基于RNA扩增侧向流动分析法快速鉴定Neisseria gonorrhoeae、Chlamydia trachomatis和Ureaplasma urealyticum

摘要

在此，我们介绍一种RNA扩增侧向流动检测方法的实验方案，并评估其在快速检测中的有效性 淋病奈瑟菌, 沙眼衣原体，以及 解脲脲原体.

摘要

Neisseria gonorrhoeae（NG）、Chlamydia trachomatis（CT）和Ureaplasma urealyticum（UU）是与性传播疾病（STDs）相关的常见病原体。NG 是淋病的致病菌，可导致泌尿生殖系统多种疾病，包括附睾炎、前列腺炎、宫颈炎以及不孕症。CT 是非淋球菌性尿道炎和盆腔炎性疾病的主要病原微生物。UU 与非淋球菌性尿道炎、宫颈炎、前列腺炎及不孕症相关。目前针对 NG、CT 和 UU 的分子检测技术通常较为复杂且耗时较长。对这些病原体进行快速分子检测有助于性传播疾病的早期诊断。RNA 扩增侧向层析检测法（RGT）是一种无需核酸提取的检测方法。该方法通过裂解样本释放核酸片段，随后经逆转录和转录过程进行扩增。扩增后的 RNA 产物被特异性探针识别并结合，形成 RNA-检测探针-金标探针复合物，该复合物可通过侧向层析作用固定于硝酸纤维素膜上，产生可见条带。整个检测过程耗时不足 1 小时。本研究旨在评估 RGT 在快速检测 NG、CT 和 UU 中的有效性。共纳入 1,416 份样本。RGT 检测 NG、CT 和 UU 与聚合酶链式反应（PCR）荧光探针法相比，一致性分别为 99.03%（307/310）、99.38%（159/160）和 99.02%（303/306）；与基因测序法相比，一致性分别为 99.17%（238/240）、98.95%（188/190）和 98.30%（173/176）。与病原体分离培养法相比，NG、CT 和 UU 检测的检出率均为 100.00%（9/9、17/17、8/8）。该检测方法具有高灵敏度和高特异性、操作简便、检测时间短等优势，适用于 NG、CT 和 UU 的快速、准确检测。

引言

性传播感染（STIs）是全球重大的公共卫生挑战，可导致严重的生殖系统疾病和死亡¹。淋病奈瑟菌（NG）是淋病的致病原，全球每年约报告8700万例新发病例²。该病原体主要通过侵入泌尿生殖道的柱状上皮引起炎症反应³。另一种微生物沙眼衣原体（CT）则导致非淋球菌性尿道炎和盆腔感染，每年约有1.3亿例新发病例⁴。解脲脲原体（UU）是最简单且最小的可自我复制的细胞，易于侵入受损的宫颈组织，与非淋球菌性尿道炎、宫颈炎、前列腺炎及不孕症相关⁵。这些感染在男性和女性患者中常无症状，但若未及时治疗，可能导致严重并发症。孕妇感染可引发严重的不良妊娠结局，包括死产、流产、早产以及胎儿直接感染⁶。因此，开发一种快速、灵敏、特异且操作简便的病原体检测方法至关重要。

病原体的快速准确检测对于有效诊断和管理疾病至关重要。传统的培养方法需要对病原体进行分离、培养和鉴定，存在显著缺点，包括耗时长且灵敏度低。尽管基因测序具有较高的准确性，但其需要复杂的环境和设备，导致成本高昂且耗时。针对NG、CT和UU的常规分子检测技术已被广泛接受；然而，这些方法通常操作复杂且耗时，需要精密仪....

方案

本研究遵循中国广东省佛山市第一人民医院机构审查委员会批准的伦理指南（伦理审查文件编号：LR (2025) 136）。共前瞻性收集了1,416份生殖道拭子标本（女性患者716份，男性患者700份），均来自临床怀疑患有性传播疾病且在前14天内未接受抗生素治疗的个体（补充表1）。对每位参与者同时采集成对拭子，并平行进行分析：一份采用检测方法（RGT），另一份采用参考方法（PCR荧光探针法、基因测序和病原体分离培养）。采用Cohen的Kappa系数（κ）量化方法间一致性，并依据Landis与Koch的标准进行解释。

注意：CT 和 UU 的检测方案与 NG 的检测方案在操作步骤上完全相同，仅在病原体特异性试剂方面有所调整。试剂配方的详细信息见步骤 2.1（补充表 2、补充表 3 和 补充表 4）。

1. 样本采集

1. 适用标本类型：采集生殖道拭子（女性宫颈拭子、男性尿道拭子）。
2. 标本采集
   1. 将生殖道拭子插入男性尿道口内 2–3 cm，或插入女性宫颈口内约 1–2 cm。
   2. 旋转一周，保持 10 秒。
   3. 取出拭子，将其插入含有 1 mL 生理盐水的采集管中。

