流式细胞术和单细胞分析表征小鼠出生后早期大脑发育中的小胶质细胞激活

Summary

该协议结合了流式细胞术和单细胞RNA测序，以分离和表征出生后早期小鼠大脑小脑中的小胶质细胞状态。它使用酶解离、Percoll 离心和免疫染色来揭示小胶质细胞的异质性，并提高对其在小脑发育和疾病中的作用的理解。

Abstract

小胶质细胞是大脑的常驻免疫细胞，在发育和疾病过程中表现出区域和环境特异性的转录谱。该协议提供了两种研究小鼠小脑组织中小胶质细胞群的补充方法：流式细胞术和单细胞RNA测序。

作为第一种使用的方法，基于流式细胞术的方案针对出生后早期大脑进行了优化，确保了强大的细胞分离和跨实验条件的一致性。它首先使用酶消化进行组织解离，然后通过 Percoll 密度梯度离心去除髓磷脂以产生高质量的神经细胞悬液，以及基于 CD45 和 CD11b 表达的门控策略。活/死染色确保细胞活力，荧光染料偶联抗体用于分析小胶质细胞上选定表面标记物的表达。使用乳胶珠进行补偿控制，并使用荧光减一 （FMO） 对照进行经过验证的门控策略。

第二种方法涉及使用 10X Genomics 进行单细胞 RNA 测序，遵循相同的上游分离步骤，从而能够跨条件对小胶质细胞进行转录组学分析。使用基因表达分析鉴定小胶质细胞簇，并在实验组之间进行差异表达分析。随机森林分类器仅用于在多路复用时区分男性和女性样本。

这些可重复且适应性强的方案共同为研究早期大脑发育过程中小脑中的小胶质细胞多样性及其在实验扰动后的潜在改变提供了一个强大的框架。

Introduction

产后早期是大脑发育的关键阶段，其特征是复杂的细胞和分子过程，为认知、情感和行为功能奠定了基础¹。然而，这一时期也充满脆弱性，因为中断会改变神经发育轨迹并导致长期的神经或精神疾病。小胶质细胞是大脑的常驻免疫细胞，通过突触修剪、吞噬作用、免疫监视和对环境侮辱的反应，在塑造发育中的大脑方面发挥着核心作用 ^2,3。这些细胞表现出显着的可塑性，采用根据大脑区域、发育阶段和病理背景而变化的转录谱^4,5。

准确分析发育中大脑中小胶质细胞的激活需要能够在未成熟脑组织背景下分析其动态表型的稳健且可重复的方法。流式细胞术提供了可靠的解决方案，能够对细胞群和标记物表达进行高通量表征⁶。然而，由于组织的脆弱性质以及需要有效的细胞分离和富集方案，它在研究产后早期大脑小胶质细胞方面的应用在技术上具有挑战性^7,8。

这里介绍的方案结合了流式细胞术和单细胞RNA测序（scRNA-seq），以从出生后早期小鼠大脑中分离和表征小胶质细胞，特别关注从出生后第3天（P3）到出生后第30天（P30^）9的小脑，该区域和发育阶段的详细方法学参考仍然有限。

该工作流程包括酶解离、用于去除碎片和细胞富集的密度梯度离心，以及使用一组细胞外和细胞内标记物进行免疫染色。为了表征小胶质细胞多样性，采用了一系列表面和细胞内标记物^10,11。该协议没有分配固定标签（炎症或修复），而是根据离散的标记表达谱定义亚群。例如，表达 CD80、CD86 和 iNOS、CD206 和 Arg1、CD86 和 CD64 或 CD163 和 CD206 的小胶质细胞被鉴定和分析为分子不同的亚群。这些标记物反映了不同的活化小胶质细胞状态^10,11，并以表达谱的形式呈现。

这种多参数门控策略能够根据表面标记物表达精确识别小胶质细胞亚群，为分析出生后大脑发育过程中的免疫异质性提供了一个简化的框架。为了扩展表型分析并揭示转录多样性，在细胞分离后进行单细胞RNA测序。这项研究建立了一个一致且可扩展的工作流程，以促进对神经发育过程和小胶质细胞激活的长期影响的理解。通过将优化的流式细胞术和 scRNA-seq 整合到发育和区域知情框架中，该协议成为研究生命早期小胶质细胞生物学及其与神经发育结果相关性的强大工具。

Protocol

所有动物程序均经过 CHU Sainte-Justine 研究中心伦理委员会的审查和批准，并符合 Ste-Justine 研究中心和蒙特利尔大学（加拿大魁北克省蒙特利尔）的指导方针和政策。

