本方案详细描述了在3D打印水凝胶肿瘤切片中生成、培养和分析套细胞淋巴瘤的方法。
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摘要
摘要
套细胞淋巴瘤（Mantle cell lymphoma, MCL）是一种罕见且具有侵袭性的B细胞肿瘤，常出现复发，并对传统化疗反应有限。MCL研究中的一个主要挑战是原代MCL细胞的培养 离体，因为细胞在二维悬浮培养中容易发生自发性凋亡。尽管三维模型已知能更真实地模拟 体内 实体瘤的应用情况相比，其在淋巴瘤中的应用仍鲜有探索。开发可模拟淋巴瘤的三维模型 在体 淋巴结内套细胞淋巴瘤（MCL）的微环境条件可能有助于提高其存活率，促进对MCL肿瘤与微环境之间相互作用的研究，并模拟其体内生理状态。 体内 药物反应。本研究建立了以水凝胶肿瘤切片形式存在的套细胞淋巴瘤（MCL）3D打印模型，并优化了其培养方法。该标准化流程使用MCL细胞系或原代MCL细胞，将细胞悬浮于含有海藻酸钠、I型胶原和基底膜基质的水凝胶中，通过生物打印技术将其沉积至明胶支撑浴中。所得MCL水凝胶肿瘤切片在滤膜支持物上进行培养，以在整个培养期间维持其结构稳定性。该系统可接受药物处理，并可通过四色活细胞3D荧光成像技术追踪水凝胶肿瘤切片内单个细胞的反应。原代MCL细胞在水凝胶肿瘤切片中培养时表现出稳定的存活能力。本方案详细描述了MCL细胞在水凝胶肿瘤切片中的生成、培养与分析过程。该模型通过高度模拟肿瘤微环境并采用气-液界面培养方式，相较于传统的二维培养，显著提高了生理相关性，在MCL的生物学与治疗学研究中具有重要应用前景。
引言
套细胞淋巴瘤（MCL）是一种罕见且具有侵袭性的B细胞非霍奇金淋巴瘤，起源于淋巴结的套区1。套区由围绕B细胞滤泡生发中心的一圈小型淋巴细胞构成。通常情况下，MCL呈现侵袭性临床病程，在初始化疗后常出现复发。随着对疾病发生机制的深入理解1以及新型治疗方法的发展，包括免疫化疗2、布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂3和抗体-药物偶联物4，MCL患者的治疗选择已显著增加，缓解率提高，无进展生存期延长。然而，药物耐药性和疾病复发仍使该病目前无法治愈5。部分原因在于其异质性以及肿瘤微环境对肿瘤发展和药物耐药性的影响6。研究MCL的一个挑战在于原代MCL细胞难以在悬浮培养中长期存活7，因为这些细胞在体外会自发发生凋亡ex vivo4,5。 这凸显了在临床前模型中建立更优MCL模拟方法的必要性。
体内，肿瘤是由多种细胞成分（包括肿瘤细胞、免疫细胞和间质细胞）以及非细胞成分（如细胞外基质，ECM）构成的三维（3D）结构。ECM由胶原蛋白和层粘连蛋白等大分子组成，形成一种富含弹性纤维的复杂网状结构，具有高度亲水性，可形成凝胶样环境2,8,9,10。为了在体外更好地模拟肿瘤的体内环境 ex vivo，研究人员已开发出多种3D 模型。近年来，这些模型在癌症药理学和生物学研究中变得至关重要，主要聚焦于实体瘤11。
迄今为止，淋巴瘤领域对这一方向的研究仍然较为有限，因为血液系统肿瘤细胞既能在悬浮状态下生长，也能在淋巴结、骨髓或次级淋巴组织等基质环境中增殖12. 体内，套细胞淋巴瘤（MCL）细胞可从淋巴结的套区扩散至血液或骨髓，但其主要仍在起源的淋巴结内增殖13,14。在淋巴结内，MCL细胞被T细胞、巨噬细胞和间充质基质细胞所包围，这些细胞已被证实能够调控MCL细胞的存活状态或对药物的反应14,15,16,17,18。此外，MCL肿瘤与微环境之间的相互作用，以及微环境的孔隙率和力学特性，都是影响药物反应和耐药性的重要因素6,14。因此，需要建立标准化且可重复的、能够模拟天然微环境的MCL三维肿瘤模型，以用于原发性MCL的研究。迄今为止，主要已建立基于细胞的模型，例如原发性MCL细胞的球状体或类器官模型6,19，这些模型可有效提高原发性MCL细胞的存活率并支持其长期培养。然而，这些模型中对细胞外基质的模拟仍显不足。在此背景下，先进的三维生物打印技术提供了一种颇具前景的解决方案。该技术通过直接组装活细胞与水凝胶，能够构建出具有生理相关性的、基于水凝胶的三维淋巴结模型。
