疾病小鼠视网膜小胶质动态及突触相互作用的实时成像与表征

Summary

本文展示了利用旋转盘共聚焦显微镜观察和量化视网膜中小胶质细胞运动性及与突触后点接触的方法。

Abstract

微胶质细胞是中枢神经系统（CNS）的常驻巨噬细胞，负责应对组织感染和损伤。除了在炎症中的作用外，小胶质细胞还通过突触修剪在神经回路的精细化中发挥发育作用。然而，神经炎症和神经退行性退行性突触修剪的机制仍不清楚。本方案采用小鼠视网膜移植模型，研究 体外小胶质动态。为研究小胶质细胞运动性及其与突触后蛋白的相互作用，我们用AAV-PSD95-RFP标记突触，并利用旋转盘共聚焦显微镜记录与突触后蛋白共定位的运动性小胶质细胞的延时视频。随后，我们使用图像分析软件制作小胶质细胞和PSD95的表面和局部重建。随后可以从这些表面提取小胶质细胞位移长度、过程速度以及与突触后脉点的接触等数据，以理解其在稳态状态及神经损伤后的行为。该方案有助于研究小胶质细胞在视网膜神经退行性疾病突触修剪中的作用。

Introduction

回路功能和稳态依赖于高度调控的突触放电及不同^{细胞类型间}的其他独特相互作用。作为中枢神经系统（CNS）的驻留巨噬细胞，微胶质细胞是视网膜中的非神经元群体，在突触修剪中发挥独特作用。在中枢神经系统发育过程中，小胶质细胞会修剪功能性或弱的突触以精炼神经回路²。发育中的大脑小胶质细胞会调查环境，并在关键期被引导出具神经保护作用。在视觉系统发育中，小胶质细胞是皮层神经元和中间神经元发育的关键调节者，此外在突触重塑的关键阶段表现出形态变化^4。同样，在发育中的视网膜中，小胶质细胞清除凋亡细胞，为新的突触连接铺路，这一点通过在这些^{清除事件中}稳态标志物P2Ry12的上调得到证实5。然而，最新研究指出，小胶质细胞可能无法在发育中的^{视觉系统神经}回路中发挥决定性作用6，这也凸显了关于其在视觉回路发育中作用存在争议。

在损伤情境中，小胶质细胞会改变形态为活跃状态，并可能发挥神经退行性作用。例如，阿尔茨海默病模型中的小胶质细胞显示出淀粉样蛋白β斑块⁷和突触标志物如SPH和PSD95的吞噬^增加。在视网膜神经退行性中，许多研究团队发现了突触物质被吞噬的小胶质细胞，但尚无明确证据显示完整突触9^{、10、11、12、13}被主动吞噬。例如，He 等人发现视网膜色素变^性9模型中，小胶质细胞数量增加，并伴随吞噬突触物质体积增加，但尚不清楚是完整突触的吞噬作用，还是清除了碎片。此外，传统的小胶质分类——如“静息型与激活型”或“M1型与M2型”——过于简化且根据现代观点越来越不准确。小胶质细胞存在于状态梯度中，而非离散类别¹²。因此，Paolicelli 等人呼吁从过时的二元分类转向更细致、严格定义的小胶质状态命名法，以更好地理解和定义小胶质细胞的形态和活性¹²。因此，评估体外和体内小胶质细胞功能的策略将增强该领域在发育和疾病情境下识别小胶质细胞状态和活性的能力。

虽然存在研究体外和体内微胶质细胞功能的策略，但体外活体成像有若干优势。首先，角膜清晰度或白内障发育不会阻碍视网膜成像，能清晰显示微小过程和突触点。此外，体内成像需要更高的技术技能来设置，这使得体外制备的通量更高，导致每个实验成像的动物数量更多。尽管体内成像理论上可能带来好处，但纵向成像仍需高功率（100-230 μW）才能捕捉小胶质细胞过程的运动性^14,15。然而，使用较低激光功率和充足成像介质的体外小胶质细胞成像，在适当准备下可提供与体内成像相同的成像质量，尽管该组织已不再原位。