结果

RGT 与 PCR 荧光探针检测方法的一致性
共分析了 310 份淋球菌（NG）样本，包括 161 份女性样本和 149 份男性样本。阳性符合率为 98.78%（95%CI：93.39%–99.97%），阴性符合率为 99.12%（95% CI：96.87%–99.89%）。总体符合率为 99.03%（95% CI：97.20%–99.80%）。Kappa 一致性值为 0.975（95% CI：0.947–1.003，Z = 17.171，P < 0.05）（表 1）。共有三份样本结果不一致：一份样本使用 PCR 荧光探针法检测为阳性而 RGT 检测为阴性，基因测序复核确认为阴性结果；在两份 RGT 检测为阳性而 PCR 检测为阴性的样本中，基因测序确认其中一份为真阳性（RGT 结果与测序结果一致），另一份为假阳性（RGT 阳性但测序结果为阴性）。

讨论

本研究采用RGT检测性传播感染病原体，包括淋球菌（NG）、沙眼衣原体（CT）和解脲脲原体（UU）。在严格执行操作规程的条件下，RGT检测结果与已建立的诊断方法（如PCR荧光探针法、基因测序及病原体分离培养技术）具有高度一致性。通过与既定标准方法的比较分析表明，RGT检测的灵敏度和特异性均与先前报道的方法相当或更优^10,11。

