。使用蚊式钳控制缝线张力。
9. 将门静脉（PV）头侧边缘缝合结扎至下腔静脉（IVC）（PV至IVC）。吻合后壁门静脉（IVC至PV）（图1B3-2）。在门静脉右侧边缘打结固定牵引缝线。随后，吻合前壁门静脉（PV至IVC）。
   1. 在完成吻合前，夹闭移植物的门静脉并注入肝素化生理盐水。打结后松开下腔静脉夹（图1B3-3）。
      ​注：吻合口初期可能出现出血，但通常可自行停止。
10. 使用弯型Bulldog夹在髂动脉分叉上方夹闭主动脉。
11. 切开主动脉壁。在主动脉和肠系膜上动脉（SMA）的头侧边缘（约4–5 mm处）放置牵引缝线（8-0合成聚丙烯缝线）（图1B4-1）。用蚊式钳夹住牵引缝线以控制张力。
12. 将另一根8-0缝针穿过SMA和主动脉的尾侧边缘。打结后从大鼠右侧开始吻合（图1B4-2）。打结固定牵引缝线。
13. 将大鼠连同麻醉面罩旋转180°，使头部朝向操作者右侧。在左侧完成SMA至主动脉的吻合。在最后一针前，夹闭移植物的门静脉并注入肝素化生理盐水，然后打结（图1B4-3）。
14. 松开主动脉和门静脉夹以实现再灌注（图1B5）。初期可能出现少量出血，可用棉签轻压控制。移植物黏膜应在数分钟内变为粉红色（图1B6）。
15. 将大鼠连同麻醉面罩旋转90°，使头部朝向对侧。在右侧腹部做两个8 mm的皮肤切口，将回肠移植物的近端和远端引出体外。
    1. 使用5-0聚对二氧环己酮（PDS）缝合皮肤与移植物浆膜（图1B7）。分别用5-0 PDS缝合腹白线和皮肤，关闭中线切口，完成手术。
       注：术后必须密切监测大鼠，直至完全恢复意识。未达到胸卧位前不得放回笼中。

4. 术后管理

1. 为维持移植物在急性期的存活，于术后第1–13天、第20天和第27天，按0.5 mg/kg剂量肌肉注射他克莫司⁷。
   注意：连续注射应交替在不同后肢进行。也可采用皮下注射方式给予他克莫司。
2. 于术后第1–3天，按0.4 mg/kg剂量皮下注射美洛昔康。
   注意：受体大鼠通常在术后第7天前体重下降，至术后第14天逐渐恢复。可给予皮下生理盐水注射，以缓解因回肠造口导致体液丢失所引起的脱水。约20%的病例在术后第7天前出现意外死亡。此后存活率及整体健康状况通常趋于稳定。

5. 肠移植移植物健康状态的影像学评估

1. 在 ImageJ 中打开一张回肠造口的图像。通过选择 图像 > 类型 > RGB 栈，将图像转换为 RGB 栈。
   注意：如果图像尚未处于 RGB 格式，请先使用 图像 > 类型 > RGB 颜色 将其转换为 RGB 颜色。
2. 选择一个感兴趣区域（ROI），该区域仅包含回肠造口可见的黏膜区域。
3. 测量所选 ROI 内每个通道（红色、绿色和蓝色）的强度。
4. 使用以下公式计算移植物的健康评分：
   评分 =
   注意：对最终评分进行归一化处理：如果评分 > 10，则赋值为 10；如果评分 < 0，则赋值为 0。

结果

关键外科检查点的代表性图像见图1。再灌注成功率接近100%，术后存活率为80.0%（25例手术中20例存活）。当手术操作正确且按规定的剂量和时间表给予他克莫司时，外置回肠造口通常在术后第三周开始呈现发白现象——这是移植物排斥的征象（图2A、B）。相比之下，同系移植（LEW→LEW）不会引发排斥反应，可长期保持良好状态（图2B）。利用三色回归模型对回肠造口外观进行纵向监测（训练性能与回归结果的详细信息见补充文件1），可对移植物的健康状况和排斥状态提供定量分析（图2A、C）。组织学分析显示，在术后第28天和第45天，移植物丢失了绒毛和隐窝等关键的上皮结构——这些结构对肠道功能和维持至关重要——同时富含细胞外基质（ECM）的黏膜下层出现增厚（图3A...

讨论

尽管动物实验对于改进手术和药物干预措施、改善肠道移植的短期和长期预后至关重要，但在大鼠中建立肠道移植手术技术在实践中一直存在困难。本文详细描述了异位肠道移植的手术步骤。该方法中，供体和受体的手术时间分别约为35分钟和90分钟。热缺血时间（与移植物缺血性损伤及动物存活率直接相关）约为45分钟。尽管该时间长于以往报道的热缺血时间^8,9,10，但在该移植物排斥模型中，术后第45天的存活率仍超过80%，且热缺血时间少于60分钟应可被接受以保证存活率。此外，与先前报道⁸不同，本方法在血管吻合期间未同时夹闭受体的下腔静脉（IVC）和主动脉。取而代之的是，在静脉和动脉吻合过程中，分别使用弯型Bulldog血管夹依次夹闭IVC或主动脉。该技术对大鼠更为温和且耐受性更好，因为同时夹闭动脉和静脉可能对下肢造成显著损伤。

已报道两种大鼠肠道移植的主要方法，即异位移植

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-0 黑色编织丝线 40cm	alfresa pharma	62-9965-34
5-0 白色编织丝线 40cm	alfresa pharma	62-9964-99
8-0 PROLENE BV130-5 45cm	ETHICON	EP8730H
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG(H+L)	Invitrogen	A11005	工作浓度：2 µg/mL
Alexa Fluor 647 山羊抗兔 IgG(H+L)	Invitrogen	A21245	工作浓度：2 µg/mL
Barraquer 显微持针器，8mm CVD 颚，6"
Bulldog 血管夹 35mm	Natsume	C-42-S-2
Fischer 344 (F344)	Japan SLC (静冈，日本)		供体，雄性，10 至 12 周龄
Lewis (LEW) 大鼠	Japan SLC (静冈，日本)		受体，雄性，7 至 9 周龄
显微剪刀	YDM	CC06C
显微外科缝合镊 —— 弯型，平台式，圆柄：15 cm/6 in
小鼠抗 Collagen I 单克隆抗体	abcam	AB90395	工作浓度：1000 倍稀释
生理盐水 500 mL	OTSUKA	3311401A8024
塑料血管双夹	Microsurgery training ltd
Prograf 注射剂 5 mg	Astellas Pharma	3999416A1028
兔抗 Laminin 多克隆抗体	abcam	AB11575	工作浓度：2 µg/mL
小型动物麻醉机	Muromachi kikai	MK-A100
手术显微镜 OPMI-1FR	Carl Zeiss	OPMI-1FR
缝线，5/0 18 PDS II 透明单股，VA	ETHICON	Z493G