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方法文章

基于RNA扩增侧向流动分析法快速鉴定Neisseria gonorrhoeae、Chlamydia trachomatis和Ureaplasma urealyticum

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DOI：

10.3791/68413

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2025年6月20日

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1The First People's Hospital of Foshan

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种RNA扩增侧向流动检测方法的实验方案，并评估其在快速检测中的有效性 淋病奈瑟菌, 沙眼衣原体，以及 解脲脲原体.

摘要

Neisseria gonorrhoeae（NG）、Chlamydia trachomatis（CT）和Ureaplasma urealyticum（UU）是与性传播疾病（STDs）相关的常见病原体。NG 是淋病的致病菌，可导致泌尿生殖系统多种疾病，包括附睾炎、前列腺炎、宫颈炎以及不孕症。CT 是非淋球菌性尿道炎和盆腔炎性疾病的主要病原微生物。UU 与非淋球菌性尿道炎、宫颈炎、前列腺炎及不孕症相关。目前针对 NG、CT 和 UU 的分子检测技术通常较为复杂且耗时较长。对这些病原体进行快速分子检测有助于性传播疾病的早期诊断。RNA 扩增侧向层析检测法（RGT）是一种无需核酸提取的检测方法。该方法通过裂解样本释放核酸片段，随后经逆转录和转录过程进行扩增。扩增后的 RNA 产物被特异性探针识别并结合，形成 RNA-检测探针-金标探针复合物，该复合物可通过侧向层析作用固定于硝酸纤维素膜上，产生可见条带。整个检测过程耗时不足 1 小时。本研究旨在评估 RGT 在快速检测 NG、CT 和 UU 中的有效性。共纳入 1,416 份样本。RGT 检测 NG、CT 和 UU 与聚合酶链式反应（PCR）荧光探针法相比，一致性分别为 99.03%（307/310）、99.38%（159/160）和 99.02%（303/306）；与基因测序法相比，一致性分别为 99.17%（238/240）、98.95%（188/190）和 98.30%（173/176）。与病原体分离培养法相比，NG、CT 和 UU 检测的检出率均为 100.00%（9/9、17/17、8/8）。该检测方法具有高灵敏度和高特异性、操作简便、检测时间短等优势，适用于 NG、CT 和 UU 的快速、准确检测。

引言

性传播感染（STIs）是全球重大的公共卫生挑战，可导致严重的生殖系统疾病和死亡1。淋病奈瑟菌（NG）是淋病的致病原，全球每年约报告8700万例新发病例2。该病原体主要通过侵入泌尿生殖道的柱状上皮引起炎症反应3。另一种微生物沙眼衣原体（CT）则导致非淋球菌性尿道炎和盆腔感染，每年约有1.3亿例新发病例4。解脲脲原体（UU）是最简单且最小的可自我复制的细胞，易于侵入受损的宫颈组织，与非淋球菌性尿道炎、宫颈炎、前列腺炎及不孕症相关5。这些感染在男性和女性患者中常无症状，但若未及时治疗，可能导致严重并发症。孕妇感染可引发严重的不良妊娠结局，包括死产、流产、早产以及胎儿直接感染6。因此，开发一种快速、灵敏、特异且操作简便的病原体检测方法至关重要。

病原体的快速准确检测对于有效诊断和管理疾病至关重要。传统的培养方法需要对病原体进行分离、培养和鉴定，存在显著缺点，包括耗时长且灵敏度低。尽管基因测序具有较高的准确性，但其需要复杂的环境和设备，导致成本高昂且耗时。针对NG、CT和UU的常规分子检测技术已被广泛接受；然而，这些方法通常操作复杂且耗时，需要精密仪器、专业技术人员以及较长的处理时间。因此，迫切需要一种简单可靠的分子诊断方法，以克服传统技术的局限性。RNA扩增侧向层析检测法（RGT）提供了一种快速、灵敏且特异的替代方案，无需复杂操作步骤7,8。该方法通过直接裂解样本释放核酸片段，无需核酸提取步骤，随后通过逆转录和转录过程对片段进行扩增。扩增后的RNA产物被特异性探针识别并捕获，形成RNA-检测探针-金标探针复合物，该复合物可通过侧向层析作用固定在硝酸纤维素膜上，产生可见条带9。整个过程耗时不足1小时，非常适用于急诊实验室检测。

