用于肿瘤和疾病研究的胶基组织微阵列构建

Summary

该协议描述了一种低成本生产和高效的胶基TMA构建验证方法，为肿瘤和疾病研究提供了便捷的病理诊断平台。

Abstract

组织微阵列技术（TMA）是一种高通量平台，可同时检测和分析多个组织样本，促进高效的肿瘤和疾病生物标志物研究。然而，传统的TMA施工方法往往面临作复杂、程序耗时、精度不一等局限性。开发了一种基于胶水的 TMA 构建方法来克服这些挑战，提供改进的组织核心固定和增强的结构稳定性。系统验证包括组织学评估（HE 染色）、靶蛋白的免疫组织化学分析和荧光原位杂交 （FISH） 分析。结果表明，基于胶水的方法保持了出色的切片完整性，提高了信噪比，并确保了一致的批次间重现性。尽管该方法仅限于手动作，但它为中等通量 TMA 生产提供了可靠且经济高效的选择。该方法特别适合重视灵活性和样本多样性而不是大规模自动化的研究环境，从而扩展了 TMA 在学术和诊断环境中的实用性。

Introduction

组织微阵列（TMA）是一种用于分析组织样品^的高通量技术^1,2,3。获得多个供体组织核心，并将供体石蜡块转移到受体组织块中，以便在理论上相同的^{性能条件下进行}同时差异和比较分子分析^2,4。构建组织微阵列 （TMA） 的经典方法是使用打孔器从供体组织样本中提取组织核心，并将它们依次排列到受体石蜡块中。该方法适用于相似深度的供体石蜡块，并允许在单个切片上对多个样品进行有效分析，大大提高了研究的效率^和数据的一致性^5,6,7。然而，该方法仍然具有某些局限性，包括在包埋过程中对组织核心的处理不充分，这可能导致在后续分析中样品染色不^一致8。

TMA构建的第二种方法是胶带法^9,10。该方法通过将块浇筑在倒立芯周围来反转施工过程，这些芯材在完成后与 TMA 的顶部齐平，无论芯长如何^11,12。然而，这种方法需要确保组织核心的正确放置和胶带的有效性，并且与传统技术相比，还限制了可以处理的样本数量。

本研究提出了一种构建TMA的创新胶合方法，旨在解决传统技术¹³中存在的组织核心稳定性不足、作复杂等问题。该方法利用胶水将多个组织核心精确固定在一起，具有作简单、样品牢固性强等优点。与传统的切片或胶带方法相比，胶水法可以提高组织核心的保留率并降低成本。该方法适用于样本量中等的临床研究，特别适用于需要灵活调整实验方案的研究设计。但需要注意的是，该方法的处理能力不能满足超高通量^{的需求9。}同时，在实际应用过程中，必须建立一整套标准化的作规范和质量控制体系。作人员需要接受系统的培训，并通过专业考核，以确保技术作的规范性和结果的可重复性。综合分析表明，该技术在作灵活性、成本效益和技术可靠性之间取得了良好的平衡，特别适用于资源有限但仍需保证质量控制的研究场景。

Protocol

所有供体块均取自2016—2018年南京医科大学附属淮安市第一人民医院采集的档案病理标本。样品在使用前经过去识别化处理，并按照批准的方案进行处理（南京医科大学附属淮安市第一人民医院伦理委员会，KY-2024-250-01）。

1. 供体组织的评估和标记

1. 选择厚度为 ≥5 毫米、面积为 ≥15 毫米× 15 毫米的组织块。确保边缘有 2 毫米的安全裕度，并排除出现坏死、出血或钙化的区域，以保持组织完整性。
2. 目标区域识别和标记
   1. 使用光学显微镜评估H&E染色切片。通过低功率扫描定位目标区域，然后切换到高功率以确认细胞形态特征。在幻灯片上标记目标区域边界。
   2. 将所选区域的坐标映射到石蜡块的表面，以完成标记转换。

2.组织核心提取

1. 穿刺准备和样品预处理
   1. 选择直径为2毫米的手持式打孔机，确认其切削刃的光滑度和作的便利性。
   2. 将供体石蜡块放在4°C的冷平台上15分钟。
2. 将针头垂直对准标记点，并施加稳定的旋转压力以达到极限深度。避免在此过程中倾斜或振动⁷ （图 1A）。
3. 轻轻逆时针旋转针头（≤2 转/秒）将其拔出。小心地从针头中弹出组织核心，并将其转移到预冷的 96 孔板的单个孔中。记录每个孔中的核心位置（图1B）。
   注意： 如果组织核心的底部不平整，请用刀片将其调平。修剪后，重新检查完整性。
4. 在注册表中预先记录所有供体编号和相应的 ELISA 板孔位置 （A1-H12）。在作过程中，重新检查以确保供体编号和孔位之间严格对应。
5. 立即检查芯线的完整性。丢弃断裂、弯曲或直径偏差 >0.1 毫米的芯线。
   注意：确保芯长一致性（变异系数，CV ≤5%）并避免表面划痕或压缩伪影。