在此，建立了以水凝胶肿瘤切片形式的内侧副韧带（MCL）三维生物打印模型，并优化了培养方法。通过悬浮水凝胶自由形态可逆包埋（FRESH）生物打印技术，将细胞包埋于基于I型胶原蛋白、海藻酸盐和Matrigel的水凝胶切片中。20水凝胶肿瘤切片培养在滤膜支持物上，该设置可使MCL细胞在高度模拟体内环境的条件下生长 体内 淋巴结的状况。
本方案详细描述了套细胞淋巴瘤（MCL）细胞在水凝胶肿瘤切片中的生成、培养和分析方法。通过采用四色活体三维荧光成像技术，可追踪水凝胶肿瘤切片内单个细胞的存活状态或药物反应。实验表明，原代MCL细胞在水凝胶肿瘤切片中培养时存活率显著提高。该模型为研究MCL的生物学特性及治疗反应提供了有力工具，有助于深入理解微环境影响因素以及不同MCL患者之间的个体差异。
方案
使用原代套细胞淋巴瘤（MCL）细胞的研究必须获得当地伦理委员会的批准。本研究中，埃伯哈德-卡尔斯-图宾根大学医学院及图宾根大学医院伦理委员会已批准患者和健康供体样本的采集与处理（项目编号：159/2011BO2），并根据《赫尔辛基宣言》的要求获得了患者的书面知情同意。本研究所用的原代MCL细胞分离自套细胞淋巴瘤患者的完整淋巴结，因此不仅包含MCL细胞，还包括免疫细胞和成纤维细胞等其他细胞。
1. 支持浴用明胶浆液的制备
注意：明胶悬液将在3D生物打印过程中作为支撑浴使用。它可诱导生物墨水发生交联，从而形成3D结构。明胶悬液的制备必须在细胞培养罩内的无菌条件下进行。
- 在10 mM HEPES和11 mM CaCl₂中配制4.5%（w/v）的明胶溶液2 通过将6.75 g明胶粉末溶解于1.5 mL 1 M HEPES和15 mL 110 mM CaCl中2和 133.5 mL 无菌 H2将样品放入带盖的无菌梅森罐中。确保该梅森罐适用于高速混合器中混合。
- 在37°C下孵育溶液4小时，或直至搅拌时观察不到浑浊物，表明明胶已完全溶解。将明胶在4°C下冷却过夜，或至少12小时。
- 配制含有10 mM HEPES和14.4 mM CaCl的无菌洗涤缓冲液2将洗涤缓冲液预冷至4°C。
- 使用无菌勺子将凝固的4.5%明胶打碎成若干小块。
- 用预冷的洗涤缓冲液完全填充装有4.5%明胶的梅森罐，确保在制备明胶悬液的过程中缓冲液始终保持低温。
- 将含有明胶的梅森罐在 -20°C 冻结 45–60 分钟，直至明胶悬液温度降至 0°C，但尚未开始形成冰晶。使用温度计监测温度。
- 将搅拌机盖子和刀片安装到梅森罐上，然后将梅森罐固定到搅拌机上。使用脉冲模式搅拌明胶悬浮液120秒。
注意：使用不同类型的搅拌器时，可能需要调整搅拌器的设置。 - 将混合悬浮液转移至预冷的50 mL离心管中。在3,800 x g 4°C下离心2分钟。确保悬浮液分离为底部的固体明胶浆和上层的液体洗涤缓冲液。
- 在冰上进行以下步骤：洗涤明胶悬液。吸除上层液体，尽量去除洗涤缓冲液表面可见的气泡。向离心管中加入 20 mL 新鲜的 4°C 洗涤缓冲液。涡旋振荡离心管，使明胶悬液与洗涤缓冲液充分混匀。
- 重复离心和洗涤过程至少3次，或直至洗涤缓冲液顶部无可见气泡。最后一次洗涤后，通过抽吸去除残留的洗涤缓冲液。明胶悬液可在4°C下保存数周。
2. 含细胞生物墨水的制备
- 在打印前1-2天配制无菌的5%海藻酸钠溶液。将1 g海藻酸钠加入含有20 mL无菌PBS的50 mL离心管中。为防止干燥的海藻酸钠粉末残留，应分次少量加入PBS，并在每次添加之间进行涡旋振荡。将溶液置于37 °C水浴中孵育数小时，或在室温下于旋转仪上过夜孵育。待海藻酸钠完全溶解后，将溶液储存于4 °C备用。