本研究纳入1,416份样本，用于评估RGT在检测淋球菌（NG）、沙眼衣原体（CT）和解脲脲原体（UU）中的应用。采用RGT、PCR荧光探针法、基因测序及病原体分离培养方法对样本进行分析。结果表明，RGT方法与传统诊断方法具有良好的准确性与一致性。综上所述，该检测方法具有高灵敏度和特异性、操作简便以及检测时间短等优势，适用于NG、CT和UU的快速准确检测，显示出其在性传播疾病初步医学诊断中的良好应用前景。

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方案

本研究遵循中国广东省佛山市第一人民医院机构审查委员会批准的伦理指南（伦理审查文件编号：LR (2025) 136）。共前瞻性收集了1,416份生殖道拭子标本（女性患者716份，男性患者700份），均来自临床怀疑患有性传播疾病且在前14天内未接受抗生素治疗的个体（补充表1）。对每位参与者同时采集成对拭子，并平行进行分析：一份采用检测方法（RGT），另一份采用参考方法（PCR荧光探针法、基因测序和病原体分离培养）。采用Cohen的Kappa系数（κ）量化方法间一致性，并依据Landis与Koch的标准进行解释。

注意：CT 和 UU 的检测方案与 NG 的检测方案在操作步骤上完全相同，仅在病原体特异性试剂方面有所调整。试剂配方的详细信息见步骤 2.1（补充表 2、补充表 3 和 补充表 4）。

1. 样本采集

  1. 适用标本类型：采集生殖道拭子（女性宫颈拭子、男性尿道拭子）。
  2. 标本采集
    1. 将生殖道拭子插入男性尿道口内 2–3 cm，或插入女性宫颈口内约 1–2 cm。
    2. 旋转一周，保持 10 秒。
    3. 取出拭子，将其插入含有 1 mL 生理盐水的采集管中。
    4. 折断并丢弃拭子尾部，然后拧紧管盖。
    5. 记录采集时间，并尽快进行检测。
  3. 标本保存与运输
    1. 标本应在采集后 4 小时内室温（RT）运输，或在 24 小时内使用冰袋于 2–8 °C 条件下运输。
    2. 若无法及时检测，已处理标本的剩余细胞沉淀物可于 -20 °C 保存 3 个月，或于 -80 °C 保存最长 6 个月。

2. 准备

  1. 试剂
    1. 关于淋病奈瑟菌核酸检测试剂，请参见补充表2。
    2. 关于沙眼衣原体核酸检测试剂，请参见补充表3。
    3. 关于解脲脲原体核酸检测试剂，请参见补充表4。
    4. 储存条件：所有试剂应保存在-40 °C至-15 °C之间，检测卡应保存在2 °C至30 °C之间。
      注意：根据每日检测需求，扩增缓冲液和检测试剂在使用前应平衡至室温。达到室温后，应置于4 °C保存，并可用于下一次检测。避免反复冻融。扩增酶除实验过程中外，应保存在-20 °C。储存温度升高可能导致酶活性下降或丧失。
  2. 实验环境要求
    1. 实验应在四个物理分隔的区域中进行：
      1. 试剂准备区：维持温度为22 ± 1°C，正压环境（高效微粒空气（HEPA）过滤气流速率≥ 0.3 m/s）。预分装试剂应存放于经紫外线灭菌的柜内。
      2. 样本处理区：所有标本操作均应在经70%乙醇预处理的II级生物安全柜中进行。
      3. 扩增区：将热循环仪置于防震台面上操作。
      4. 产物分析区：使用经紫外线灭菌的工作台（使用前后各照射30分钟）。
    2. 各区域应规范人员流动和气流方向，以防止交叉污染，具体如下：
      1. 维持从试剂准备区到产物分析区的单向气流。
      2. 确保样本处理区为负压环境（相对于相邻区域为-5 Pa）。
      3. 限制人员移动；在区域间转移前，使用75%乙醇对手套进行去污处理。
      4. 安装带联锁系统的气闸门（开门间隔至少30秒）。
    3. 使用各区域专用的耗材（如离心管、移液器吸头等），且耗材仅限一次性使用，使用后即弃。
    4. 保持清洁并实施质量控制：
      1. 每日使用10%次氯酸钠清洁工作台面，随后用75%乙醇或蒸馏水擦拭。
      2. 通过内毒素检测验证耗材无菌性（鲎试剂细胞裂解物检测法，<0.25 EU/mL）。
      3. 每周使用沉降平板监测空气质量（胰蛋白酶大豆琼脂[TSA]平板，暴露4小时后≤5个菌落形成单位（CFU）/平板）。
  3. 人员资质
    1. 操作人员应具备与PCR技术相关的证书或资质，以确保本实验的准确性和可靠性。