1. 细胞与大脑隔离

1. 麻醉/安乐死程序后，快速从颅腔中取出整个大脑，并将其放入装有小胶质细胞培养基的15mL管中（参见 材料表）。将管子放在冰上。如有必要，对其他小鼠重复相同的过程。
   本研究中使用的所有小鼠均来自Tremblay博士实验室的内部繁殖群。实验小鼠是通过将 B6.129-Cx3Cr1^{CreERT2-EYFP/WT} 小鼠与 B6-Rosa26^iDTR/WT 小鼠杂交而产生的，两者最初都来自杰克逊实验室。这种育种策略产生了 IDTR 等位基因杂合的后代，从而能够通过他莫昔芬诱导的 Cre-loxP 系统条件耗尽表达 Cx3Cr1 的细胞（主要是小胶质细胞）。在组织收集之前，通过腹腔注射氯胺酮（150μg/g）和甲苯噻嗪（10μg/g）麻醉小鼠。安乐死是根据机构动物护理和使用指南在深度麻醉下斩首进行的。
2. 如果需要，可以保留整个大脑或继续解剖特定区域。在冰上含有小胶质细胞培养基（参见 材料表）的小培养皿中进行解剖，以维持细胞活力。
   注意：该协议已针对整个大脑和从 P1 到 P30 的小脑进行了验证。
3. 取出小胶质细胞培养基，并在培养皿中使用手术刀精细切割脑组织。
4. 对于酶消化，将均质组织转移到5mL管中。加入 2 mL 补充有 2 mg/mL 胶原酶 D 和 14 μg/mL DNase I 的 HBSS （1x）（见 表 1）。用封口膜密封管盖。将试管在37°C水浴中孵育15分钟，每5分钟摇动一次试管。要停止消化，请将试管放在冰上。
5. 将匀浆通过 140 μm 金属网过滤器（参见 材料表）以去除大碎屑。使用玻璃杵解离细胞。
6. 用小胶质细胞培养基（每次洗涤 3 mL）多次洗涤过滤器。
7. 使用 10 mL 移液器收集滤液并将其转移到 15 mL 管中。将溶液在 500 g 下在 4 °C 下离心 7 分钟。
8. 小心地倒置管子，丢弃上清液。在架子上轻轻刮擦，重悬沉淀。
9. 加入10mL37%二氧化硅基胶体培养基溶液（见表1）以去除髓磷脂和碎屑。在4°C下以500g离心溶液10分钟，制动力最小。
10. 使用 10 mL 移液器吸出溶液顶部的髓鞘层。
    注意：连续抽吸可防止髓磷脂重新混合到溶液中。
11. 通过加入 10 mL HBSS （1x） 洗涤细胞，并在 4°C 下以 500 × g 离心 7 分钟。
12. 弃去上清液。用架子轻轻刮擦沉淀，然后加入 10 mL 荧光激活细胞分选 （FACS） 缓冲液（见 表 1）。将溶液在 500 g 下在 4 °C 下离心 10 分钟。
13. 弃去上清液，重悬最终沉淀，并保留细胞。分离的细胞现在已准备好进行流式细胞术染色或单细胞RNA测序。
14. 对于单细胞RNA测序分离，使用台式稳定荧光试剂（参见 材料表）在显微镜下计数细胞，以区分活细胞和死有核细胞，以及台盼蓝（参见 材料表）。确保细胞处于良好状态，活力高达 90%，浓度达到 1000 个细胞/μL）。第 9.1 节介绍了后续步骤。
    注意：在整个协议中将管子放在冰上。所有离心步骤必须在4°C下以最大制动进行，但Percoll步骤除外，其中指定了最小制动。为获得最佳效果，请在同一天执行整个方案。对于单细胞RNA测序方案过滤所有用于分离的溶液，在步骤1.11中，使用HBSS（1x）进行第二次洗涤，在步骤1.12中，保留70-100μL细胞溶液。

2. 流式细胞术细胞外染色方案

1. 将所有细胞转移到具有锥形底部的 96 孔板中（参见 材料表）。将板在 4°C 下以 500 g 离心 5 分钟。
2. 快速倒置板，一次去除上清液。
3. 将细胞沉淀重悬于 25 μL 封闭溶液中（见 表 1）。在室温 （RT） 下孵育 15 分钟。
4. 为了制备细胞外抗体染色混合物（见 表2），将抗体储备液以10,000 × g 离心以去除潜在的聚集体。在不干扰沉淀的情况下，小心地从上清液中吸出所需体积以制备染色混合物，并使用 FACS 缓冲液将体积调节至 25 μL。
5. 向每个孔中加入 25 μL 细胞外抗体混合物。在室温下孵育20分钟。
   注意：在实验使用之前，所有抗体在小脑（或脑）单细胞悬液上滴定，以确定最佳工作浓度。通过连续稀释进行滴定以生成饱和曲线，并选择与具有最小背景的信号平台相对应的稀释度进行信号分期。
6. 在不混合的情况下，向孔中加入 150 μL FACS 缓冲液。将板在 500 × g 下在 4 °C 下离心 5 分钟。 倒置板以一次去除上清液。
7. 将细胞沉淀重悬于 200 μL FACS 缓冲液中。将板在 500 × g 在 4 °C 下离心 5 分钟。 倒置板以一次去除上清液。在相同条件下使用 200 μL FACS 缓冲液再次重复洗涤。

