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方法文章

活体成像与特征分析疾病小鼠视网膜中小胶质细胞动态及其与突触的相互作用

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DOI：

10.3791/68420

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2026年1月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of California, San Francisco, 2Jules Stein Eye Institute, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

本文展示了一种利用转盘共聚焦显微镜对视网膜中小胶质细胞的运动性及其与突触后斑点接触进行可视化和定量分析的方法。

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻巨噬细胞，可对组织感染和损伤作出反应。除了参与炎症反应外，小胶质细胞还通过突触修剪在神经环路发育成熟过程中发挥重要作用。然而，在神经炎症和神经退行性病变中，突触修剪的具体机制仍不清楚。在本方案中，我们采用小鼠视网膜离体培养模型来研究小胶质细胞的动态行为 离体为了研究小胶质细胞的运动性及其与突触后蛋白的相互作用，我们使用 AAV-PSD95-RFP 标记突触，并利用转盘共聚焦显微镜记录运动中的小胶质细胞与突触后蛋白共定位的延时视频。随后，我们使用图像分析软件对小胶质细胞和 PSD95 进行表面重建和斑点重建。通过这些重建结果，可提取小胶质细胞的位移长度、突起运动速度以及与突触后斑点的接触情况等数据，以解析小胶质细胞在稳态条件下及神经元损伤后的生物学行为。该实验方案有助于研究小胶质细胞在视网膜神经退行性疾病中突触修剪作用的机制。

引言

神经回路的功能与稳态依赖于突触放电以及不同细胞类型之间其他高度调控的相互作用1。作为中枢神经系统（CNS）的常驻巨噬细胞，小胶质细胞是视网膜中的一类非神经元细胞群，在突触修剪过程中发挥独特作用。在中枢神经系统发育过程中，小胶质细胞会清除无功能或较弱的突触，以优化神经回路2。发育中的大脑内的小胶质细胞持续监测其周围环境，并在关键时期倾向于发挥神经保护作用3。在视觉系统发育过程中，小胶质细胞不仅是皮层神经元和中间神经元发育的关键调控因子，还在突触重塑的关键时期表现出形态学上的变化4。类似地，在发育中的视网膜中，小胶质细胞清除凋亡细胞，为新的突触连接腾出空间，并在此清除过程中观察到稳态标志物P2Ry12的表达上调，证实了其功能活性5。然而，近期研究发现，小胶质细胞在发育中视觉系统神经回路精细化过程中的作用可能并不明确6，这突显了关于小胶质细胞在视觉回路发育中所起作用仍存在争议。

在损伤情况下，小胶质细胞会转变为活化状态，并可能发挥神经退行性作用。例如，在阿尔茨海默病模型中，小胶质细胞对淀粉样β斑块的吞噬作用增强7，并对SPH和PSD95等突触标志物的吞噬也增加8。在视网膜神经退行性疾病中，许多研究团队发现小胶质细胞内含有被吞噬的突触物质，但尚无明确证据表明其主动吞噬完整突触9,10,11,12,13。例如，He等人发现，在视网膜色素变性模型中，小胶质细胞数量增加，且其吞噬的突触物质体积增大9，但尚不清楚这是对完整突触的吞噬，还是仅对碎片物质的清除。此外，传统的小胶质细胞分类方式——如"静息态与活化态"或"M1与M2"——在现代研究认知下显得过于简化且日益不准确。小胶质细胞实际上处于一种连续的状态梯度中，而非离散的类别12。因此，Paolicelli等人呼吁摒弃过时的二元分类，转向更精细、更严格定义的小胶质细胞状态命名体系，以更准确地理解并界定小胶质细胞的形态与功能活性12。因此，开发用于在离体（ex vivo）和在体（in vivo）条件下评估小胶质细胞功能的策略，将有助于提升研究领域在发育和疾病背景下识别小胶质细胞状态与活性的能力。

尽管已有研究小胶质细胞功能的策略 离体 和 体内, 离体 活体成像具有多项优势。首先，角膜透明度或白内障的发展不会影响视网膜成像，从而能够清晰观察到微小过程和突触斑点。此外， 体内 成像 需要更高的技术水平来设置，这使得 离体 制备 高通量实验装置，使每次实验可成像的动物数量增加。尽管存在理论上的优势 体内 成像可能需要较高的激光功率（100–230 µW），以捕捉小胶质细胞突起的运动性，用于纵向成像14,15。然而， 离体 使用较低的激光功率和适当的成像介质对小胶质细胞进行成像，可获得与 体内 通过适当的准备进行成像，尽管组织已不再存活 原位.

