本文展示了一种利用转盘共聚焦显微镜对视网膜中小胶质细胞的运动性及其与突触后斑点接触进行可视化和定量分析的方法。
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本文内容
摘要
摘要
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻巨噬细胞，可对组织感染和损伤作出反应。除了参与炎症反应外，小胶质细胞还通过突触修剪在神经环路发育成熟过程中发挥重要作用。然而，在神经炎症和神经退行性病变中，突触修剪的具体机制仍不清楚。在本方案中，我们采用小鼠视网膜离体培养模型来研究小胶质细胞的动态行为 离体为了研究小胶质细胞的运动性及其与突触后蛋白的相互作用，我们使用 AAV-PSD95-RFP 标记突触，并利用转盘共聚焦显微镜记录运动中的小胶质细胞与突触后蛋白共定位的延时视频。随后，我们使用图像分析软件对小胶质细胞和 PSD95 进行表面重建和斑点重建。通过这些重建结果，可提取小胶质细胞的位移长度、突起运动速度以及与突触后斑点的接触情况等数据，以解析小胶质细胞在稳态条件下及神经元损伤后的生物学行为。该实验方案有助于研究小胶质细胞在视网膜神经退行性疾病中突触修剪作用的机制。
引言
神经回路的功能与稳态依赖于突触放电以及不同细胞类型之间其他高度调控的相互作用1。作为中枢神经系统（CNS）的常驻巨噬细胞，小胶质细胞是视网膜中的一类非神经元细胞群，在突触修剪过程中发挥独特作用。在中枢神经系统发育过程中，小胶质细胞会清除无功能或较弱的突触，以优化神经回路2。发育中的大脑内的小胶质细胞持续监测其周围环境，并在关键时期倾向于发挥神经保护作用3。在视觉系统发育过程中，小胶质细胞不仅是皮层神经元和中间神经元发育的关键调控因子，还在突触重塑的关键时期表现出形态学上的变化4。类似地，在发育中的视网膜中，小胶质细胞清除凋亡细胞，为新的突触连接腾出空间，并在此清除过程中观察到稳态标志物P2Ry12的表达上调，证实了其功能活性5。然而，近期研究发现，小胶质细胞在发育中视觉系统神经回路精细化过程中的作用可能并不明确6，这突显了关于小胶质细胞在视觉回路发育中所起作用仍存在争议。
在损伤情况下，小胶质细胞会转变为活化状态，并可能发挥神经退行性作用。例如，在阿尔茨海默病模型中，小胶质细胞对淀粉样β斑块的吞噬作用增强7，并对SPH和PSD95等突触标志物的吞....
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方案
动物饲养于加利福尼亚大学旧金山分校，光照周期为12小时光照与12小时黑暗，提供饮水和标准饮食 随意摄取，除非另有说明。所有实验程序均经加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会批准。本方案中所用材料和仪器详见材料表。从玻璃体内注射到成像及分析的实验流程概览如图所示 图1.
1. AAV-PSD95-TagRFP 病毒的制备与效率
- 通过将 PSD-95pTagRFP 序列（Addgene 质粒 #52671；RRID:Addgene_52671）插入 AAV-CMV-GFP 中 CMV 启动子的下游，并移除 GFP （Addgene 质粒 #67634；RRID: Addgene_67634），构建 AAV-PSD95-tagRFP。
- 使用三重转染的 HEK293T 细胞制备病毒，采用 PEG/氯仿法纯化，并浓缩至滴度为 1012 ip/mL（如 Negrini 等人所述）21。
注意：该病毒制备方法通常产生的滴度低于超速离心法，但对于本实验而言，稀疏感染细胞更为理想21。本实验所用的衣壳/血清型为 7m8（Addgene 质粒 #64839；RRID: Ad....
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结果
使用所述方案对来自CX3CR1-GFP小鼠视网膜的小胶质细胞进行成像。小鼠在注射AAV-PSD95-RFP时年龄介于P30至P60之间，且至少经过21天以确保AAV充分表达。分析前后小胶质细胞及其与PSD95斑点相互作用的代表性图像见图2。为诱导小胶质细胞活化，我们采用了小鼠激光诱导眼压升高（LIOH）模型，该模型可短暂升高眼内压（IOP）10,16,17,18,19,20。左眼接受激光处理，右眼作为对侧对照。额外的对照组包括年龄匹配、未接受激光处理的 naïve 动物的眼睛。激光处理后第.......