- 若使用MCL细胞系，需将细胞在T75培养瓶中悬浮培养。在打印当天，确保有1.4 × 107个细胞可用于制备1 mL生物墨水，该体积可生成9-10个水凝胶肿瘤切片。
- 若使用原代MCL细胞，则无需在生物打印前进行悬浮培养。在生物打印前直接解冻冻存的原代MCL细胞。将原代MCL细胞转移至含培养基的50 mL离心管中。为去除残留的冻存液，立即以340 × g离心5分钟，弃去上清液。用20 mL新鲜培养基重悬细胞沉淀，用于细胞计数。
- 在打印当天，根据目标细胞类型配制相应的生物墨水。对于Jeko-1细胞，配制含0.5% (w/v) 海藻酸钠、20% (v/v) I型胶原蛋白、1× RPMI和2 mM HEPES的生物墨水。取100 µL 5%海藻酸钠溶液、200 µL I型胶原蛋白、100 µL 10× RPMI、200 µL 10 mM HEPES和350 µL PBS混合，得到1 mL生物墨水。细胞将在步骤2.6中加入。
- 对于原代MCL细胞，配制含0.5% (w/v) 海藻酸钠、20% (v/v) I型胶原蛋白、1× RPMI和0.5 mM HEPES的生物墨水。取100 µL 5%海藻酸钠溶液、200 µL I型胶原蛋白、100 µL 10× RPMI、50 µL 10 mM HEPES和500 µL基底膜基质混合，得到1 mL生物墨水。细胞将在步骤2.6中加入。若使用MCL细胞系，将细胞悬液从培养瓶转移至50 mL离心管中。
- 将细胞与0.4%台盼蓝按1:1比例混合，使用细胞计数仪或血球计数板对活细胞（未染色细胞）进行计数。计算获得1.4×107个细胞所需的细胞悬液体积，并将该体积的细胞悬液转移至新的50 mL离心管中。以340 × g离心5分钟，弃去上清液。将细胞沉淀重悬于已配制的生物墨水中，得到最终含细胞的生物墨水。
注：估计细胞沉淀体积约为50 µL培养基。结合步骤2.4中配制的生物墨水，总体积为1 mL。
3. 浴内生物打印
注意：如果可能，应在无菌环境中进行3D打印过程，例如在细胞培养罩内。 所使用的3D打印机已通过添加注射泵扩展装置进行改造，以适用于FRESH打印，具体方法见Hinton等人的研究20。
- 打开生物打印机并连接至3D打印软件。打开包含水凝胶肿瘤切片设计图的.stl文件。可同时打印最多5个切片。确保每个水凝胶肿瘤切片的直径为8 mm，高度为1.5 mm。将填充密度设置为85%。校准打印头。
注：该STL文件使用Fusion 360设计，可在补充代码文件1中找到。3D打印过程中使用了Cura Version 15.04.5软件。 - 将先前制备好的明胶浆液转移至直径为35 mm的培养皿中，填充至一半体积。确保明胶浆液中无气泡残留。使用一次性精密擦拭纸吸除浆液中多余的水分，形成具有塑性、可保持形状直至受到足够外力作用的明胶支撑浴。
- 将含细胞的生物墨水转移至2.5 mL玻璃注射器中，并连接至0.8 mm钝头喷嘴。将注射器倒置，小心排出多余空气和气泡。注射器准备完成后，将其插入生物打印机。通过3D打印软件挤出生物墨水，直至墨水开始从喷嘴流出。使用一次性科学精密擦拭纸擦除流出的墨水液滴，防止喷嘴堵塞。
- 将明胶支撑浴置于注射器喷嘴正下方。降低打印头，使喷嘴位于明胶浆液内部，距离支撑浴底部2 mm处。
- 通过3D打印软件启动打印过程。
- 打印过程完成后，清除喷嘴上多余的明胶浆液以防止堵塞。取出含有水凝胶肿瘤切片的支撑浴，并加盖以维持无菌状态。
- 将含有已打印水凝胶肿瘤切片的支撑浴在37 °C条件下孵育，使明胶融化。此步骤将使打印的水凝胶肿瘤切片从支撑浴中释放出来。
- 预先将洗涤缓冲液和细胞培养基加热至37 °C。在明胶融化的同时，准备6孔板用于清洗水凝胶肿瘤切片。在两个孔中加入10 mM HEPES、14.4 mM CaCl2 洗涤缓冲液（与清洗明胶浆液所用缓冲液相同），另两个孔中加入细胞培养基。
- 明胶完全融化后，使用无菌刮铲将水凝胶肿瘤切片转移至洗涤缓冲液中。每个切片依次在两个含洗涤缓冲液的孔中各清洗1分钟，随后在两个含培养基的孔中各清洗1分钟。含细胞的水凝胶肿瘤切片现已准备好用于培养。