3. 细胞内染色

1. 将细胞重悬于 100 μL 皂苷-多聚甲醛 （PFA） 缓冲液（见 表 1）中以固定和透化细胞。在室温下孵育10分钟，避光。
2. 在不混合的情况下，加入 100 μL 皂苷缓冲液（见 表 1）。将板在 4°C 下以 500 × g 离心 6 分钟。 倒置板以一次去除上清液。
3. 将细胞沉淀重悬于 200 μL 皂苷缓冲液中。通过向 11 个空孔中加入 20 μL 磁珠（参见 材料表）来制备补偿对照。将板在 500 × g 在 4 °C 下离心 6 分钟。 倒置板以一次去除上清液。
4. 为了制备细胞内抗体染色混合物（见 表3），将抗体储备液以10,000 × g 离心以去除潜在的聚集体。在不干扰沉淀的情况下，小心地从上清液中吸出所需体积以制备染色混合物，并用皂苷缓冲液将体积调节至 50 μL。
5. 将沉淀重悬于 50 μL 细胞内抗体混合物中（见 表 3）。向珠孔中加入每种抗体 1 μL。在室温下孵育30分钟。
6. 在不混合的情况下，向每个细胞样品孔中加入 150 μL 皂苷缓冲液，然后向每个含有补偿对照的孔中加入 100 μL FACS 缓冲液以洗涤珠子。将板在 4°C 下以 500 × g 离心 6 分钟。 倒置板以一次去除上清液。
7. 将细胞沉淀重悬于 200 μL 皂苷缓冲液中，并将补偿对照重悬于 200 μL FACS 缓冲液中。将板在 4°C 下以 500 × g 离心 6 分钟。 倒置板以一次去除上清液。在相同条件下使用 200 μL 皂苷缓冲液再次重复洗涤。
8. 将细胞和补偿对照重悬于 200 μL FACS 缓冲液中。将悬浮液转移到FACS管中并储存在4°C，直到流式细胞术采集。
   注意：确保涉及光敏试剂的所有步骤都在最小的光照条件下进行。一个珠孔不含抗体，对应于未染色的珠管。

4. 流式细胞术采集

1. 打开流式细胞仪，然后打开计算机。
2. 打开流式细胞仪软件，然后通过选择细胞仪选项卡下的 运行 来启动流路启动。
3. 通过单击 “新建文件夹 ”并分配名称来创建新的实验文件夹。然后单击 “新建实验 ”以命名实验，然后选择 “新建试管 ”以添加标本和样品管。

5. 设置补偿控制

1. 为面板中使用的每种荧光染料准备单染色补偿珠，以及未染色的对照。
2. 将补偿管加载到细胞仪上。将前向散射 （FSC） 和侧向散射 （SSC） 电压设置为大约 250。
3. 调整每个荧光通道的电压，使负种群位于轴的前十进制中。
4. 每管至少获取 5,000 个事件。
5. 使用补偿矩阵调整频谱重叠，直到所有正峰与负总体清晰分离，并在相应轴上居中 10⁴ 上方。
   注意：必须对每个实验进行补偿控制，因为细胞仪设置或荧光染料性能会显着影响光谱重叠。尽管在某些脑组织应用中推荐基于细胞的补偿对照，但由于可从 P3 小鼠小脑获得的小胶质细胞数量较少，因此该协议中使用了抗体捕获珠，这限制了基于细胞的补偿的可行性。抗体荧光最初在脑源性细胞上进行了验证，发现与基于珠子的信号相当。在初始面板优化期间包括未染色的脑源性细胞悬液，以评估组织自发荧光并建立基线信号水平。这种控制对于在每个荧光通道中正确设置负群体至关重要。

6. 准备和获取 FMO 控制

1. 对于每个关键标记物，准备一个荧光减一 （FMO） 对照，其中包括除被测抗体之外的所有抗体。
2. 使用与完全染色的样品相同的采集设置运行 FMO 控件。
3. 使用 FMO 图定义低或重叠总体的门控阈值，并将真阳性与背景噪声区分开来。
   注意：应在初始面板优化期间执行FMO控制，以定义准确可靠的门控边界，特别是在具有高自发荧光的组织中，例如大脑。如果修改染色面板、仪器设置或实验条件，则必须重复 FMO 控制。对于使用相同的经过验证的面板和流式细胞仪设置的后续实验，可以重复使用先前定义的门控阈值，以确保生物重复之间的一致性。

7. 准备和获取同种型对照

1. 用荧光染料和浓度与测试抗体相匹配的同种型对照抗体对照样品进行染色。
2. 使用相同的细胞仪设置获取数据。
3. 仅使用同种型对照来评估潜在的非特异性结合，特别是在细胞内标记物或特征不佳的抗体的情况下。不要使用同种型对照进行门控，因为它们不能反映与特异性抗体相同的结合动力学。
   注意：同种型对照不适用于门控，不应用于定义群体。它们的使用是可选的，应保留用于验证特定情况下的抗体特异性。