我们已证明，瞬时眼内压（IOP）升高¹⁰后，小胶质细胞的数量、复杂度和过程运动都会增加。在固定组织中，这种微胶质增多导致与突触蛋白的共定位增加¹⁰。此前研究还证明了小鼠激光诱导眼高血压模型（LIOH）及其他神经退行性模型10,16,17,18,19,20中视网膜神经节细胞（RGCs）早期突触丧失和树突变性。然而，目前尚不清楚它们是积极参与修剪突触，还是更被动地清除细胞残骸，包括拆解突触。由于突触解构是神经退行性变的早期特征，理解小胶质细胞动力学及其在突触解构中的作用至关重要 ^8,10。本研究中，我们利用实时成像来理解小胶质细胞动态及其与RGC树突上兴奋性突触后密度蛋白-95（PSD95）的相互作用。

Protocol

动物被安置在加州大学旧金山分校，采用12小时光照和12小时暗照周期，除非另有说明，否则可 自由提供水和标准饮食。所有程序均由加州大学旧金山分校的机构动物护理与使用委员会批准。有关本协议中使用的材料和仪器，请参见材料表。 图1展示了从玻璃体内注射到影像学和分析的实验过程概述。

1. AAV-PSD95-TagRFP病毒的生产与效率

1. 通过取PSD-95pTagRFP序列（Addgene质粒#52671;RRID：Addgene_52671），并在去除GFP后插入CMV启动子下游的AAV-CMV-GFP（Addgene质粒#67634;RRID：Addgene_67634）。
2. 使用三重转染HEK293T制备病毒，使用PEG/氯仿纯化，滴度为10¹² ip/mL（如Negrini等人所述）。²¹岁。
   注意：这种病毒生产方法通常产生的滴度低于超速离心，但对于这些实验，希望细胞感染稀疏。这些实验中使用的衣壳/血清型版本为7m8，（Addgene质粒#64839;RRID：Addgene_64839）。
   1. 在进行完整成像方案前，先测试AAV的效率。
      注意：实施该方案的读者应尽量减少RGCs标记，目标是识别并分离单个RGC树突。
3. 确认转染成功，然后用2%的PFA固定视网膜，1xACSF。对于突触蛋白，在共軛焦显微镜下以63倍分辨率检查信号，以验证荧光标记的清晰分辨率。
   注意：较低的固定浓度有助于保持突触蛋白的标记。如果所用的AAV不是用于突触组分，读者可以选择使用4%的PFA。

2. 小鼠饲养与AAV-PSD95-TagRFP玻璃体内注射

1. 将雄性和雌性CD-1白化小鼠（品系022）与B6.129P2（Cg）-Cx3cr1tm1Litt/J（品系005582）杂交，生成具有EGFP表达小胶质的CD-1白化小鼠。至少要经过四代回交，才能在实验中使用雄性和雌性Cx3cr1杂合小鼠。在10代后将菌株恢复到CD-1背景上，以保持并刷新菌株，以防止遗传漂变。
2. 通过感应腔内对异氟醚麻醉（P30-P60）进行麻醉，麻醉剂为3-5%氧气，流量为1升/分钟。将动物置于立体显微镜上，同时确保异氟醚通过鼻锥持续注射。要确认动物是否麻醉，至少捏三次脚趾以确认。
3. 注射AAV前滴入0.5%的普拉卡因。使用26s G 10微升注射器，缓 慢 注射2微升AAV-PSD95-RFP在双眼颞上边缘玻璃体内注射。缓慢拔出针头，防止AAV倒流通过注射部位。注射后在眼睛上涂抹抗生素软膏。
4. 注意：针头应穿过玻璃体腔的一半。这样做会导致针尖损伤视网膜和晶状体，导致斑驳甚至不成功的转染。白内障发展或出血是注射技术缺陷的表现。
5. 注射后，确认动物保持警觉，然后将它们送回原来的笼子和安置房间。如果动物出现注射后疼痛，应通过腹腔注射给予丁丙诺啡。等三周才能表达AAV。如果使用诱导模型来提高眼压（或其他作），应等待3周后再诱导单眼的眼压升高，使用对侧眼或未接触动物的眼睛作为对照。