- 保留剩余的生物墨水，以便重复打印过程。
4. 水凝胶肿瘤组织切片培养与处理
- 为了培养水凝胶切片，将其转移至置于6孔板内的滤膜支持物上（孔径0.4 µm）。每个滤膜支持物上可培养最多5个水凝胶切片。在滤膜支持物下方加入1.5 mL细胞培养基。在水凝胶肿瘤切片表面滴加一滴培养基，以防止其干燥。
- 对水凝胶肿瘤切片进行药物处理时，将所需浓度的药物加入细胞培养基中。此处，水凝胶肿瘤切片使用0.33 µM–27 µM的阿霉素处理48小时或72小时。始终将一组切片在无药物条件下培养作为对照。
- 将含有水凝胶肿瘤切片的6孔板置于细胞培养箱中，在37 °C和5% CO2 条件下培养所需时间。
5. 台盼蓝排染法检测细胞活力
- 为评估培养或处理后细胞的活力，需溶解水凝胶包埋的肿瘤切片。将一个水凝胶肿瘤切片转移至1.5 mL离心管中。每片加入500 µL溶解缓冲液（含30 mM EDTA、55 mM柠檬酸钠和150 mM氯化钠，pH 6.8）。反复吹打直至水凝胶完全溶解。
- 将溶液在340 × g 条件下离心5分钟。吸除上清液。每份溶解后的水凝胶切片用500 µL培养基重悬细胞。
- 按1:1比例将细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液混合。使用细胞计数仪或血球计数板计数活细胞（未染色）和死细胞（染色）。记录活细胞与死细胞数量，用于后续分析。
6. 四色活体三维荧光成像
注意：此处使用的四色染色法可允许 活细胞（TMRM阳性）、凋亡细胞（荧光性Caspase-3底物阳性）与死细胞（PicoGreen阳性）的区分21,22,23细胞核使用 DRAQ5 进行检测。然而，本方案可调整为使用任何其他光稳定性良好的特异性荧光染料，以检测目标生物标志物、细胞结构或细胞类型。染色前，需确保显微镜能够检测所用荧光染料的激发波长。
- 对于水凝胶肿瘤切片的四色染色，将TMRM、DRAQ5和荧光原性Caspase-3底物加入1 mL细胞培养基中，终浓度分别为0.5 µM、5 µM和2 µM，配制染色液。
- 使用无菌刮铲将水凝胶肿瘤切片转移至带腔室的玻璃盖玻片中，加入配制好的染色液，完全覆盖水凝胶切片。将样品在37 °C避光孵育20分钟。
- 初始孵育后，收集覆盖水凝胶肿瘤切片的染色液，并加入0.7 µL/mL PicoGreen。用移液器将染色液重新加回到水凝胶切片上，在37 °C避光继续孵育10分钟。
- 孵育结束后，小心移除多余的染色液，保留足够液体以保持水凝胶切片湿润。
- 立即使用共聚焦显微镜分析切片。为避免光毒性和荧光淬灭，应通过降低激光强度和激发时间来最小化光子剂量。上述染料的激发/发射光谱见表1。
- 为获得水凝胶中细胞分布的整体情况，采集z轴层扫图像。若成像过程中已获取z轴层扫图像，可使用相应软件对水凝胶肿瘤切片进行三维重建。这些三维重建图像有助于全面分析水凝胶肿瘤切片中细胞的空间分布及细胞状态。
- 按照补充文件1 和补充文件2中提供的说明和脚本进行细胞分割与重建。
结果
含有MCL细胞的水凝胶肿瘤切片是根据上述方案制备的。3D打印及培养水凝胶肿瘤切片的工作流程步骤如图所示 图1A所使用的3D打印机已通过添加注射泵扩展装置进行改造，以适用于FRESH打印，具体方法如Hinton等所述。20 (图1B)一次最多可打印五个切片（图1C）并在一个滤膜支持物上培养（图1D。在滤膜支撑层下方加入培养基，以为水凝胶肿瘤切片提供营养供应。在每块水凝胶肿瘤切片上方滴加一滴培养基，以防止其干燥。图中显示了在同一滤膜支撑层上培养的五个水凝胶肿瘤切片的总体示意图 图1E, 以及水凝胶切片的特写图像。在为期3天的培养期间，水凝胶肿瘤切片保持稳定，并维持其结构完整性（图2A）。打印后立即出现的气泡存在于水凝胶肿瘤切片中，但在培养过程中逐渐消失 (图2A).