我们已证明，在眼内压（IOP）短暂升高后，小胶质细胞的数量、复杂性以及突起运动均会增加10。在固定组织中，这种小胶质细胞活化现象会导致其与突触蛋白的共定位增加10。先前的研究还表明，在小鼠激光诱导高眼压模型（LIOH）及其他神经退行性疾病模型中，视网膜神经节细胞（RGCs）会出现早期突触丢失和树突退化10,16,17,18,19,20。然而，目前尚不清楚小胶质细胞在突触修剪过程中是发挥主动作用，还是仅在清除包括解体突触在内的细胞碎片中起被动作用。由于突触解体是神经退行性变的早期特征之一，因此了解小胶质细胞的动态行为及其在突触解体中的作用至关重要8,10。在此，我们采用活体成像技术来研究小胶质细胞的动态变化及其与RGC树突上兴奋性突触后密度蛋白-95（PSD95）的相互作用。

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方案

动物饲养于加利福尼亚大学旧金山分校，光照周期为12小时光照与12小时黑暗，提供饮水和标准饮食 随意摄取，除非另有说明。所有实验程序均经加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会批准。本方案中所用材料和仪器详见材料表。从玻璃体内注射到成像及分析的实验流程概览如图所示 图1.

1. AAV-PSD95-TagRFP 病毒的制备与效率

  1. 通过将 PSD-95pTagRFP 序列（Addgene 质粒 #52671；RRID:Addgene_52671）插入 AAV-CMV-GFP 中 CMV 启动子的下游，并移除 GFP （Addgene 质粒 #67634；RRID: Addgene_67634），构建 AAV-PSD95-tagRFP。
  2. 使用三重转染的 HEK293T 细胞制备病毒，采用 PEG/氯仿法纯化，并浓缩至滴度为 1012 ip/mL（如 Negrini 等人所述）21。
    注意：该病毒制备方法通常产生的滴度低于超速离心法，但对于本实验而言，稀疏感染细胞更为理想21。本实验所用的衣壳/血清型为 7m8（Addgene 质粒 #64839；RRID: Addgene_64839）。
    1. 在进行完整成像方案之前，应先检测 AAV 的转染效率。
      注意：实施本方案的研究人员应力求实现视网膜神经节细胞（RGCs）的稀疏标记，因为目标是识别并分离单个 RGC 的树突。
  3. 确认转染成功后，用含 2% 多聚甲醛（PFA）的 1× ACSF 固定视网膜。对于突触蛋白，应在共聚焦显微镜下以 63 倍物镜检查荧光标记信号，以确认清晰的分辨率。
    注意：较低浓度的固定有助于保护突触蛋白的标记信号。如果所用 AAV 并非用于标记突触成分，研究人员可选择使用 4% PFA。