3. 安乐死与视网膜平置

1. 制备新鲜1x人工脑脊液（ACSF，pH 7.4），1xPBS，含以下成分（mM）：119 NaCl，2.5 KCl，1.3 MgCl₂·6H₂O，2.5 CaCl₂·2H₂O，1 NaHPO_4,11 葡萄糖，20 HEPES）。
2. 急性解剖前，至少给溶液氧气15分钟。将管子连接到氧气罐，并装一个中间有孔的盖子，防止气体泄漏。
3. 在小型诱导腔内使用至少1毫升异氟醚麻醉对小鼠进行安乐死，随后进行宫颈脱位。在切除前用标记标记角膜的鼻侧，以便在整个实验过程中追踪视网膜的位置。
   1. 要切除微珠注射或激光眼，需进行有限结膜腹膜切开术，并将剪刀放在眼后，从视神经基部剥离眼睛。这样可以让细腻的眼睛保持完整。
4. 使用解剖显微镜，用23G或25G针头在角膜上戳一个小孔，使含氧ACSF能够灌注眼睛。把剪刀插入这个孔，在鼻子末端做一个受托割口。
5. 在肢体处切除剩余的角膜和虹膜。
6. 取下光圈和镜头。如果视网膜粘在晶状体上，用镊子将其分离。
7. 用镊子轻柔地将视网膜与巩膜分离，连接RPE和神经视网膜。
8. 将视网膜放置在混合纤维素酯（MCE）膜滤纸的非格栅面上，以便清晰观察和成像。
9. 在视网膜的其他三个象限做一些小而放松的切口，鼻腔视网膜上切最长的部分用于追踪视网膜位置。
   注意：视网膜应该看起来像四叶草。
10. 将视网膜从滤纸转移到实验室湿巾上。用一滴ACSF润湿视网膜，然后用湿巾擦干滤纸。重复至少8-10滴，让视网膜粘附在滤纸上。
11. 在解剖对侧眼时，将视网膜放入氧合室。
12. 准备成像后，按照步骤3.10将滤纸纸晾干，然后将视网膜倒置到Matek培养皿上。用金属珠或环压住视网膜。加入3-5滴ACSF。
    注意：小金属珠，如金属珠浴或环形的，尺寸和重量足以防止漂移，同时不破坏视网膜完整性。
13. 用钢丝和拉伸的尼龙弦，粘合并加重物，制作一个固定且紧绷平行线的戒指。
    1. 将钢丝绕在直径1/2英寸的圆柱体上，用钳子拉紧。将每个环从圆柱上切开，用虎钳夹平。
    2. 打磨一面环，使其一面粗糙平整。用尼龙绳拉紧瓶口，直径为1-2英寸，用橡皮筋固定。
    3. 把戒指放在尼龙弦上，然后沿着戒指内侧边缘涂抹少量胶水，小心地将其粘在尼龙绳上。之后，在环顶放一个轻重物，比如硬币或细金属丝，固定环。
    4. 晾干后，用精密剪刀剪断戒指外缘的尼龙绳。结果是固定的平行弦紧绷地延伸环的直径。
    5. 如果环内尼龙弦密度过高，可以用微切割弹簧剪刀剪断单根弦，以符合实验需求。
       注意：解剖和安装过程只需~5分钟。组织在 体外进入平衡生理状态所需的时间越快，组织就越健康。