8. 流式细胞术门控策略

1. 为顺序门控创建以下点图：
   FSC-A 与 SSC-A 排除碎屑
   FSC-A 与 FSC-H 选择单线态。
   FSC-A 与 Amcyan（活力染料）对活细胞进行门控。
2. 使用 CD11b （FITC） 与 CD45 （AF700） 将小胶质细胞识别为 CD11b⁺CD45⁺ 。
   注意：由于发育阶段（P3-P15），炎症背景和酶消化，TMEM119和P2RY12对于通过流式细胞术将小胶质细胞与其他髓系群体明确分离并不可靠。因此，先前在产后大脑中验证的 CD11b⁺CD45⁺ 门控策略用于识别小胶质细胞群，同时最大限度地减少污染。在对照条件下，从 P3 到 P15 的整个大脑的典型产量范围为 30,000 至 200,000 个小胶质细胞。对于专门针对小脑的实验，平均产量约为每个大脑 5,000 个小胶质细胞。
3. 使用 FMO 控件定义激活标记的门控阈值。
4. 根据免疫相关标志物的表达识别小胶质细胞亚群：
   CD80⁺ （超亮 436）
   CD86⁺ （PE）
   iNOS⁺ （PE-eFluor 610）
5. 通过标记表达的组合进一步表征小胶质细胞亚群：
   CD206⁺ （APC）^{然后 Arg1+} （PE-Cy7）
   CD86⁺ （PE）^{然后是 CD64+} （PerCP-eFluor 710）
   CD163⁺ （超亮 600）^{然后是 CD206+} （APC）
   注意：标记组合用于描述小胶质细胞群内的分子异质性。这些亚群仅根据标记物表达进行报告，并且根据当前识别小胶质细胞可塑性和上下文依赖性表型的标准，没有分配特定的功能角色。
6. 加载实验样品。将 FSC 设置为 300，将 SSC 设置为 200。使用低流速并记录所需的事件数量。
7. 采集后，清洗细胞仪并将数据导出为 .用于分析的 FSC 文件。
8. 使用流式细胞仪软件分析数据。

9. 单细胞RNA测序样本

1. 使用与流式细胞术描述的相同细胞分离方案（参见步骤1.14），将解离的细胞重悬于FACS缓冲液中。在收集管和所有后续处理步骤中使用 FACS 缓冲液以保持细胞稳定性。
2. 如果目标是从大脑区域捕获所有细胞类型，请勿进行荧光激活细胞分选 （FACS）。但是，如果实验需要富集小胶质细胞，请在测序之前包括FACS分选步骤。
3. 立即使用台式稳定荧光活力染料和台盼蓝评估细胞活力（参见 材料表）。使用血细胞计数器在显微镜下计数细胞（参见 材料表）。
4. 在进行单细胞RNA测序之前，验证细胞悬液是否表现出至少90%的活力，并调整至约1,000个细胞/ μL的最终浓度。
5. 将所有样品放在冰上，解离后立即处理，以尽量减少细胞应激和转录变化。
6. 按照制造商的说明成对复用样品。
   注意：将同一实验组的一男一女合并以降低实验成本。
7. 准备 scRNAseq 文库（参见 材料表）并遵循推荐的制造商指南。
   注意：文库制备由蒙特利尔大学免疫学和癌症研究所（IRIC）的基因组学平台进行。
8. 使用测序系统对 scRNA-seq 文库进行测序，平均深度为每泳道 3200M 读数。
   注意：测序是在蒙特利尔的魁北克基因组进行的。

10. 单细胞RNA测序分析

1. 使用 10X Genomics 的 Cell Ranger 软件 （v8.0.0） 和小鼠 GRCm39 2024-A 参考基因组进行唯一分子标识符 （UMI） 计数分析。使用 Seurat R 包 （v5.1） 进行下游分析。
2. 通过排除线粒体RNA超过总RNA的30%的细胞（图1A）或选择更严格的阈值来去除具有潜在应激的细胞来进行质量控制。过滤掉 log10GenesPerUMI 大于 0.75（图 1B）、唯一特征计数 （“nUMI”） 低于 500 且每个细胞检测到的基因数量 （“nGene”） 大于 300 的低质量细胞（图 1C）。接下来，使用 R 中的“scDblFinder”包删除液滴。通过显示阈值的nUMI和nGene的相关图，过滤效果现在应该是可见的（图1D）。
3. 使用 Seurat 的 SelectIntegrationFeatures 函数识别每个样本 2,000 个高度可变的基因，从而减轻批次效应。
4. 使用规范相关分析 （CCA） 集成数据集，并执行主成分分析 （PCA） 以进行降维。将 RunPCA 函数与 50 个主成分 （PC） 一起使用，缩放数据并回归出不需要的变异源（例如线粒体含量）。根据弯头图和 JackStraw 分析评估保留的 PC 数量。
5. 通过 Seurat RunUMAP 函数使用均匀流形逼近和投影 （UMAP） 算法可视化聚类。使用 FindAllMarkers 函数识别簇特异性基因表达谱。通过将已识别的标记基因与精选的单细胞资源（如 PanglaoDB 和 CellMarker）进行交叉引用，根据转录特征注释簇（图 2）。细胞类型，包括小胶质细胞，是从这些转录组学谱而不是预定义的表面标记物中推断出来的。