通过台盼蓝排斥实验评估了在水凝胶肿瘤切片（3D）中培养的MCL细胞系Jeko-1与在悬浮培养（2D）中培养的Jeko-1细胞的存活率（图2B）。培养3天后，3D条件下的细胞存活率为80%，而打印前Jeko-1细胞的初始存活率为88%。在2D条件下培养的Jeko-1细胞则维持了88%的初始存活率。2D与3D条件下培养的Jeko-1细胞之间存活率无显著差异。为评估Jeko-1细胞是否在水凝胶切片中增殖，测定了每片水凝胶中Jeko-1细胞的平均数量（图2C）。每片切片在打印后（d0）初始含有5×105个Jeko-1细胞，经过3天培养后，细胞数量几乎翻倍，达到9.3×105个。
通过四色活体荧光成像（图2D）评估了Jeko-1细胞在水凝胶切片中培养后的分布情况和状态，分别在打印后或培养3天后进行观察。打印后，Jeko-1细胞水凝胶切片的三维重建图像显示细胞分布均匀。大多数细胞线粒体膜电位标记物TMRM呈阳性22，少数细胞表现为Caspase-3活性阳性，提示发生凋亡诱导23，同时死细胞标记物PicoGreen也呈阳性21。培养3天后，细胞数量增加，并形成了细胞簇。大部分细胞仍保持TMRM阳性，仅有少量细胞呈Caspase-3活性或PicoGreen阳性（图2C）。
为分析水凝胶切片中的套细胞淋巴瘤（MCL）细胞是否对化疗药物具有响应性，将悬浮培养（二维，2D）或水凝胶切片中培养（三维，3D）的Jeko-1细胞用阿霉素（Doxorubicin）处理，后者是MCL患者标准治疗方案的一部分24在阿霉素处理过程中，水凝胶切片的整体结构得以保持（图3A）。Jeko-1细胞在水凝胶切片中培养时，其活力随阿霉素处理呈剂量依赖性下降。与2D悬浮培养的Jeko-1细胞（IC50=2.0 µM）相比，水凝胶切片中培养的Jeko-1细胞对阿霉素的IC50升高（IC50=5.8 µM）。; 图3B）。四色活体荧光成像显示，经阿霉素处理后，在水凝胶切片中培养的Jeko-1细胞的TMRM信号降低，PicoGreen信号增强，证实药物处理导致细胞活力下降。通过四色活体荧光成像获得的图像经三维重建，并基于DRAQ5细胞核信号进行分割，随后使用文中所述的Python脚本进行分析 补充文件 1一个典型的分割掩膜如图所示 补充图 1通过DRAQ5信号确定的细胞数量用于计算总细胞数。TMRM、PicoGreen和Caspase-3活性阳性细胞数量分别用于确定活细胞、死细胞或凋亡细胞的百分比。对在水凝胶切片中培养3天的Jeko-1细胞进行四色活体荧光染色定量分析，结果显示，无论是否添加9 µM阿霉素，其细胞活力与台盼蓝排斥实验结果相当。 （表2）.
除了已建立的套细胞淋巴瘤（MCL）细胞系外，还培养了三位不同MCL患者的原代MCL细胞，分别采用二维悬浮培养或三维水凝胶切片培养 (图4，补充图 2)经病理学家证实，所有三个套细胞淋巴瘤样本（患者1-3）均表现为经典的常见形态，Ki67指数为20%-50%。原代套细胞淋巴瘤细胞包含从患者淋巴结中分离出的所有细胞类型，因此不仅含有套细胞淋巴瘤细胞，还含有其他类型的免疫细胞或基质细胞。通过台盼蓝排斥法检测原代套细胞淋巴瘤水凝胶切片的细胞活力。培养4天后，水凝胶切片中的原代套细胞淋巴瘤细胞活力维持在43.6%（第3天为45.7%），而打印前的基线活力为71.0% (图 4A)与悬浮培养（二维培养）的细胞相比，其存活率有所提高，后者在培养四天后存活率为19.6%（第三天为28.4%）。通过四色活细胞荧光成像可观察到该存活情况，其中大多数细胞呈TMRM阳性，表明具有活性，而亚群细胞分别对Caspase-3活性和PicoGreen呈阳性，提示发生凋亡和细胞死亡 (图4B)定量数据 图4B 如图所示 表 2. 来自另外两名MCL患者的原代细胞在水凝胶切片（3D）中培养时，其细胞存活率较相应的2D悬浮培养有所提高补充图1.