4. 旋转盘共焦采集

注意：在成像前，开启5%二氧化碳加湿_室，运行 至少1小时。让系统和样品达到热平衡有助于减少漂移。

1. 开始用目镜扫描10倍，聚焦小胶质。扫描组织以成像区域为参考，只关注具有明亮突触点共定位（10-20微米范围内）的小胶质细胞。由于AAV标记在组织中不均匀，扫描中含有小胶质细胞和泪点的区域可在同一平面内共定位。一旦找到符合这些条件的区域，切换到60倍对焦，然后点击 相机 按钮切换到相机模式。
   1. 使用成像系统软件，右键点击屏幕即可找到xy导航。预览界面会出现，可以通过制作3 x 3、5 x 5或自定义尺寸的屏幕来扫描组织，以获得最佳区域。使用3 x 3或5 x 5的画面尺寸和屏幕，配一个参考通道，以防止连续的光漂白。
      注：本次方案使用了小胶质通道。
2. 使用配备60倍物镜（NA 1.49）的旋转盘共軛焦显微镜，立即成像已安装的视网膜。
3. 要预览采样，右键点击屏幕，选择“实时”，点击 自动调整 按钮，系统可以根据当前的LUT调整视图。要调整激光设置，先单独选择每个通道，并根据需要调整激光功率和曝光。然后右键点击荧光团，将 设置分配给显微镜 并保存自定义设置，因为切换到其他通道时软件不会保存。
   1. 切换到下一个频道，根据需要调整。右键点击荧光团以保存设置。如果在同一帧中获得多个通道，分别预览每个通道后输入相同的数值。右键点击荧光团以保存设置。
   2. 多通道采集时，请在 Lambda 标签下选择感兴趣的通道。对于实时成像，将所有通道合并到一个通道中，以快速捕捉目标单元的细微移动，从而同时采集每个通道，而非单独采集，这可能会根据单元速度造成延时延迟。
4. 继续获取所需时间的延时摄影。
   1. 在左下角 的时间 标签页中，输入一个5-10分钟的时间流逝，间隔为20秒。
   2. 在右侧 的采集设置 标签下，将 图像分辨率设置为608 x 832 ， 像素尺寸 为 0.12微米。
   3. 采用0.3微米步长收集10至20微米的图像，以确保沿z轴细小胶质细胞突和突触点的可接受分辨率。为了确保细胞跟踪成功，帧间隔应保持在20至30秒之间。
      注意：由于组织 体外脆弱，建议先对实验视网膜进行成像，且不超过一小时。这是为了使对侧对照眼的状况正常化，该眼应置于含氧腔室中，同时成像第一视网膜。
5. 使用该方案拍摄视网膜的表层。通过获得大于20微米的时间流逝，捕捉20秒间隔内精细过程运动变得更加困难。因此，只有符合20微米堆栈的图像小胶质细胞。