2. 小鼠饲养管理及AAV-PSD95-TagRFP玻璃体内注射

  1. 将 CD-1 白化小鼠（品系 022）雄鼠与 B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J（品系 005582）雌鼠杂交，以获得表达 EGFP 的小胶质细胞的 CD-1 白化小鼠。实验中所用的 Cx3cr1 杂合子雄鼠和雌鼠需经过至少四代回交。为防止遗传漂变，每经过十代回交后，需将品系重新回交至 CD-1 背景并维持和更新品系。
  2. 使用异氟烷麻醉剂通过诱导室对动物（P30-P60）进行麻醉，氧气流速为1 L/min，异氟烷浓度为3-5%。将动物置于体视显微镜下，并通过鼻罩持续给予异氟烷。为确认动物已完全麻醉，至少重复3次夹捏脚趾以验证无反应。
  3. 在注射 AAV 前滴加一滴 0.5% 丙帕卡因。注射 2 µL AAV-PSD95-RFP 缓慢地 双眼经颞上方角膜缘使用26G 10 µL注射器进行玻璃体内注射。缓慢拔出针头，防止AAV从注射部位反流。注射后向眼部涂抹抗生素软膏。
  4. 注意：针头插入玻璃体腔的深度不应超过其周长的一半。否则，针尖可能损伤视网膜和晶状体，导致转染呈斑片状或完全失败。白内障形成或出血提示注射技术不当。
  5. 注射后，在将动物放回原笼具和饲养室前，须确认其已清醒。若动物出现注射后疼痛，应通过腹腔注射给予布托啡诺。 等待3周以使AAV表达。如果使用可诱导模型来升高眼内压（或进行其他操作），则在诱导单眼眼内压升高前需等待3周，对照组可采用对侧眼或未处理动物的眼睛。

3. 安乐死与视网膜平铺制片

  1. 在含有以下成分（单位：mM）的 1× PBS 中配制新鲜的 1× 人工脑脊液（ACSF，pH 7.4）：119 NaCl、2.5 KCl、1.3 MgCl2·6H2O、2.5 CaCl2·2H2O、1 NaHPO4、11 葡萄糖和 20 HEPES。
  2. 使用前至少氧合溶液 15 分钟。将管路连接至氧气瓶，并在容器上加盖中间带孔的盖子，以防止气体逸出。
  3. 在小型诱导室中使用至少 1 mL 异氟烷麻醉剂处死小鼠，随后进行颈椎脱位。在摘除眼球前，用记号笔标记角膜的鼻侧，以便在整个实验过程中追踪视网膜位置。
    1. 对于注射了微珠或经激光处理的眼睛，行有限的结膜环切术，将剪刀置于眼球后方，在视神经根部处解剖摘除眼球，以保持眼球结构完整。
  4. 在解剖显微镜下，使用 23 G 或 25 G 针头在角膜上刺一个小孔，使氧合的 ACSF 能够灌注眼球。将剪刀插入该孔，在鼻侧末端做一参考性切口。
  5. 在角膜缘处剪除剩余的角膜和虹膜。
  6. 移除虹膜和晶状体。若视网膜粘附于晶状体，使用镊子将其分离。
  7. 使用镊子在视网膜色素上皮（RPE）与神经视网膜之间轻轻解剖，将视网膜从巩膜上分离。
  8. 将视网膜放置于混合纤维素酯（MCE）膜滤纸的无网格侧，以便清晰观察和成像。
  9. 在其余三个象限的视网膜上做小的松弛切口，鼻侧视网膜的切口最长，用于追踪视网膜位置。
    注：视网膜应呈四叶草状。
  10. 将视网膜从滤纸上转移至实验室擦拭纸上。滴加一滴 ACSF 润湿视网膜，然后用擦拭纸吸干滤纸。重复此步骤至少 8–10 次，使视网膜牢固附着于滤纸上。
  11. 在解剖对侧眼时，将视网膜置于氧合 chamber 中保存。
  12. 准备成像时，按步骤 3.10 所述方法干燥滤纸，然后将视网膜翻转并置于 Matek 培养皿中。使用金属珠或金属环压住视网膜，并加入 3–5 滴 ACSF。
    注：小型金属珠（如金属珠浴中的珠子或金属环）具有合适的尺寸和重量，可在不破坏视网膜完整性的情况下防止漂移。
  13. 通过使用钢丝和拉伸的尼龙线，粘合并添加配重，制作一个具有固定、绷紧平行线的环。
    1. 将钢丝缠绕在直径为 1/2 英寸的圆柱体上，并用钳子拉紧。从圆柱体上剪下每个环，并在台钳间压平。
    2. 将环的一面打磨粗糙，形成平整的粗糙面。将尼龙线拉伸覆盖在直径为 1–2 英寸的瓶口上，并用橡皮筋固定。
    3. 将环置于尼龙线上，沿环内缘少量涂抹胶水，小心地将环粘合到尼龙线上。之后，在环上放置一个轻质重物（例如硬币或细金属丝），以固定环的位置。
    4. 干燥后，使用精密剪刀从环的外缘剪断尼龙线。最终得到一组固定且绷紧、横跨环直径的平行尼龙线。
    5. 若环内尼龙线密度过高，可使用显微解剖弹簧剪刀剪除部分尼龙线，以满足实验需求。
      注：解剖和装片过程应仅耗时约 5 分钟。组织越快置于平衡的生理条件（ex vivo）下，组织状态越健康。