图1： 水凝胶肿瘤切片三维打印工作流程。（A）水凝胶肿瘤切片中细胞的三维打印与培养工作流程。（B）用于在明胶支撑浴中进行水凝胶切片三维生物打印的打印机设置。（C）在三维打印机软件中打印设计蓝图。可同时打印最多五个水凝胶切片。（D）水凝胶切片培养的示意图。水凝胶切片在6孔板中的滤膜支撑上进行培养。在每个水凝胶切片上方添加一滴培养基以保持其湿润。一个滤膜支撑上最多可培养五个水凝胶切片。（E）在滤膜支撑上培养的三维打印水凝胶切片，图中显示了整体图像和放大图像。比例尺如图所示，分别为5 mm、1 mm或200 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
图2：套细胞淋巴瘤（MCL）细胞系在3D打印水凝胶切片中的培养。(A) 打印后（d0）或培养3天后（d3）含有MCL细胞系Jeko-1的代表性水凝胶切片的局部放大图。比例尺为1 mm。(B) 通过台盼蓝排斥法检测悬浮培养（2D）或水凝胶切片中培养（3D）2天后的Jeko-1细胞活力。数据表示三次独立生物打印实验的均值±标准差。(C) 每个水凝胶切片中直接在打印后（d0）或培养最多3天后（d1–d3）的Jeko-1细胞数量。数据表示三次独立生物打印实验的均值±标准差。未观察到统计学显著差异（n.s.，p > 0.05，Mann-Whitney检验）。(D) 打印当天（d0）或培养3天后（d3）Jeko-1水凝胶切片的三维重建图像。该模型由四色活细胞三维荧光成像的z轴层扫图像生成。活细胞显示为红色（TMRM），凋亡细胞为黄色（Caspase-3酶活性），死细胞为绿色（PicoGreen），细胞核为蓝色（DRAQ5）。比例尺为50 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：套细胞淋巴瘤（MCL）细胞系在水凝胶切片中的药物处理。(A) 经3 µM阿霉素处理3天（d3）后的代表性水凝胶切片局部放大图，其中包含MCL细胞系Jeko-1。比例尺为1 mm。(B) Jeko-1细胞在悬浮培养（2D）或水凝胶切片（3D）中培养，并用不同浓度的化疗药物阿霉素处理2天。通过台盼蓝排斥法检测细胞活力。结果显示为四次独立生物打印实验的平均值±标准差。（C）Jeko-1水凝胶切片经9 µM阿霉素（Doxo）处理3天（d3）后的三维重建图像。该模型基于四色活细胞三维荧光成像的z轴层扫图像生成。活细胞显示为红色（TMRM），凋亡细胞为黄色（Caspase-3酶活性），死细胞为绿色（PicoGreen），细胞核为蓝色（DRAQ5）。比例尺为50 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。
图 4：原发性套细胞淋巴瘤细胞在3D打印水凝胶切片中的培养。（A）通过台盼蓝排斥法检测，原发性套细胞淋巴瘤细胞在悬浮培养（二维）或水凝胶切片（三维）中培养长达4天后的存活率。显示的是单次实验的平均存活率。（B）原发性套细胞淋巴瘤细胞在水凝胶切片（三维）中培养3天后的三维重建图像。Z轴层扫图像来自经四色活细胞染色的水凝胶切片，并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行分析。活细胞显示为红色（TMRM），凋亡细胞为黄色（Caspase-3酶活性），死细胞为绿色（PicoGreen），细胞核为蓝色（DRAQ5）。比例尺为50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
| 染色剂 | TMRM | DRAQ5 | NucView405 Caspase-3 底物 | PicoGreen |
| 激发/发射波长 | 548 nm/574 nm | 647 nm/681 nm | 429 nm/469 nm | 488 nm/520 nm |
表 1：用于四色活体三维荧光成像的染料的激发/发射最大值。
| 样品 | 细胞百分比 | ||
| TMRM（活细胞） | PicoGreen（死细胞） | Caspase-3（凋亡细胞） | |
| Jeko-1 Ctrl | 83 | 23.6 | 18.3 |
| Jeko-1 Doxo 9 µM | 27.6 | 81.3 | 86.6 |
| 原代MCL患者1 | 75.2 | 31.1 | 33.1 |