5. 跟踪分析与数据导出

1. 小胶质细胞的表面渲染
   1. 使用文件转换器软件将延时视频文件转换为IMS格式。根据第4.2步获得的图像特性输入以下体素尺寸：x = 0.1272423微米，y = 0.1272423微米，z = 0.3微米。
   2. 一旦上线，分析软件将在Arena中启动。点击 观察 文件夹以打开之前转换的文件。确保图片处于 3D视图中。
   3. 要检测整个单个小胶质细胞，请点击对象工具栏中的蓝色表面图标。在算法设置中选择最后三个选项：跟踪表面（随时间）、分类表面和对象间统计。点击蓝色播放按钮进入下一步。
      1. 若存在多个小胶质细胞，应选择仅分段一个兴趣区域（ROI），以确保单个小胶质细胞存在于一个表面物体内。相应地设置x、y和z参数，只制作感兴趣的小胶质细胞的表面。
   4. 选择将要创建表面渲染的通道。如果需要，选择 “平滑” 来平滑表面创建，并使用与图像体素尺寸的 1：1 - 1.25比例 。例如，如果图像的体素尺寸为 0.12 x 0.12 x 0.3微米，则将 表面细节 设置为 0.15 - 0.16微米。在阈 值设定下，选择 机器学习分割 以训练软件检测感兴趣单元格。
      注意：下一步是通过机器学习分割向Imaris AI输入训练数据。
   5. 在训练数据中，观察两个画笔工具：背景（用于检测背景）和前景（用于检测样本的真实信号）。通过选择想要的画笔并使用Shift+左键点击来画笔触。确保在设置中选择了插值显示。选择训练和预测以输入画笔笔触的训练数据。
      注意：输入超过六笔会让AI处理时间更长，且捕捉细胞不准确。
      1. 用中间的 黄色指针 在Z堆栈上移动。在x、y、z平面上画多笔画笔，同时在延时摄影的几个（不是全部）时间段内画。每条条目画3-5个短画笔，因为AI最适合一次学习少量信息。对每个条目反复调整这一步骤，直到生成一个精确的单元表面。
      2. 选择 黄色矩形 ，在训练显示和实际生成的表面之间切换，作为最终检查。还要在时间推移中确认表面是否准确代表了细胞。
   6. 一旦实现了准确的表面渲染，就可以进入下一步。取消选择分割对象。
   7. 调整直方图中的体素数量。调整阈值，使其去除与主表面不相连的小物体。
      注意：此步骤用于去除因背景噪音产生的任何小而不需要的表面。目标是去除所有与目标主单元体不相连的表面。
   8. 接下来，根据需要编辑表面。根据需要，手动清除所有不属于主表面的物体或切割边缘。
   9. 如果需要，可以设置一个允许的间隙阈值，这些间隙仍可与该对象关联。选择移动单元的跟踪算法。
      注意：自回归运动是单元追踪中最常用的工具，因为它能跟踪整个延时摄影的连续运动。
      1. 最大距离和最大间隙大小是用户定义的数字，用于设定表面可能偏离的重要点。设置 最大间隙距离 为 0.96微米 ， 最大间隙大小 为 3 （默认设置）。
   10. 类似于步骤5.1.7中过滤表面对象的方式，过滤与主表面无关联的轨道。这也通过直方图进行调整。通过寻找不超过五个时间框架的小点点轨道从滤波器调整中移除，定义阈值的位置。
   11. 接下来，如果需要，可以设置分类。例如，将位移长度分类为 0 - 1微米 到 1+微米 ，以确定过程较小的运动或显著较大的过程或单元的位移。
   12. 最后，利用前一步的分类对某些事件进行适当标签。
       注意：此步骤最好在生成突触后信号斑点后进行。
2. PSD95的现货分类
   1. 要检测整个单个小胶质细胞，请点击对象工具栏中的蓝色表面图标。在算法设置中选择最后三个选项：跟踪表面（随时间）、分类表面和对象间统计。点击蓝色播放按钮进入下一步。
   2. 选择突触标记的 源通道 。关闭切片软件和其他频道，只显示PSD95。使用 Ctrl 按钮和 指针选择工具 来估算点的xy直径。
      1. 挑几个贯穿整个延时摄影的明亮点（大小范围在 0.6微米 到 1.2微米之间）。
      2. 关闭背景减法。如果图像需要背景减法，请在处理延时前使用图像处理中的背景减法工具。
   3. 接下来，根据点状质量添加滤镜。拖动直方图，使所有PSD95的点在延时过程中都能被准确捕捉。
      注意：质量^基于9点中心的强度。该滤波器比体素滤波器或直径滤波器数量更准确地捕捉了PSD95的实际信号。
   4. 接下来，使用编辑步骤去除噪声产生的斑点。在立方体光标和圆形光标之间切换，分别去除单个或多个因噪声只出现1-2个时间段的点。
   5. 如果需要，可以设置一个允许的间隙阈值，这些间隙仍可与该对象关联。选择合适的突触标记跟踪算法。
      1. 最大距离和最大间隙大小是用户定义的数字，用来设定点可能偏离的重要点。设置 最大间隙距离 为 14.6微米 ， 最大间隙大小 为 3 （默认设置）。
   6. 类似于步骤5.2.3中对点对象的过滤方式，过滤不关联特定点点的轨道。这也通过直方图进行调整。要定义阈值的位置，可以观察小物体轨道被移除的时间。
   7. 如果需要，可以设置分类。例如，通过使用最短距离地表分类区分被吞没、接触点和未接触点。设置在表面0微米处<，像任何点一样被包围，接触点距离表面0至0.5微米，或未接触点距离0.5+ μm。
   8. 最后，利用前一步的分类对某些事件进行适当标签。
3. 一旦表面和斑点准确代表了感兴趣的微胶质细胞和点点，就在统计标签页下导出每个物体的所有统计数据。确保提取详细统计数据，包括位移长度、速度和分类的接触事件。
   1. 许多统计数据，如面积、体积、位移长度和速度，都是伊玛莉斯的输出。导出表面位移长度和速度，以定义实验中的微胶质细胞动力学。
      1. 定义位移长度为表面初始位置与最终位置之间的距离，单位为μm²²。
      2. 将速度定义为表面从一个时间区间到下一个时间间隔的瞬时速度，单位为μm/s²²。
         注意：接触事件是作者描述的现象，即完整的突触后脉点在单个小胶质细胞之间保持0微米距离，至少在时间推移中持续五个固定时间段。