4. 转盘共聚焦成像采集

注意：开启加湿培养箱并调节至5% CO2，成像前至少运行1小时。使系统和样品达到热平衡有助于减少漂移。

  1. 首先使用10倍物镜通过目镜开始扫描，以聚焦小胶质细胞。在寻找成像区域时，以小胶质细胞通道作为参考，仅关注那些具有明亮突触斑点且与之共定位（距离在10–20 µm内）的小胶质细胞。由于AAV标记在组织中分布不均，应选择小胶质细胞与突触斑点在同一焦平面内共定位的区域进行扫描。一旦找到符合上述条件的区域，切换至60倍物镜进行精细聚焦，并点击相机按钮进入相机模式。
    1. 使用成像系统软件，右键点击屏幕以调出xy导航功能。此时将出现一个预览窗口，可通过设置3×3、5×5或自定义尺寸的扫描框来筛选最佳成像区域。建议使用3×3或5×5的框尺寸，并仅使用一个参考通道进行预览，以避免持续的光漂白。
      注意：本实验方案中我们使用的是小胶质细胞通道。
  2. 使用配备60倍物镜（NA 1.49）的转盘共聚焦显微镜，及时对安装好的视网膜样本进行成像。
  3. 为预览样本，右键点击屏幕，选择 实时成像（Live），然后点击自动调整（auto-adjust）按钮，使系统根据当前的查找表（LUTs）自动优化显示效果。如需调整激光参数，应先逐一选择各个通道，并根据需要调节激光功率和曝光时间。随后，右键点击对应的荧光染料，选择将设置分配给显微镜（Assign Settings to Microscope）并保存自定义设置，因为软件在切换通道时不会自动保存这些设置。
    1. 切换至下一个通道并按需调整参数。每次调整后，右键点击对应荧光染料以保存该通道的设置。若在同一帧中进行多通道采集，请在单独预览每个通道后输入相同的参数值，并再次右键点击荧光染料以保存设置。
    2. 对于多通道采集，在Lambda选项卡下选择感兴趣的通道。进行活细胞成像时，建议将所有通道合并为一个复合通道，以便快速捕捉目标细胞的细微动态变化，实现各通道同步采集，而非依次采集，后者可能因细胞运动速度较快而导致时间序列图像出现延迟。
  4. 按照所需时间开始采集时间序列图像。
    1. 在左下角的时间选项卡中，设置时间间隔为20秒，总时长为5–10分钟的时间序列成像。
    2. 在右侧的采集设置选项卡中，将图像分辨率设为608 × 832，像素大小设为0.12 µm。
    3. 沿z轴方向，在10–20 µm范围内以0.3 µm的步长采集图像，以确保小胶质细胞精细突起及突触斑点在z轴上的分辨率足够高。为保证细胞追踪的成功率，帧间时间间隔应保持在20–30秒。
      注意：由于离体（ex vivo）组织较为脆弱，建议优先成像实验组视网膜，且总时长不超过一小时。此举旨在使对侧对照眼在成像期间始终处于氧合培养 chamber 中，从而保证两组样本处理条件的一致性。
  5. 本方案适用于成像视网膜较表浅的层次。若z轴扫描范围超过20 µm，则在20秒的时间间隔内难以清晰捕捉到细胞突起的细微运动。因此，仅应对位于20 µm成像堆栈范围内的小胶质细胞进行成像。