3. 裂解细胞以提取 RNA

  1. 样本处理
    1. 将样本采集管在2,600次/分钟下涡旋振荡10秒，使细胞从拭子头部脱离并进入溶液中。
    2. 使用校准至1000 µL的移液器，转移1 mL溶液至1.5 mL微量离心管中。
    3. 在25 °C下以12,000 × g 离心2分钟。
    4. 小心吸除950 µL上清液，避免扰动沉淀。使用设定为50 µL的200 µL校准移液器，上下吹打10次，将沉淀重悬于25 µL残留溶液中。
  2. 样本及质控材料的裂解
    1. 将细胞裂解缓冲液和阴性质控品在25 °C预平衡15分钟。
    2. 将质控材料在25 °C下以1000 × g 离心10秒，确保所有粉末沉降至管底。
    3. 向质控材料中加入30 µL裂解缓冲液，向样本中加入20 µL裂解缓冲液。
    4. 在25 °C孵育10分钟。
      注意：使用细胞裂解缓冲液时，必须充分混匀。用200 µL吸头吹打15次进行混匀，并将所有颗粒和液体加入沉淀中。阳性对照应在经紫外线处理的II级生物安全柜中操作，随后使用10%次氯酸钠进行去污染处理。

4. RNA 等温扩增

  1. 扩增缓冲液的预平衡
    1. 将扩增缓冲液解冻，并在 25 °C ± 1 °C 条件下平衡 15 分钟。
  2. 对照设置
    1. 每次实验运行中均需包含阳性和阴性对照。
  3. 试管标记
    1. 根据样本数量对扩增试管进行标记。
  4. 反应体系构建
    1. 使用经校准的 20 µL 移液器，向每根试管中加入 17 µL 扩增缓冲液。将 2 µL 样本或对照裂解液直接加入缓冲液液滴中。
      注意：确保裂解液进入缓冲液中时未接触管壁（必要时可短暂离心，500 × g 离心 5 秒）。立即盖紧管盖，防止气溶胶污染。
  5. 热激活
    1. 将试管放入预热的热循环仪中，按照以下程序孵育：
      步骤 1：95 °C 反应 2 分钟（变性）
      ​步骤 2：42 °C 反应 2 分钟（引物退火）。
  6. 酶促扩增
    1. 向每根试管中加入 1 µL 扩增酶，通过轻弹试管 5 次混匀，随后短暂离心（500 × g 离心 5 秒）。立即将试管转移至另一台预热至 42 °C 的热循环仪中，孵育 45 分钟。
      注意：使用独立的孵育设备以避免温度波动，一台设定为 95 °C，另一台设定为 42 °C。对于多样本实验，在向最后一根扩增试管中加入扩增酶的同时，应将其余扩增试管保持在 42 °C 条件下。

5. 侧向层析检测

  1. 检测溶液预平衡
    1. 将检测溶液转移至42 °C的培养箱中，孵育10分钟。
  2. 均质化
    1. 以2,600次/分钟涡旋振荡检测溶液15秒，直至颜色均匀。
  3. 温度维持
    1. 使用前将检测溶液保持在25 °C ± 2 °C条件下，时间不超过30分钟。
  4. 反应启动
    1. 使用经校准的20–200 µL移液器，向每个扩增管中加入30 µL检测溶液。
      注意：加样时移液器吸头必须以45°角接触管壁，以防止气泡产生。
  5. 杂交
    1. 通过移液吹打混合溶液5次，并在预热至53 °C的培养箱中孵育10分钟。
  6. 检测装置准备
    1. 从铝箔袋中取出检测卡。
      注意：避免触碰样本加样区。
  7. 样本加样
    1. 使用20–200 µL移液器，将全部混合液转移至检测卡的样本孔中。
    2. 立即把检测卡放入42 °C培养箱中孵育15分钟。

6. 结果分析

  1. 读取结果的受控环境
    1. 在目视判读期间，将检测卡置于预热至 53 °C 的培养箱中，以稳定信号强度。
  2. 目视判读步骤
    1. 在 10–20 分钟内通过肉眼直接观察检测卡上的条带读取检测结果。
      注意：结果在 20 分钟后失效。
  3. 关于 RGT 结果判读的解释矩阵，请参见补充表 5。
    注意：结果的目视判读示例见图 1。