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讨论
本方案可实现对小胶质细胞与视网膜神经节细胞（RGC）树突上突触后位点之间相互作用的可视化与追踪。在青光眼等神经退行性疾病中，小胶质细胞与视网膜内丛状层（IPL）中的突触发生共定位。小胶质细胞在突触拆解过程中的作用尚不明确。然而，小胶质细胞可能通过多种潜在机制参与其中，包括异常吞噬突触、被动清除凋亡细胞的碎片，或上述机制的组合。
该方案可作为一种强有力的工具，用于区分并表征小胶质细胞在发育及疾病状态下的行为。通过采用所述实验方案，我们已成功对疾病状态下小鼠视网膜中小胶质细胞的动态行为及其与突触结构的相互作用进行了成像。我们观察到，在激光处理条件下，小胶质细胞突起的位移长度和移动速度较对照组显著增加。此外，我们还发现小胶质细胞与突触后蛋白PSD95之间的接触增多。近期在固定视网膜中的研究发现表明，小胶质细胞与兴奋性突触的共定位增加是由于小胶质细胞增生所致；而通过本方案，我们不仅证实了小胶质细胞与突触接触的增加，还可捕捉到潜在的吞噬事件。10高质量延时成像记录的其他方案 体内 用于研究小胶质细胞相互作用的方法已有多种
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
PSD-95pTagRFP 由 Johannes Hell 惠赠（Addgene 质粒 #52671；RRID: Addgene_52671），而其衣壳版本 7m8 由 John Flannery 和 David Schaffer 惠赠（Addgene 质粒 #64839；RRID: Addgene_64839）。我们感谢 Aparna Lakkaraju 允许我们使用其实验室的转盘共聚焦显微镜，以及 Nilsa La Cunza 在活细胞成像方面的指导。我们还要感谢 Felice Dunn、Annika Balraj 和 Luca Della Santina 对本手稿提出的有益讨论和意见。我们感谢 Suling Wang 在 Imaris 软件中进行数据分析时提供的协助。 本研究由 NIH-NEI EY028148 和 EY034973（授予 Y.O.）、ARVO David L. Epstein 奖（授予 Y.O.）以及 NIH-NEI EY034973-S1（授予 C.F.）资助。本研究还部分得到了 NIH-NEI P30 EY002162/EY037668 资助的加州大学旧金山分校（UCSF）视觉核心共享资源，以及来自“预防失明研究”组织（Research to Prevent Blindness，纽约，NY）的无限制资助的支持。图 1 使用 biorender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 25 号针头 | Alcon | 8065420920 | |
| 26 号 10 µL 注射器 | Hamilton | 701RNWG | |
| 7m8 | Addgene | 64839 | http://n2t.net/addgene:64839 |
| 可弯折定型多功能 304 不锈钢丝 | Stanford Advanced Materials | SS3368 | 用于制作环状结构的钢丝 |
| 六水合氯化钙 | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| 解剖显微镜 | Amscope | 用于视网膜的解剖与封片 | |
| 解剖剪刀 | FST | 15024-10 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7528-250G | |
| 镊子 | Dumont | 11252-21 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-500G | |
| Imaris 10.0.2 | Oxford Instruments | 分析软件 | |
| Imaris 文件转换器 | Oxford Instruments | ||
| Loctite 超级胶水 Ultra Gel Control | Loctite | 1363589 | 用于制作环状结构的胶水 |
| 六水合氯化镁 | Sigma-Aldrich | M9272-100G | |
| MCE 膜滤纸（13 mm） | Millipore | HABG01300 | 孔径 0.45 μm |
| 微环境培养室 | Tokai Hit | STXG-TIZBX-SET | |
| Nikon Eclipse Ti2-E 倒置显微镜 | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon | ||
| 新霉素和多粘菌素 B 磺胺与杆菌肽锌眼用溶液软膏，USP | Bausch + Lomb | 24208-780-55 | |
| 00 号画笔 | Amazon | ||
| Prism 8.0 | GraphPad | ||
| 盐酸丙帕他卡因眼用溶液 USP，0.5% | Sandoz | 61314-0016-01 | |
| 多聚赖氨酸包被培养皿（35 mm） | Matek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 号盖玻片 |
| PSD95_pTagRFP | Addgene | 52671 | http://n2t.net/addgene:52671 |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| 一水合磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich | S9638-25G |
参考文献
- Wu, Y. K., Hengen, K. B., Turrigiano, G. G., Gjorgjieva, J. Homeostatic mechanisms regulate distinct aspects of cortical circuit dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (39), 24514-24525 (2020).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is nec....
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重印与许可