11. 基于性别的细胞分离

1. 根据性别特异性基因的表达识别雄性和雌性细胞：四个雌性特异性（Xist、Tsix、Usp9x、Eif2s3x）和三个雄性特异性（Eif2s3y、Uty、Ddx3y）。
2. 通过使用 Seurat 的 子集 函数过滤表达这些基因中的任何一个的归一化 UMI 计数 > 1 的细胞来对男性和女性群体进行分类。
3. 通过分别对男性和女性细胞进行子集化来生成 Seurat 对象。独立存储和分析这些对象以进行下游比较。
4. 通过使用 FeaturePlot 和 VlnPlot 函数可视化性别特异性基因表达来验证分类，确保雄性和雌性细胞群之间的清晰分离。
   注意：步骤 12.1 和 12.2 仅当样品通过混合一雄一雌进行多重检测时才应执行。

12. 基于统计模型的小胶质细胞分类

1. 使用具有已知组标签的 ~1,000 个单元格的训练集，在 R 中构建五个统计模型（随机森林、逻辑回归、朴素贝叶斯、支持向量机、决策树）。
2. 使用 10 倍交叉验证和受试者工作特征 （ROC） 曲线评估模型性能（图 3）。使用 Seurat 中的 FindAllMarkers 函数识别有助于分类的关键基因。
3. 选择 ROC 曲线下面积 （AUC） 最高的模型。随机森林模型是根据其优越的AUC得分选择的。
4. 使用 RandomForest R 包中的 predict 函数将所选模型应用于未分类的单元格。使用 merge 将预测的分类与 Seurat 中先前注释的数据集合并。
5. 通过使用 FeaturePlot 和 VlnPlot 可视化标记基因表达来验证分类。为确保预测细胞身份的一致性，请使用适当的统计检验（例如，费舍尔精确检验）评估添加分类细胞前后重叠的标记基因集的富集。

13. 小胶质细胞差异基因表达分析

1. 使用修拉函数“FindMarkers”在两个特定的感兴趣组之间进行差异基因表达（DEG）分析， 其中ident.1 代表感兴趣的组， ident.2 代表参考组。
   注意：输出列出了相对于 ident.2 在 ident.1 中差异表达的基因。在这种情况下，上调的基因是在 ident.1 中表达高于 ident.2 的基因，而下调的基因在 ident.1 中表现出较低的表达。它们的比较用于生成火山图并解释特定条件的转录变化。
2. 鉴定差异表达基因 （DEG），调整后的 P 值≤为 0.05。对于两个特定组之间的比较，请使用 FindAllMarkers 函数和以下标准：在至少 10% 的细胞中表达的基因 （min.pct = 0.1） 和 0.25 的 log2 倍数变化阈值 （logfc.threshold=0.25）。对于所有小胶质细胞的多组比较，请使用具有相同参数的 FindAllMarkers 函数。调整后的 P 值 ≤ 0.05 的基因被认为显着差异表达。要可视化 DEG 表达模式，请使用 EnhancedVolcano 包中的内置函数生成火山图（图 4）。
3. 通过首先检查用于发现小胶质细胞的细胞术标记物，特别是 CD45⁺ 和 CD11b⁺，它们对应于 Ptprc和Itgam 基因，来比较流式细胞术结果。使用 Seurat 中的 FeaturePlot 函数确认基因表达。
4. 评估通常与不同小胶质细胞状态相关的标志物，包括 CD80和NOS2，以及 Mrc1、Arg1、Fcgr1 和 CD163。使用 Seurat 函数 FeaturePlot 和 DotPlot 可视化它们在细胞簇中的表达。
5. 使用 Seurat 中的 DotPlot 函数生成点图，以总结标记表达式并验证总体分类。

Results

该协议有效地利用流式细胞术根据选定的表面和细胞内标记物的表达来表征小鼠大脑样本中的小胶质细胞群。以下部分详细介绍了从工作流程的关键步骤中获得的结果，重点介绍了小胶质细胞亚群响应实验条件的分布和异质性。