5. 轨迹分析与数据导出

  1. 小胶质细胞的表面渲染
    1. 使用文件转换软件将延时成像文件转换为 IMS 格式。根据步骤 4.2 中获取的图像属性，输入以下体素尺寸：x = 0.1272423 微米，y = 0.1272423 微米，z = 0.3 微米。
    2. 启动分析软件后，程序将在 Arena 中打开。点击 观察 文件夹以打开先前转换的文件。确保图像处于 3D 视图.
    3. 为检测完整的单个小胶质细胞，请点击 蓝色表面 图标在 对象 工具栏。选择其下方的最后三个选项 算法 设置： 随时间追踪表面，表面分类，以及 对象-对象统计学. 点击蓝色 播放 单击按钮进入下一步。
      1. 若存在多个小胶质细胞，选择 仅分割感兴趣区域（ROI） 以确保单个小胶质细胞位于一个表面对象内。设置 x, y 和 z 根据需要调整参数，仅生成目标小胶质细胞的表面结构。
    4. 选择将创建表面渲染的通道。如有需要，可进行选择 平滑 以优化表面生成并使用 1:1 至 1.25 比例 与图像的体素大小相对应。例如，如果图像具有一个体素大小 0.12 x 0.12 x 0.3 µm 体素尺寸，设置 表面细节 到 0.15 - 0.16 µm. 在……之下 阈值分割，选择 机器学习分割 用于训练软件识别目标细胞。
      注意：下一步是通过机器学习分割将训练数据输入 Imaris AI。
    5. 下 训练数据，观察两支画笔工具： 背景 （用于检测背景）和 前景 （用于检测样本的真实信号）。通过选择所需的画笔并使用画笔涂抹来绘制笔触 Shift + 左键 点击。确保 插值显示 在……下被选中 设置选择 训练 和 预测 通过画笔笔触输入训练数据。
      注意：绘制超过六笔会导致人工智能处理时间延长，并造成细胞捕获不准确。
      1. 使用 黄色指针 在中间位置沿z轴堆栈移动。在x、y和z平面上绘制多个画笔笔画，同时在延时成像的部分（非全部）时间帧中进行绘制。每次输入绘制3-5个短画笔笔画，因为人工智能在每次处理少量信息时学习效果最佳。针对每次输入反复调整此步骤，直至生成准确的细胞表面轮廓。
      2. 选择 黄色矩形 在训练显示界面与最终生成的表面之间切换，以进行最终核对。同时检查在时间延时序列中，该表面是否准确反映了细胞形态。
    6. 一旦获得准确的表面渲染，继续进行下一步操作。取消选择分割对象。
    7. 调整直方图中的体素数量。移动阈值，以去除未与主表面连接的小型物体。
      注意：此步骤用于去除因背景噪声而产生的微小非目标表面。目标是去除所有未与感兴趣的主要细胞体相连的表面。
    8. 接下来，根据需要编辑表面。使用剪刀工具手动清除不属于主表面或切割边缘的任何物体。
    9. 如有需要，可设置允许的间隙阈值，以将间隙仍关联至目标对象。选择用于运动细胞的追踪算法。
      注意：自回归运动是细胞追踪中最常用的工具，因为它能够在整个延时过程中追踪连续的运动。
      1. 最大距离和最大间隙大小是用户定义的数值，用于设定表面可偏离的关键点。设置一个 最大间隙距离 的 0.96 µm 和一个 最大间隙大小 的 3 （默认设置）