3.组织核心固定

1. 使用防水记号笔直接在模具表面绘制网格，确保线条清晰均匀。
   1. 使用有效底部面积为3.0 cm×2.5 cm的标准模具，每边预留1.5 mm的空白边界区域。
   2. 用0.5毫米细点防水标记，在水平和垂直方向上画出九条等距的平行线，形成9×9的定位网格（共81个交点）。
      注意： 开始前，用浸有二甲苯的棉签清洁模具内部，去除残留的石蜡，这可能会导致分层。在绘图过程中，使用钢尺，确保线粗细均匀，交叉点可清晰区分。
2. 使用移液器抽取 5 μL 胶水，然后轻轻地将其放在预标记载玻片的中心以形成单个液滴。立即用细镊子以90°角垂直拾取组织核心，然后慢慢垂直压入胶滴中（图1C）。
3. 使用镊子将型芯插入模具上相应的网格交叉点中。轻轻按压 5 秒以确保牢固粘附（图 1D）。
4. 如果组织核心移位，请在胶水凝固之前（30 秒内）立即使用细镊子对其进行微调和重置。丢弃凝固、未对准的芯，以保持制备质量，同时最大限度地保存珍贵的样品。

4. 盒式安装和石蜡包埋

1. 将纸巾盒垂直放置在钢模上，确保与芯尖接触而不施加压缩。在所有四个角使用磁性夹子固定盒，并用熔融石蜡密封接缝。
2. 以 45° 角以锯齿形模式注入熔融石蜡，保持 1 mL/s 的流速。确保石蜡液位超过芯尖 2 毫米（图 1E）。
3. 在 4 °C 冷板上快速冷却块 5 分钟，以形成刚性支撑层。将块转移到 22 °C 环境中 20 分钟以减少内应力。最后，用40°C的热风枪轻轻地平滑表面，消除收缩痕迹。
4. 稍微加热石蜡使其软化，然后沿着盒式边缘小心地切割以松开块。轻轻提起盒并去除任何残留的石蜡，以确保组织核心的完整性（图1F）。

Results

在本研究中，使用胶水方法构建了高质量的组织微阵列。为了验证该方法的有效性，进行了一系列实验，包括H&E染色、特定蛋白质的免疫组化检测和荧光 原位 杂交（FISH）分析。施工过程的一个关键组成部分是组织核心点在预期的位置和彼此相距的距离，并通过目视检查进行评估。对TMA块的目视检查表明，每个TMA中都存在核心并规则间隔（图2A）。H&E染色显示，所有组织核心排列整齐，间距均匀，大小一致，靶组织丰富（图2B）。免疫组织化学染色结果显示，TMA中10种前列腺癌相关蛋白（ZCCHC24、SMAD9、TARBP1、CDHR4、CRTAC1、DNASE1L3、GPR146、IGSF10、ITIH1和CDK1）的稳健表达，显示出一致的染色强度和最小的背景干扰（图3）。此外，FISH分析显示，在干净的背景下，探针信号清晰。在透明的肿瘤区域，识别至少两个浸润性癌区域，并在至少 20 个浸润性癌细胞中随机计数 GSP HER2（红色）和 CSP ...

Discussion

胶水法作为一种构建组织微阵列（TMA）的创新方法，由于其施工程序简便且成本效益高，显示出显着的优势。与依赖精密仪器^14,15的传统针阵法相比，胶合法通过胶合实现样品固定，只需基本工具即可完成，大大降低了技术门槛。与传统的包埋方法相比，胶合方法通过局部分配固定，这显着缩短了组织核心的定位时间，避免了敏感抗原被高温破坏^16,17（表2）。

然而，在实际施工过程中，有许多复杂而精细的步骤。这些步骤不仅消耗了大量的时间，而且对作人员的技术水平和经验提出了极高的要求。从供体组织的选择和标记到组织核心的提取、固定和石蜡包埋，每个步骤都需要精确的构建程序和严格的质量控制^18,19

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
乳腺癌HER2检测试剂盒	安比平	2502001	腺癌HER2检测试剂盒
CDHR4	Abcam	ab166914	CDHR4抗体
CDK1抗体 Abcam		ab265590	CDK1抗体
CRTAC1抗体	Abcam	ab254691	CRTAC1抗体
DNASE1L3	Abcam	ab203669	DNASE1L3抗体
包埋机	P.S.J MEDICAL	BM450A	包埋机
全自动组织脱水机	徕卡生物系统	ASP3005	全自动组织脱水机
玻璃显微镜载玻片	Citotest	250124A1	玻璃显微镜载玻片
水	TIZO	200	胶水
GPR146 抗体	Abcam	ab117104	GPR146 抗体
IGSF10 抗体	Abcam	ab197671	IGSF10 抗体
ITIH1 抗体	Abcam	ab233032	ITIH1 抗体
薄型切片机刀片	赛默飞世尔	3052835	薄型切片机刀片
标记笔	Deli	SK109	标记笔
片机	徕卡生物系统	HistoCore BIOCUT	切片机石
蜡	Solarbio	YA0012	石蜡
SMAD9 抗体	Abcam	ab262940	SMAD9 抗体
TARBP1 抗体	Abcam	ab115896	TARBP1 抗体
ZCCHC24 抗体	Abcam	ab88756	ZCCHC24 抗体