Results

使用上述方案对CX3CR1-GFP小鼠视网膜的微胶质进行了成像。注射AAV-PSD95-RFP时，小鼠的P30至P60不等，且至少经过21天才能表达AAV。图2展示了小胶质细胞及其与PSD95点在分析前后的相互作用的代表性图像。为诱导小胶质细胞激活，我们采用了小鼠激光诱导眼压高（LIOH）模型，该模型能暂时提升眼内压（IOP）10,16,17,1 ^8,19,20。左眼被激光照射，右眼则作为对侧对照。其他对照组是年龄相匹配、...

Discussion

该协议能够可视化和跟踪单个小胶质细胞与RGC树突突起后位点的相互作用。在如青光眼等神经退行性疾病中，小胶质细胞与视网膜内有机层（IPL）突触共定位。小胶质细胞在突触解构中的作用尚不充分。然而，小胶质细胞可能通过多种潜在机制贡献，包括异常吞噬突触、被动清除凋亡细胞的残骸，或以上机制的组合。

该方案有望成为区分这一领域并表征小胶质细胞在发育和疾病状态下的行为的有力工具。按照所述实验方案，我们成功成像了病变小鼠视网膜中小胶质动态及其与突触结构的相互作用。我们观察到激光条件下小胶质细胞突位移的长度和速度均较对照组增加。此外，我们观察到小胶质细胞与突触后蛋白PSD95的接触增加。固定视网膜的最新研究显示，小胶质细胞与兴奋性突触共定位增加是由于微胶质细胞增生，因此通过该方案，我们不仅显示出小胶质细胞与突触接触的增加，还可能捕捉潜在的吞噬事件¹⁰。其他用于体内高质量延时摄影研究小胶质相互作用的方案存在23,24，包括一项也测量了体外视网膜小胶...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25号针	阿尔康	8065420920
26秒10号轨距和微型;L型注射器	汉密尔顿	701皇家海军航空队
7米8	阿德基因	64839	http://n2t.net/addgene:64839
弯曲拉索多用途304不锈钢钢丝	斯坦福先进材料	SS3368	用钢丝制作环
六水合氯化钙	西格玛-奥尔德里奇	C5080-500G
解剖显微镜	安斯科普		用于解剖和安装视网膜
解剖剪刀	FST	15024-10
D-（+）-葡萄糖	西格玛-奥尔德里奇	G7528-250G
镊子	杜蒙	11252-21
天哪	西格玛-奥尔德里奇	H3375-500G
Imaris 10.0.2	牛津仪器		分析软件
Imaris文件转换器	牛津仪器
乐泰特超级胶 超高凝胶控制	洛克泰特	1363589	制作戒指的胶水
六水合氯化镁	西格玛-奥尔德里奇	M9272-100G
MCE膜滤纸（13毫米）	米利波尔	HABG01300	0.45 & mu;m 孔径
微环境舱	东海击中	STXG-TIZBX-SET
尼康Eclipse Ti2-E倒置显微镜	尼康
NIS要素	尼康
新霉素和多菌素B型硫酸盐与杆菌素锌眼药膏，USP	鲍施+隆	24208-780-55
画笔尺寸00	亚马逊
棱镜8.0	GraphPad
盐酸普拉卡因眼药 USP，0.5%	桑多兹	61314-0016-01
PDL涂层培养皿（35毫米）	马泰克	P35GC-1.5-14-C	1.5号 科弗斯利普
PSD95_pTagRFP	阿德基因	52671	http://n2t.net/addgene:52671
氯化钾	西格玛-奥尔德里奇	P9333-500G
氯化钠	西格玛-奥尔德里奇	S7653-1KG
磷酸钠单碱性一水合物	西格玛-奥尔德里奇	S9638-25G