补偿和门控策略验证
补偿珠用于校准荧光信号并校正荧光染料之间的光谱重叠。每种荧光染料的阳性和阴性群体被清晰地分离，从而可以生成准确的补偿基质。在面板优化期间，最初使用荧光减一 （FMO） 控制来验证门控阈值，以区分真实信号和背景信号，特别是对于不良或重叠的标记物。随后，使用相同的染色面板和细胞仪设置在实验中重复使用这些阈值，以确保一致性。包括同种型对照以监测潜在的非特异性结合，特别是对于细胞内标记物，但不用于门控决策。

小胶质细胞鉴定
活/死 （Amcyan） 细胞门控策略成功排除了死细胞。门控策略根据CD45（AF700）和CD11b（FITC）表达有效地分离了小胶质细胞群。优化前向散射 （FSC） 和侧向散射 （SSC） 参数（FSC = 300，SSC = 200），以将小胶质细胞群集中在点图中（图 5）。

小胶质细胞表型
点图分析能够根据表面和细胞内标记物的差异表达来鉴定小胶质细胞亚群。使用FlowJo软件中的特定门控策略，鉴定了表达CD80（Super Bright 436），CD86（PE）和iNOS（PE-eFluor 610）的小胶质细胞子集（图6A）。双门控还用于定义表达CD206（APC）和Arg1（PE-Cy7）的亚群（见图6B）。其他群体的特征是 CD86 （PE） 和 CD64 （PerCP-eFluor 710） 以及 CD163 （Super Bright 600） 和 CD206 （APC） 的共表达（图 6C，D）。这些表型图谱反映了小胶质细胞群内标记定义的异质性，并证明了该协议在不推断固定功能状态的情况下区分多个转录和免疫学上不同的亚群的能力。

小胶质细胞单细胞分析
均匀流形近似和投影 （UMAP） 用于可视化细胞异质性并识别其他脑细胞类型中的小胶质细胞簇。每个点代表一个细胞，簇根据转录相似性进行颜色编码（图 2）。

在小胶质细胞簇内进行差异表达分析，以鉴定在实验条件下调节的基因。调整后的 P 值≤ 0.05 的基因被认为是差异表达的。

生成火山图以可视化小胶质细胞的这些差异表达基因，突出显示那些具有高倍数变化和统计显着性的基因（图 4）。

为了将这些单细胞结果与流式细胞术数据进行比较，检查了小胶质细胞标志物 CD45 和 CD11b（Ptprc 和 Itgam） 的表达。UMAP 显示了它们在不同细胞群中的表达（图 7）。

最后，评估选定的免疫相关标志物的表达，以表征小胶质细胞之间的转录异质性。Violin 图显示了单细胞水平上 CD80 和 NOS- 等基因的表达，以及 Mrc1、 Arg1、 Fcgr1 和 CD163 的表达（图 8）。这些标记物表达模式允许与基于流式细胞术的分析进行比较，并突出小胶质细胞亚群在实验条件下的分子多样性。

图 1：单细胞转录组数据的质量控制。 （A）线粒体RNA含量在细胞中的分布。排除线粒体RNA为>30%的细胞，以去除潜在的应激或垂死细胞。（B）过滤掉log10GenesPerUMI>为0.75的细胞，以确保一致的基因与UMI比率，并减少来自低复杂度文库的噪声。（C）检测到的转录本（nUMI）少于500个或检测到的基因（nGENE）超过300个的细胞也被排除在外，以消除质量差或多个细胞。（D）NUMI与nGene的相关图说明了过滤阈值的影响。检测到的双峰被移除。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：单细胞转录组的 UMAP 可视化。 UMAP 图显示了基于从两只动物身上获得的转录组学谱的单细胞分布。每个点代表一个单元格，按聚类标识进行颜色编码。小胶质细胞簇在其他细胞群中被鉴定出来。 请点击此处查看此图的大图。

图 3：通过交叉验证评估的随机森林分类器的 ROC 曲线。 受试者工作特征 （ROC） 曲线说明了随机森林模型的性能，该模型用于根据基因表达谱将小胶质细胞与其他脑细胞类型区分开来。该模型在一组具有已知标记的 ~1000 个细胞上进行训练，并使用 10 倍交叉验证进行评估。在测试的五种统计模型（随机森林、逻辑回归、朴素贝叶斯、支持向量机和决策树）中，随机森林模型的分类性能最高。曲线下面积 （AUC） 反映了模型的准确性。 请点击此处查看此图的大图。

图4：小胶质细胞中的差异基因表达分析。 火山图表示两个实验组（对照组与小脑损伤）之间在小胶质细胞中差异表达的基因的 log2 倍变化与调整后的 P 值。上调基因在目标组中表达更高（ident.1），与参考组相比，下调基因表达降低（ident.2）。标记关键显着差异表达的基因。 请点击此处查看此图的大图。