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结果

RGT 与 PCR 荧光探针检测方法的一致性
共分析了 310 份淋球菌（NG）样本，包括 161 份女性样本和 149 份男性样本。阳性符合率为 98.78%（95%CI：93.39%–99.97%），阴性符合率为 99.12%（95% CI：96.87%–99.89%）。总体符合率为 99.03%（95% CI：97.20%–99.80%）。Kappa 一致性值为 0.975（95% CI：0.947–1.003，Z = 17.171，P < 0.05）（表 1）。共有三份样本结果不一致：一份样本使用 PCR 荧光探针法检测为阳性而 RGT 检测为阴性，基因测序复核确认为阴性结果；在两份 RGT 检测为阳性而 PCR 检测为阴性的样本中，基因测序确认其中一份为真阳性（RGT 结果与测序结果一致），另一份为假阳性（RGT 阳性但测序结果为阴性）。

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讨论

本研究采用RGT检测性传播感染病原体，包括淋球菌（NG）、沙眼衣原体（CT）和解脲脲原体（UU）。在严格执行操作规程的条件下，RGT检测结果与已建立的诊断方法（如PCR荧光探针法、基因测序及病原体分离培养技术）具有高度一致性。通过与既定标准方法的比较分析表明，RGT检测的灵敏度和特异性均与先前报道的方法相当或更优10,11。

RGT 方法的可靠性取决于多个关键的实验步骤。样本均质化必须在 2,600 次/分钟的转速下持续 10 秒，以确保拭子上的细胞完全脱落。通过轻柔振荡随后迅速离心，充分混匀扩增缓冲液和检测试剂溶液，对于实现试剂均一性并防止扩增效率降低至关重要。在转移试剂过程中必须仔细避免引入气泡，因为此类人为因素可能影响反应的可重复性。由于所需体积极小（1 µL），必须使用低吸附枪头将扩增酶精确移取至微芯片的反应腔室，以确保底物充分接触。此外，若在试剂复溶后检测试剂溶液中仍存在持续不溶的颗粒物，则必须弃用该试剂，因为残留沉淀物可能干扰光学读数或反应动力学。