    10. 类似于步骤 5.1.7 中过滤表面物体的方法，过滤未与主表面关联的轨迹。这也通过直方图进行调整。通过观察持续不超过五个时间帧的小斑点轨迹从滤波调整中被去除的位置，来确定阈值的设定范围。
    11. 接下来，可根据需要设置分类。例如，将位移长度进行分类 0 - 1 µm 和 1+ µm 用于确定微小的过程性移动或显著的大范围过程性变化或细胞位移。
    12. 最后，使用上一步的分类结果为特定事件添加适当的标签。
      注意：此步骤最好在突触后信号的斑点生成后使用。
  2. PSD95的斑点分类
    1. 为检测完整的单个小胶质细胞，请点击 蓝色表面 图标位于 对象 工具栏。选择最后三个选项 算法 设置： 随时间追踪表面，表面分类，以及 对象-对象统计学. 点击蓝色 播放 点击按钮进入下一步。
    2. 选择 源通道 用于突触标记物。关闭切片工具及其他所有通道，仅显示 PSD95。使用 ctrl 按钮和 指针选择工具 用于估算斑点的xy直径。
      1. 选择几个在整个延时成像过程中持续存在且亮度较高的点状结构（大小范围在 0.6 µm 和 1.2 µm).
      2. 关闭背景减除。如果图像需要背景减除，请使用 背景扣除工具 下 图像处理 在处理延时成像之前。
    3. 接下来，根据斑点质量添加一个滤波器。拖动直方图，使整个时间序列中所有PSD95斑点均被准确捕获。
      注意：质量基于斑点中心的强度9该滤波器相较于体素数量滤波器或直径滤波器，能更准确地捕获PSD95的实际信号。
    4. 接下来，使用编辑步骤去除由噪声产生的斑点。切换使用立方体光标或圆形光标，分别去除因噪声仅在1-2个时间帧中出现的单个或多个斑点。
    5. 如有需要，可设置允许的间隙阈值，以仍将这些间隙与目标对象相关联。选择适用于突触标记物的合适追踪算法。
      1. 最大距离和最大间隙大小是用户定义的数值，用于设定斑点可偏离的重要参考点。设置一个 最大间隙距离 的 14.6 µm 和一个 最大间隙大小 的 3 （默认设置）
    6. 类似于步骤 5.2.3 中对点状物体的筛选，过滤掉未与明显点状信号相关联的轨迹。该过程同样通过直方图进行调整。为确定阈值设置位置，应观察小物体轨迹被去除时的数值。
    7. 根据需要设置分类。例如，通过使用以下方式区分被吞噬、已接触或未接触的点状结构： 表面最短距离 分类。设置 吞噬 如任何 点状结构 < 表面内 0 µm，已接触 与……之间 表面0至0.5 µm范围内，或 未接触 作为 表面0.5+ µm处.
    8. 最后，使用上一步的分类结果为特定事件添加适当的标签。
  3. 一旦表面和斑点准确地表示了目标小胶质细胞和斑点，导出每个对象下的所有统计数据 统计学 表格。确保提取详细统计信息，其中将包含 位移长度，速度 和 接触事件分类.
    1. 面积、体积、位移长度和速度等多种统计结果可由 Imaris 输出。导出表面位移长度和速度，以定义实验中小胶质细胞的动态特征。
      1. 将位移长度定义为表面初始位置与最终位置之间的距离，以 µm 为单位进行测量22.
      2. 将速度定义为表面在相邻时间间隔内的瞬时速度，单位为 µm/s22.
        注意：接触事件是作者描述的一种现象，指在时间序列中至少连续五个时间帧内，完整的突触后斑点与单个小胶质细胞之间的距离为0 µm。