图5：通过流式细胞术鉴定小胶质细胞的门控策略。（A）将门控策略应用于对照出生后第3天（P3）小鼠的小脑细胞。（B）选择单线态以排除双峰。（C）使用活染料鉴定活细胞;排除FSC-A低的事件，以去除碎片并确保分析完整的细胞。（D）小胶质细胞被鉴定为CD45⁺和CD11b⁺，具有两个不同的群体：CD45低CD11b^int用于静止小胶质细胞和CD45^int -CD11b^高用于活化小胶质细胞。请点击此处查看此图的大图。

图6.通过流式细胞术表征小胶质细胞标志物表达谱。（A）基于CD80，CD86和iNOS表达的CD45 ⁺ CD11b⁺细胞的顺序门控。（B）鉴定表达CD206的亚群，然后基于Arg1表达进行门控。（C）鉴定表达CD86的亚群，然后基于CD64表达进行门控。（D）鉴定表达CD163的亚群，然后基于CD206表达进行门控。这些门控策略说明了基于表面和细胞内标记表达的小胶质细胞群的表型异质性。请点击此处查看此图的大图。

图 7：在单细胞 RNA 测序数据中使用 Itgam 和 Ptprc 表达确认小胶质细胞身份。 UMAP 显示了小脑细胞在 P15 处的转录景观， Itgam 和 Ptprc 的基因表达叠加在簇中。这些经典髓系标记物的共表达支持小胶质细胞群的鉴定，并与流式细胞术中使用的标记物保持一致，从而在转录组学和蛋白质水平分析之间提供交叉验证。 请点击此处查看此图的大图。

图 8：通过单细胞 RNA 测序鉴定的小胶质细胞中选定的免疫相关基因的表达谱。小提琴图显示了CD80，NOS2，Mrc1，Arg1，Fcgr1和CD163基因表达在单个小胶质细胞中的分布。这些标记通常与免疫相关过程相关，并说明了在小胶质细胞群中观察到的转录异质性。显示了对照和小脑损伤 （CBI） 条件的数据。请点击此处查看此图的大图。

表1：用于神经细胞分离和染色的溶液的组成。 该表提供了细胞分离和染色所需溶液的详细组成，包括它们各自的浓度和成分。 请按此下载此表。

表2：用于细胞外染色的抗体混合物浓度。 该表详细说明了用于细胞外染色的抗体和活/死溶液的浓度，指定了一个样品的染色混合物中每种抗体所需的体积和稀释度。 请按此下载此表。

表3：细胞内染色的抗体混合物浓度。 该表详细说明了用于细胞内染色的抗体浓度，指定了一个样品的染色混合物中每种抗体所需的体积和稀释度。 请按此下载此表。

Discussion

本研究提出了一种详细且优化的方案，该方案结合了流式细胞术和单细胞RNA测序（scRNA-seq），用于在出生后早期大脑发育过程中分离和表征小胶质细胞。虽然流式细胞术仍然是一种经济高效且易于使用的技术，但它与单细胞转录组学的集成通过将蛋白质水平标记表达与基因水平转录谱联系起来，提供了互补的见解。该协议解决了未成熟脑组织特有的技术挑战，包括高效解离、碎片和髓鞘去除以及优化免疫染色策略，以确保在关键发育时间点分析小胶质细胞群的可重复性和可靠性。

流式细胞术用于根据选定表面和细胞内标记物的表达来鉴定小胶质细胞亚群。亚群不是推断功能状态，而是通过其标记表达谱来区分，例如 CD80⁺/CD86⁺/iNOS⁺ ;CD206⁺/Arg1⁺ ;CD86⁺/CD64⁺ 或 CD163⁺/CD206⁺ 表型。这些标记定义的群体反映了小胶质细胞区室内的分子异质性，并为高通量表征提供了实用的方法。虽然这些基于表面标记的分类可能无法捕捉小胶质细胞多样性的全部复杂性，但它们仍然具有信息量，特别是在可能无法使用高维分子工具的情况下。正如最近的文献¹² 中所述，为了认识到小胶质细胞表型的类似谱系、上下文依赖性，因此有意避免了诸如 M1/M2 范式之类的二元分类。

这些观察结果与之前的研究一致，强调小胶质细胞在正常大脑成熟和对环境或病理刺激的反应中的作用^13,14。区分小胶质细胞异质性的能力为了解小胶质细胞极化如何导致神经发育障碍提供了宝贵的见解^15,16。

尽管单细胞 RNA 测序提供了更高的分辨率并允许鉴定转录上不同的小胶质细胞亚群，但其成本和分析复杂性限制了其可及性。在围产期损伤后产后第 15 天收集的当前数据集中，炎症反应的峰值已基本解决，导致活化的小胶质细胞数量减少。因此，UMAP 等降维技术无法恢复分离良好的小胶质细胞亚簇，并且簇级转录分析未包含在本协议手稿中。