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披露

作者无任何利益冲突需披露。

致谢

感谢武汉中智生物技术有限公司为本研究提供的试剂和技术指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% (w/v)  次氯酸钠实验室中的准备工作。实验室中的准备工作。用于设备或表面去污及病原体灭活的稀释漂白剂溶液
75% (v/v) 乙醇安徽安特食品有限公司http://www.antegroup.com/product_detail_cn/id/81.html用于表面消毒的乙醇水溶液
可调体积移液器（0.5–10 μLDLAB Scientific Co., Ltd.7010101004单通道微量移液器，用于精确操作微升级体积。
可调体积移液器（100–1000 μLDLAB Scientific Co., Ltd.7010101014单通道移液器，已校准用于大体积液体操作。
可调体积移液器（10–100 μLDLAB科学有限公司7010101008适用于中等体积的单通道移液器，常用于分子生物学实验方案。
可调体积移液器（20–200 μLDLAB Scientific Co., Ltd.7010101009用于中等体积转移的单通道移液器，适用于试剂的精确分装。
生物安全柜（HF Safe-1200）HealForce Bio-Meditech Holdings Limited（中国香港）HF Safe-1200II级生物安全柜，可在处理致病性微生物或细胞培养物时提供人员、样本及环境的防护。
离心管中国广州昊志医疗器械有限公司中国广州越秀医疗器械备案编号 20210414用于核酸提取、细胞沉淀及其他实验室操作。
沙眼衣原体（CT）核酸检测试剂盒（RNA扩增-侧向层析检测）中国武汉中智生物技术有限公司A.10.309-STD-RG-002用于女性生殖道及泌尿道拭子样本中沙眼衣原体核酸RNA的定性检测。
CO2 培养箱赛默飞世尔科技（阿什维尔，美国）有限责任公司SN:300504406用于细胞培养，提供温度可控（37℃）的稳定环境°摄氏度）、湿度和CO₂2 浓度（通常为5%）以确保细胞最佳生长。
培养皿 康宁公司（康宁，美国）50 mm ´ 9 mm用于贴壁细胞的培养与扩增。
沙眼衣原体（CT）核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）复星诊断（上海，中国）有限公司中国医疗器械注册证编号 20143402234用于定性检测生殖道和泌尿道拭子样本中沙眼衣原体的核酸。
淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）复星诊断（上海，中国）有限公司中国医疗器械注册证编号 20173401080用于定性检测生殖道和泌尿道拭子样本中淋病奈瑟菌的核酸。
解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒（荧光探针PCR法）复星诊断（上海，中国）有限公司中国医疗器械注册证编号 20173400536用于生殖道和泌尿道拭子样本中解脲脲原体核酸的定性检测。
DMEM 培养基赛默飞世尔科技公司（美国沃尔瑟姆）11965092用于沙眼衣原体培养。
滤芯吸头（10 μL中国广州苏尔百普生物科技有限公司（中国广州）TF-10-BXL用于实验中的精确移液。
滤芯吸头（200 μL中国广州 Surbiopure 生物技术有限公司（中国广州）TF-200-BXL用于实验中的精确移液。
生殖器拭子中国广州昊志医疗器械有限公司Hz112用于从生殖道黏膜表面采集临床标本的无菌棉签。
Gibco 胎牛血清（FBS）赛默飞世尔科技公司（美国沃尔瑟姆）10270106用于沙眼衣原体培养。
载玻片中国广州昊志医疗器械有限公司中国广州越秀医疗器械备案编号 20210414经防褪色处理的标准载玻片，用于制备细胞涂片或组织切片，适用于革兰染色方案。
Goldenstar RT6 cDNA合成试剂盒 Ver2北京清科生物科技有限公司（中国北京）TSK302S用于两步法RT-PCR第一步中cDNA第一链的合成。它包含由RNA合成cDNA所需的所有试剂。
革兰氏染色试剂盒Baso 诊断有限公司（中国珠海）BA4012一种染色试剂盒，包含结晶紫、碘液、脱色剂和沙黄，用于鉴别淋病奈瑟菌。 
IBM SPSS Statistics（V25.0）国际商业机器公司（美国纽约）版本 25.0用于数据分析。
红外线灭菌器华熙新锐（青岛）分析仪器有限公司MJ-200W用于接种环或镊子的即时去污，以最大限度减少生物安全柜中的交叉污染。
接种环中国湖南BKMAM生物技术有限公司110306002用于微生物样品的转移、划线或接种。
倒置显微镜（IX-51）奥林巴斯株式会社（日本东京）实验室资产代码：  71807101用于在培养皿中观察贴壁细胞或活细胞动态。
MALDI Biotyper 自动化微生物质谱系统布鲁克道尔顿公司 & Co. KG（德国不来梅）国家医疗器械进口注册号 20182222017一种基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的蛋白质谱分析系统，用于快速微生物鉴定，可在临床微生物学实验室中实现细菌和真菌的种水平鉴定。
McCoy细胞系在实验室中保存。在实验室中保存。用于沙眼衣原体培养。
Microplate Thermostatic Incubator Leopard70-4（4块板容量）Leaptec Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd.Leopard70-4可容纳最多4块标准微孔板的微孔板孵育器，温度范围为室温至70℃°C,  用于孵育步骤。
显微镜（OLYMPUS CX43）奥林巴斯株式会社（东京，日本）https://lifescience.evidentscientific.com.cn/zh/microscopes/upright/cx43-33/用于临床样本观察（例如，细胞形态、染色标本）。
迷你金属浴 MiniG-R100Leaptec Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd.MiniG-R100用于实验过程中对小体积样品快速调节温度，例如加热、孵育或终止反应。
淋病奈瑟菌（NG）核酸检测试剂盒（RNA扩增-侧向层析检测）中国武汉中智生物技术有限公司A.10.309-STD-RG-001用于定性检测生殖道和泌尿道拭子样本中淋病奈瑟菌核酸RNA。
核酸提取试剂中国武汉中智生物技术有限公司A.10.105-SC-001用于核酸的提取、富集与纯化。
样本运输培养基QIAGEN N.V.（荷兰芬洛）5128-1220该培养基专为临床样本的采集、保存和运输而设计，可确保沙眼衣原体的活性 和 Neisseria gonorrhoeae 用于后续诊断检测。
恒温离心机贝克曼库尔特公司（Brea，美国）SN: MRZ21L037用于细胞、微生物或核酸的沉淀。
TM 培养基上海伊华医学科技 &安普科技有限公司（中国上海）中国上海浦医疗器械备案编号 20140081TM 培养基可用于从临床标本中分离、培养和鉴定淋病奈瑟菌，以辅助淋病的诊断。
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）25200072用于传代培养或实验操作过程中贴壁细胞的温和解离。
解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒（RNA扩增-侧向流检测）中国武汉中智生物技术有限公司A.10.309-STD-RG-003用于生殖道和泌尿道拭子样本中解脲脲原体核酸RNA的定性检测。
解脲脲原体和人型支原体选择性分离培养、鉴定及药物敏感性检测试剂盒河北中艾生生物科技有限公司（中国河北）冀械注准20152400168用于解脲脲原体和人型支原体的选择性分离、培养、鉴定及药物敏感性测定。
涡旋混合器Xinkang Medical Instrument Co. Ltd（江苏，中国）XK80-A用于通过快速振荡均质化液体样品的实验室设备

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