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结果

使用所述方案对来自CX3CR1-GFP小鼠视网膜的小胶质细胞进行成像。小鼠在注射AAV-PSD95-RFP时年龄介于P30至P60之间，且至少经过21天以确保AAV充分表达。分析前后小胶质细胞及其与PSD95斑点相互作用的代表性图像见图2。为诱导小胶质细胞活化，我们采用了小鼠激光诱导眼压升高（LIOH）模型，该模型可短暂升高眼内压（IOP）10,16,17,18,19,20。左眼接受激光处理，右眼作为对侧对照。额外的对照组包括年龄匹配、未接受激光处理的 naïve 动物的眼睛。激光处理后第...

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讨论

本方案可实现对小胶质细胞与视网膜神经节细胞（RGC）树突上突触后位点之间相互作用的可视化与追踪。在青光眼等神经退行性疾病中，小胶质细胞与视网膜内丛状层（IPL）中的突触发生共定位。小胶质细胞在突触拆解过程中的作用尚不明确。然而，小胶质细胞可能通过多种潜在机制参与其中，包括异常吞噬突触、被动清除凋亡细胞的碎片，或上述机制的组合。

该方案可作为一种强有力的工具，用于区分并表征小胶质细胞在发育及疾病状态下的行为。通过采用所述实验方案，我们已成功对疾病状态下小鼠视网膜中小胶质细胞的动态行为及其与突触结构的相互作用进行了成像。我们观察到，在激光处理条件下，小胶质细胞突起的位移长度和移动速度较对照组显著增加。此外，我们还发现小胶质细胞与突触后蛋白PSD95之间的接触增多。近期在固定视网膜中的研究发现表明，小胶质细胞与兴奋性突触的共定位增加是由于小胶质细胞增生所致；而通过本方案，我们不仅证实了小胶质细胞与突触接触的增加，还可捕捉到潜在的吞噬事件。10高质量延时成像记录的其他方案 体内 用于研究小胶质细胞相互作用的方法已有多种

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

PSD-95pTagRFP 由 Johannes Hell 惠赠（Addgene 质粒 #52671；RRID: Addgene_52671），而其衣壳版本 7m8 由 John Flannery 和 David Schaffer 惠赠（Addgene 质粒 #64839；RRID: Addgene_64839）。我们感谢 Aparna Lakkaraju 允许我们使用其实验室的转盘共聚焦显微镜，以及 Nilsa La Cunza 在活细胞成像方面的指导。我们还要感谢 Felice Dunn、Annika Balraj 和 Luca Della Santina 对本手稿提出的有益讨论和意见。我们感谢 Suling Wang 在 Imaris 软件中进行数据分析时提供的协助。 本研究由 NIH-NEI EY028148 和 EY034973（授予 Y.O.）、ARVO David L. Epstein 奖（授予 Y.O.）以及 NIH-NEI EY034973-S1（授予 C.F.）资助。本研究还部分得到了 NIH-NEI P30 EY002162/EY037668 资助的加州大学旧金山分校（UCSF）视觉核心共享资源，以及来自“预防失明研究”组织（Research to Prevent Blindness，纽约，NY）的无限制资助的支持。图 1 使用 biorender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
25 号针头Alcon8065420920
26 号 10 µL 注射器Hamilton701RNWG
7m8Addgene64839http://n2t.net/addgene:64839
可弯折定型多功能 304 不锈钢丝Stanford Advanced MaterialsSS3368用于制作环状结构的钢丝
六水合氯化钙Sigma-AldrichC5080-500G
解剖显微镜Amscope用于视网膜的解剖与封片
解剖剪刀FST15024-10
D-(+)-葡萄糖Sigma-AldrichG7528-250G
镊子Dumont11252-21
HEPESSigma-AldrichH3375-500G
Imaris 10.0.2Oxford Instruments分析软件
Imaris 文件转换器Oxford Instruments
Loctite 超级胶水 Ultra Gel ControlLoctite1363589用于制作环状结构的胶水
六水合氯化镁Sigma-AldrichM9272-100G
MCE 膜滤纸（13 mm）MilliporeHABG01300孔径 0.45 μm
微环境培养室Tokai HitSTXG-TIZBX-SET
Nikon Eclipse Ti2-E 倒置显微镜Nikon
NIS ElementsNikon
新霉素和多粘菌素 B 磺胺与杆菌肽锌眼用溶液软膏，USPBausch + Lomb24208-780-55
00 号画笔Amazon
Prism 8.0GraphPad
盐酸丙帕他卡因眼用溶液 USP，0.5%Sandoz61314-0016-01
多聚赖氨酸包被培养皿（35 mm）MatekP35GC-1.5-14-C1.5 号盖玻片
PSD95_pTagRFPAddgene52671http://n2t.net/addgene:52671
氯化钾Sigma-AldrichP9333-500G
氯化钠Sigma-AldrichS7653-1KG
一水合磷酸二氢钠Sigma-AldrichS9638-25G

参考文献

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