该协议的一项重大创新是它在出生后早期（P3至P30）从小脑中分离和表征小胶质细胞的优化。该区域和特定年龄背景带来了明显的挑战，包括低细胞产量、髓磷脂含量和组织脆弱性增加。为了解决这些限制，该协议集成了经过调整的解离工作流程、有效的碎片和髓鞘去除以及适合小体积小脑组织的精心调整的免疫染色条件。尽管人们越来越认识到小脑小胶质细胞在功能和转录上与其他大脑区域的小胶质细胞不同，但其分离和分析的详细方案仍然有限。目前的方法提供了可靠且易于访问的工作流程，特别适用于小脑小胶质细胞的发育研究。

本手稿的主要目标是提供一个可重复且适应性强的方法框架，而不是报告具体的生物学发现。该工作流程适用于适应其他发育阶段或实验模型，其中转录上不同的小胶质细胞状态可能更突出。在这种情况式细胞术仍然是一种有价值的工具，特别是当与补充检测相结合时。

该协议的主要优势之一是其对从出生后第 3 天 （P3） 到出生后第 30 天 （P30） 的各个发育阶段的适应性。这允许随着大脑成熟的进展对小胶质细胞表型进行纵向分析。流式细胞术和scRNA-seq的结合使用不仅可以研究表面标记物，还可以研究参与小胶质细胞的细胞内信号通路和转录因子。

然而，酶消化可能会影响某些表面标记物的表达，因此需要针对特定的实验目标^17,18仔细优化消化条件。此外，流式细胞术和单细胞测序都无法提供群体水平的数据，这可能无法完全捕捉小胶质细胞在其天然环境中相互作用的空间和功能细微差别。结合单细胞空间技术可以通过保留小胶质细胞的空间背景来帮助解决这一限制。未来的研究将该协议与成像技术相结合，例如免疫组织化学、体内成像、蛋白质印迹或单细胞空间转录组学，可以提供对小胶质细胞动力学的补充见解。

这种方法为研究生命早期的损伤（例如炎症、缺氧或环境压力源）如何影响小胶质细胞表型并导致长期神经发育结果开辟了新途径。通过对小胶质细胞激活状态进行精确可靠的表征，它有助于识别治疗靶点以调节生命早期的小胶质细胞反应，旨在预防或减轻神经发育障碍。

总之，该协议为研究早期大脑发育过程中的小胶质细胞多样性提供了一个强大且易于访问的框架。流式细胞术和单细胞RNA测序的结合，可以灵活地应用于各个发育阶段和实验模型，有助于在生理和病理背景下更深入地探索小胶质细胞生物学。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 &微型;M 金属网过滤器 	西格玛-奥尔德里奇	S3895
15 mL 试管	萨斯泰特	62.554.205
5 mL 管	萨斯泰特	55.526.006
96孔板，锥形底 	萨斯泰特	82.1583.001
精氨酸酶 1 - 偶联 Pecy7 - 克隆：A1exF5	赛默飞世尔科技	25-3697-82
台式稳定荧光试剂	Invitrogen	A49905
CD11b - 偶联物 Fitc - 克隆 ： M1/70	BD 法明根	553310
CD163 - 偶联物 SB600 - 克隆 ： TNKUPJ	赛默飞世尔科技	63-1631-82
CD206 - 偶联 APC - 克隆 ： C068C2	生物传奇	141708
CD45 - 偶联物 A700 - 克隆 ： 30-F11	BD 法明根	560510
CD64 - 偶联物 PerCP-eF710 - 克隆 ： X54-5/7.1	赛默飞世尔科技	46-0641-82
CD80 - 偶联物 SB436 - 克隆 ： 16-10A1	赛默飞世尔科技	62-0801-82
CD86 - 偶联 Pe - 克隆 ： GL-1	生物传奇	105008
胶原酶D	西格玛–奥尔德里奇	11088866001
DNase I	西格玛–奥尔德里奇	10104159001
胎牛血清 （FBS）	西格玛–奥尔德里奇	F1051型
HBSS（汉克平衡盐溶液）10x	威森特生物产品	311506CL型
血细胞计数器	VWR国际	82030-470
HEPES的	威森特生物产品	330.050.EL
iNOS - 偶联 PE- eF610 - 克隆 ： CXNFT	赛默飞世尔科技	61-5920-82
氯化钾	赛默飞世尔科技	BP366-500型
KH2PO4	赛默飞世尔科技	BP362-500型
活/死的阿姆西安	赛默飞世尔科技	L34957
小胶质细胞培养基	生命科技	型号：A12475-01
Na2HPO4	赛默飞世尔科技	BP332-500型
氯化钠	赛默飞世尔科技	BP358-212
多聚甲醛	西格玛–奥尔德里奇	第 6148 页
大鼠抗小鼠CD16/CD32	BD生物科学	553142
皂素	西格玛–奥尔德里奇	S7900型
scRNAseq 文库	10X 基因组学	1000121
二氧化硅基胶体介质	赛默飞世尔科技	45001747
叠氮化钠	赛默飞世尔科技	BP922I-500
台盼蓝	吉布科	1525006