RGT 方法的可靠性取决于多个关键的实验步骤。样本均质化必须在 2,600 次/分钟的转速下持续 10 秒，以确保拭子上的细胞完全脱落。通过轻柔振荡随后迅速离心，充分混匀扩增缓冲液和检测试剂溶液，对于实现试剂均一性并防止扩增效率降低至关重要。在转移试剂过程中必须仔细避免引入气泡，因为此类人为因素可能影响反应的可重复性。由于所需体积极小（1 µL），必须使用低吸附枪头将扩增酶精确移取至微芯片的反应腔室，以确保底物充分接触。此外，若在试剂复溶后检测试剂溶液中仍存在持续不溶的颗粒物，则必须弃用该试剂，因为残留沉淀物可能干扰光学读数或反应动力学。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% (w/v)  次氯酸钠	实验室中的准备工作。	实验室中的准备工作。	用于设备或表面去污及病原体灭活的稀释漂白剂溶液
75% (v/v) 乙醇	安徽安特食品有限公司	http://www.antegroup.com/product_detail_cn/id/81.html	用于表面消毒的乙醇水溶液
可调体积移液器（0.5–10 μL	DLAB Scientific Co., Ltd.	7010101004	单通道微量移液器，用于精确操作微升级体积。
可调体积移液器（100–1000 μL	DLAB Scientific Co., Ltd.	7010101014	单通道移液器，已校准用于大体积液体操作。
可调体积移液器（10–100 μL	DLAB科学有限公司	7010101008	适用于中等体积的单通道移液器，常用于分子生物学实验方案。
可调体积移液器（20–200 μL	DLAB Scientific Co., Ltd.	7010101009	用于中等体积转移的单通道移液器，适用于试剂的精确分装。
生物安全柜（HF Safe-1200）	HealForce Bio-Meditech Holdings Limited（中国香港）	HF Safe-1200	II级生物安全柜，可在处理致病性微生物或细胞培养物时提供人员、样本及环境的防护。
离心管	中国广州昊志医疗器械有限公司	中国广州越秀医疗器械备案编号 20210414	用于核酸提取、细胞沉淀及其他实验室操作。
沙眼衣原体（CT）核酸检测试剂盒（RNA扩增-侧向层析检测）	中国武汉中智生物技术有限公司	A.10.309-STD-RG-002	用于女性生殖道及泌尿道拭子样本中沙眼衣原体核酸RNA的定性检测。
CO2 培养箱	赛默飞世尔科技（阿什维尔，美国）有限责任公司	SN:300504406	用于细胞培养，提供温度可控（37℃）的稳定环境°摄氏度）、湿度和CO₂2 浓度（通常为5%）以确保细胞最佳生长。
培养皿	康宁公司（康宁，美国）	50 mm ´ 9 mm	用于贴壁细胞的培养与扩增。
沙眼衣原体（CT）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）	复星诊断（上海，中国）有限公司	中国医疗器械注册证编号 20143402234	用于定性检测生殖道和泌尿道拭子样本中沙眼衣原体的核酸。
淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）	复星诊断（上海，中国）有限公司	中国医疗器械注册证编号 20173401080	用于定性检测生殖道和泌尿道拭子样本中淋病奈瑟菌的核酸。
解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒（荧光探针PCR法）	复星诊断（上海，中国）有限公司	中国医疗器械注册证编号 20173400536	用于生殖道和泌尿道拭子样本中解脲脲原体核酸的定性检测。
DMEM 培养基	赛默飞世尔科技公司（美国沃尔瑟姆）	11965092	用于沙眼衣原体培养。
滤芯吸头（10 μL	中国广州苏尔百普生物科技有限公司（中国广州）	TF-10-BXL	用于实验中的精确移液。
滤芯吸头（200 μL	中国广州 Surbiopure 生物技术有限公司（中国广州）	TF-200-BXL	用于实验中的精确移液。
生殖器拭子	中国广州昊志医疗器械有限公司	Hz112	用于从生殖道黏膜表面采集临床标本的无菌棉签。
Gibco 胎牛血清（FBS）	赛默飞世尔科技公司（美国沃尔瑟姆）	10270106	用于沙眼衣原体培养。
载玻片	中国广州昊志医疗器械有限公司	中国广州越秀医疗器械备案编号 20210414	经防褪色处理的标准载玻片，用于制备细胞涂片或组织切片，适用于革兰染色方案。
Goldenstar RT6 cDNA合成试剂盒 Ver2	北京清科生物科技有限公司（中国北京）	TSK302S	用于两步法RT-PCR第一步中cDNA第一链的合成。它包含由RNA合成cDNA所需的所有试剂。
革兰氏染色试剂盒	Baso 诊断有限公司（中国珠海）	BA4012	一种染色试剂盒，包含结晶紫、碘液、脱色剂和沙黄，用于鉴别淋病奈瑟菌。
IBM SPSS Statistics（V25.0）	国际商业机器公司（美国纽约）	版本 25.0	用于数据分析。
红外线灭菌器	华熙新锐（青岛）分析仪器有限公司	MJ-200W	用于接种环或镊子的即时去污，以最大限度减少生物安全柜中的交叉污染。
接种环	中国湖南BKMAM生物技术有限公司	110306002	用于微生物样品的转移、划线或接种。
倒置显微镜（IX-51）	奥林巴斯株式会社（日本东京）	实验室资产代码：  71807101	用于在培养皿中观察贴壁细胞或活细胞动态。
MALDI Biotyper 自动化微生物质谱系统	布鲁克道尔顿公司 & Co. KG（德国不来梅）	国家医疗器械进口注册号 20182222017	一种基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的蛋白质谱分析系统，用于快速微生物鉴定，可在临床微生物学实验室中实现细菌和真菌的种水平鉴定。
McCoy细胞系	在实验室中保存。	在实验室中保存。	用于沙眼衣原体培养。
Microplate Thermostatic Incubator Leopard70-4（4块板容量）	Leaptec Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd.	Leopard70-4	可容纳最多4块标准微孔板的微孔板孵育器，温度范围为室温至70℃°C,  用于孵育步骤。
显微镜（OLYMPUS CX43）	奥林巴斯株式会社（东京，日本）	https://lifescience.evidentscientific.com.cn/zh/microscopes/upright/cx43-33/	用于临床样本观察（例如，细胞形态、染色标本）。
迷你金属浴 MiniG-R100	Leaptec Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd.	MiniG-R100	用于实验过程中对小体积样品快速调节温度，例如加热、孵育或终止反应。
淋病奈瑟菌（NG）核酸检测试剂盒（RNA扩增-侧向层析检测）	中国武汉中智生物技术有限公司	A.10.309-STD-RG-001	用于定性检测生殖道和泌尿道拭子样本中淋病奈瑟菌核酸RNA。
核酸提取试剂	中国武汉中智生物技术有限公司	A.10.105-SC-001	用于核酸的提取、富集与纯化。
样本运输培养基	QIAGEN N.V.（荷兰芬洛）	5128-1220	该培养基专为临床样本的采集、保存和运输而设计，可确保沙眼衣原体的活性 和 Neisseria gonorrhoeae 用于后续诊断检测。
恒温离心机	贝克曼库尔特公司（Brea，美国）	SN: MRZ21L037	用于细胞、微生物或核酸的沉淀。
TM 培养基	上海伊华医学科技 &安普科技有限公司（中国上海）	中国上海浦医疗器械备案编号 20140081	TM 培养基可用于从临床标本中分离、培养和鉴定淋病奈瑟菌，以辅助淋病的诊断。
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	25200072	用于传代培养或实验操作过程中贴壁细胞的温和解离。
解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒（RNA扩增-侧向流检测）	中国武汉中智生物技术有限公司	A.10.309-STD-RG-003	用于生殖道和泌尿道拭子样本中解脲脲原体核酸RNA的定性检测。
解脲脲原体和人型支原体选择性分离培养、鉴定及药物敏感性检测试剂盒	河北中艾生生物科技有限公司（中国河北）	冀械注准20152400168	用于解脲脲原体和人型支原体的选择性分离、培养、鉴定及药物敏感性测定。
涡旋混合器	Xinkang Medical Instrument Co. Ltd（江苏，中国）	XK80-A	用于通过快速振荡均质化液体样品的实验室设备