表2：水凝胶肿瘤切片三维重建的定量分析（四色活体染色）。水凝胶包埋的肿瘤切片培养3天，包含Jeko-1细胞（有或无9 µM阿霉素处理）或套细胞淋巴瘤原代细胞（患者1）。
补充图 1：通过四色活体染色的三维重建进行细胞鉴定。 由 DRAQ5 标记的共聚焦图像进行三维重建的结果，该图像来源于（A）四色活体染色，以及（B）使用 Python 图像分析流程生成的该通道的分割图像。比例尺为 200 µm。请点击此处下载该图。
补充图 2：患者 2 和患者 3 的原代 MCL 细胞在水凝胶肿瘤切片中的培养。 通过台盼蓝排斥法检测原代 MCL 细胞在悬浮培养（2D）或水凝胶切片培养（3D）条件下培养长达 4 天后的存活率，图中显示（A）患者 2 或（B）患者 3 一次实验的平均存活率。请点击此处下载该图。
补充文件 1：四色活体染色获得的三维重建图像的分析指南。 请点击此处下载该文件。
补充文件 2：用于分析四色活体染色获得的三维重建图像的 Python 脚本。 请点击此处下载该文件。
补充代码文件 1：包含水凝胶肿瘤切片设计蓝图的 Stl 文件。 请点击此处下载该文件。
讨论
本方案中所述的水凝胶肿瘤切片提供了一种套细胞淋巴瘤（MCL）模型，可模拟淋巴结结构，从而在通过生物打印技术构建的三维肿瘤微环境中研究MCL细胞的存活情况及药物反应。
目前最广泛使用的生物打印方法基于挤出技术，即生物墨水通过分配系统被挤出。例如，在喷墨打印中，生物墨水在沉积后迅速交联以形成三维结构25。然而，该方法存在一定的局限性，尤其是在所用材料的黏度以及逐层堆叠能力方面。相比之下，嵌入式注射器基挤出三维生物打印技术（如本实验方案中采用的FRESH生物打印）采用凝胶包凝胶策略。该方法可实现低黏度生物墨水（如胶原蛋白）的打印，生成稳定的结构，从而能够模拟复杂的肿瘤微环境20,26。尽管专为生物打印设计的三维打印机价格昂贵，但本文介绍的方法提供了一种更易获取的替代方案。该方法可通过相对简单的改装适配于标准挤出式打印机。这些改装部件可使用价格低廉的耗材进行三维打印，其设计文件作为开源资源公开提供，例如Hinton等人的工作20。然而，需要注意的是，FRESH生物打印中水凝胶支撑浴的制备对温度高度敏感，在浆料制备过程中需格外谨慎。
通常，3D打印的肿瘤模型在悬浮系统中培养，缺乏体内的氧浓度梯度25，或在微流控芯片培养系统中培养27，后者虽能高度模拟复杂性，但通量低且需要高维护成本。这些难题可通过本文所述的水凝胶肿瘤切片加以克服。在气液界面培养最多五个水凝胶肿瘤切片的设置，源自实体瘤精密切割肿瘤切片的培养方法28。本方案所用滤膜支持物的膜由孔径为0.4 µm的聚四氟乙烯（PFTE）材料构成，允许营养物质交换，但可防止细胞附着或迁移29。PFTE膜上的培养为切片提供了物理支撑，有助于维持其稳定性，防止破裂或解体。此外，该系统形成气液界面，使切片主要从上方空气中获取氧气，同时从滤膜下方的培养基中获得营养物质30。因此，该系统能够模拟体内可能存在的营养供应、细胞增殖和氧合状态的时空动态变化25。在滤膜支持物上培养的水凝胶肿瘤切片中，原代MCL细胞在4天内维持了超过40%的存活率，优于二维悬浮培养中观察到的存活率 （图3A，补充图2）。未来的研究应探讨添加细胞因子或与表达CD40L的成纤维细胞共培养是否可进一步延长细胞存活时间，正如在原代B细胞淋巴瘤肿瘤的类球体和类器官6,19,30，或原代MCL细胞与表达CD40L的成纤维L细胞共培养体系中所报道的那样14。应考虑将这些策略整合到水凝胶肿瘤切片系统中，以增强原代MCL细胞的培养效果，并提高其与天然微环境的相似性。
淋巴结中含有结构完善的细胞外基质纤维网络。由于其排列模式，这类纤维被称为网状纤维。这些纤维主要由胶原蛋白和基底膜特异性组分构成31,32,33. 以生成一个类似于 体内 淋巴结中的情况，用于制备水凝胶肿瘤切片的生物墨水由I型胶原和Matrigel组成，后者包含四种主要的基底膜细胞外基质蛋白：层粘连蛋白、IV型胶原、连巢蛋白和基底膜聚糖34此外，将海藻酸盐添加到生物墨水中以稳定水凝胶肿瘤切片，从而实现长期培养，并可使用刮勺将切片从一个容器转移至另一个容器。测试多种含有胶原蛋白和海藻酸盐的水凝胶后发现，当生物墨水包含0.5%海藻酸盐和20%胶原蛋白时，细胞活力最高，且水凝胶切片具有良好的稳定性和耐久性（数据未显示）。除成分外，直径为0.8 cm的水凝胶肿瘤切片也进一步接近1 cm的平均淋巴结直径。35活体三维成像显示水凝胶肿瘤切片中的细胞分布均匀 (图2C).
此处通过使用多柔比星处理水凝胶切片，展示了该模型用于药物处理的能力。多柔比星是R-CHOP疗法（利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松）的一部分，后者是老年套细胞淋巴瘤（MCL）患者亚群的标准治疗方案24。与二维培养相比，该水凝胶肿瘤切片模型可用于研究肿瘤微环境对治疗效果的影响。如图3所示，在水凝胶切片中培养的Jeko-1细胞对多柔比星治疗的耐药性高于二维培养的细胞。这一结果与已有观察一致，即细胞外基质可通过调节肿瘤硬度36、细胞间通讯37和药物递送38来影响药物反应，并常常增强耐药性。此外，流式细胞术分析以及免疫组织化学或多重免疫荧光染色可进一步揭示水凝胶肿瘤切片中单个细胞对治疗的响应情况。
综上所述，本方案描述了水凝胶肿瘤切片的制备与培养方法，该切片可模拟天然三维淋巴结结构，作为一种三维淋巴结模型。该模型有望将应用范围从套细胞淋巴瘤细胞扩展至其他原发性淋巴瘤适应症。
披露
本研究由罗伯特·博世基金会以及巴登-符腾堡州科学、研究与艺术部（3R-网络巴登-符腾堡）资助。
致谢
我们感谢 Kerstin Willecke 提供出色的技术支持，以及 Yang Zhang 在三维图像分析方面提供的宝贵帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| µ-slide 8 孔玻璃底培养皿 | ibidi GmbH | 80827 | 用于水凝胶切片活体成像的玻璃底载玻片 |
| 10x PBS | Carl Roth GmbH + Co.KG | 9150.1 | 生物墨水组分 |
| 10X RPMI-1640 培养基 | Sigma-Aldrich | R1145 | 生物墨水组分 |
| 2.5 ml 气密注射器，型号 1002 TLL | Hamilton | 81420 | 用于生物打印的注射器 |
| 3D 挤出式打印机，PrintrBot Simple | Printrbot | 经自行改装，可用于生物墨水打印 | |
| 6 孔板 | Th. Geyer GmbH & Co.KG | 7696790 | 用于水凝胶切片的培养 |
| 瓶顶真空过滤系统，PES 膜，500 ml，0.22 µm 孔径，70 mm 直径膜 | Corning Inc. | 513-3355 | 缓冲液的无菌过滤 |
| 氯化钙二水合物 | Carl Roth GmbH + Co.KG | T885.2 | 洗涤缓冲液和明胶浆液的组分 |
| 大鼠 I 型胶原蛋白 | Corning Inc. | CLS354249 | 生物墨水组分 |
| 3D 打印用 Cura Version 15.04.5 软件 | Ultimaker | 用于 3D 打印的软件 | |
| DRAQ5 | Biostatus Ltd. | DR50050 | 用于水凝胶切片活体成像的染料 |
| 乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐二水合物 | Sigma-Aldrich | E5134 | 海藻酸盐溶解缓冲液的组分 |
| EVE 自动细胞计数仪 | Nano EnTek Inc. | 10027-452 | 细胞计数仪 |
| Falcon 细菌培养皿（带盖），直径 35 mm | Falcon | 351008 | 填充明胶浆液，用于形成生物打印的支撑浴 |
| Falcon 离心管，50 mL | Sarstedt AG & Co.KG | 62.547.254 | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | S0615 | 细胞培养基补充剂 |
| 猪皮来源明胶 | Sigma-Aldrich | G1890 | 明胶浆液的主要组分 |
| HEPES，游离酸，分子生物学级 | Merck KGaA | CAS 7365-45-9 | 洗涤缓冲液和明胶浆液的组分 |
| Jeko-1 MCL 细胞系 | ATCC | CRL-3006 | MCL 细胞系 |
| KIMTECH Science 精密擦拭纸 | Kimberly Clark Corporation | 7551 | 用于吸除明胶浆液中的多余水分，并清除 3D 打印机喷嘴上的液滴 |
| LAS X 软件 Version 3.5.7.23225 | Leica | 用于三维重建的软件 | |
| Leica TCS SP8 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | TCS SP8 | 用于活体成像的共聚焦显微镜 |
| Mason Jar 标准品脱罐，16 oz | Ball Corporation | G001 | 用于制备明胶浆液的容器 |
| Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质 | Corning Inc. | 356231 | 生物墨水组分 |
| Millicell 细胞培养插件，0.4 µm 孔径 | Merck KGaA | PICMORG 50 | 水凝胶切片的滤膜支撑 |
| NucView 405 Caspase-3 底物，1 mM 溶于 1x PBS | Biotium | 10405 | 用于水凝胶切片活体成像的染料 |
| Oster 专业系列搅拌机 | Oster | BPST02-B00 | 用于制备明胶浆液的搅拌机 |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140163 | MCL 细胞培养基的补充剂 |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒及 dsDNA 试剂 | Invitrogen | P7589 | 用于水凝胶切片活体成像的染料 |
| Rotina 35 R | Hettich | 24573 | 用于细胞离心 |
| ROTINA 38/38R 离心机 | Hettich | Z720109 | 用于明胶浆液的离心 |
| RPMI-1640+GlutaMAX | Gibco | 61870036 | MCL 细胞培养基的基础成分 |
| 海藻酸钠 | FMC Cooperation | GQ9109901 | 生物墨水组分 |
| 氯化钠 | Merck KGaA | 1.06404 | 海藻酸盐溶解缓冲液的组分 |
| 柠檬酸钠 | Carl Roth GmbH + Co.KG | 3580.1 | 海藻酸盐溶解缓冲液的组分 |
| Sterican 钝头应用套管针 21G 0.8x22 mm | B.Braun | 9180109 | 3D 打印用喷嘴 |
| 四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐（TMRM） | Sigma-Aldrich | T5428 | 用于水凝胶切片活体成像的染料 |
| 台盼蓝，0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | 用于细胞活力分析的染料 |
| 防水温度计 | VWR | 620-2099 | 用于监测明胶浆液温度的温度计 |
参考文献
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