使用竞争性酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测固体组织中的环磷酸鸟苷（cGMP）

摘要

本方案采用竞争性酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测固体组织中的环磷酸鸟苷（cGMP）浓度。本方案详细描述了固体组织的处理方法、竞争性ELISA的操作步骤、将吸光度转换为每毫升皮摩尔（pmol/mL）cGMP浓度的方法，以及最终以每克组织中cGMP的纳米摩尔数（nmol/g）计算结果的流程。

摘要

产生环磷酸鸟苷（cGMP）的主要通路之一是 一氧化氮（NO）-cGMP 通路。在该通路中，NO 激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）的催化活性，促使三磷酸鸟苷转化为 cGMP。NO 受到广泛关注，因为在哺乳动物中，它具有多种生理功能，包括作为主要的血管扩张剂、血小板聚集抑制剂、免疫功能调节介质、神经递质，以及在体力活动过程中增强耐力等。测定不同组织中 NO 的含量有助于阐明其生物学功能。然而，由于 NO 的半衰期不足数秒，无法直接进行检测。通常通过测定其代谢产物硝酸盐和亚硝酸盐的水平来间接评估 NO 的含量，因为这些分子可相互转化 体内 通过氧化还原反应。另一种较少使用的估算NO丰度的方法是检测cGMP的浓度，cGMP是NO下游的一种信号分子。然而，尽管检测组织中的cGMP有助于更深入理解NO在器官中的功能，但此类检测在组织中却很少进行。因此，亟需一种用于测定实体器官和组织中cGMP浓度的实验方案。在本方案中，采集的猪组织经匀浆处理后，对处理后的样品进行竞争性ELISA检测，并将吸光度值转换为每克原始组织中cGMP的纳摩尔数。简言之，本方案阐述了一种利用环磷酸鸟苷（cGMP）ELISA试剂盒测定固体组织中cGMP浓度的简便方法。

引言

环磷酸鸟苷（cGMP）是一种信号分子，可通过一氧化氮（NO）-cGMP信号通路诱导生理变化。在NO-cGMP通路中，NO与可溶性鸟苷酸环化酶结合，该胞质酶可将三磷酸鸟苷转化为cGMP，从而增强其催化活性^1,2cGMP浓度的随后升高可激活促进血管舒张的信号通路³，导致血压下降^4,5，一氧化氮存在时的主要生理反应特征 体内此外，已知一氧化氮（NO）可影响免疫功能⁶，提高身体活动期间的耐力⁴并通过抑制血小板聚集防止血液凝固⁷.

直接测量NO因其半衰期不足数秒而变得困难 体内⁸ 在大多数生物组织中。因此，阐明一氧化氮的生理效应需要一种测量其含量的方法 离体因此，可用的定量方法通常避免直接测量NO。一种常见的估算组织中NO浓度的方法是检测其更稳定的代谢产物：亚硝酸盐和硝酸盐。^4,5,9,10,11使用亚硝酸盐和硝酸盐浓度作为NO丰度指标的主要问题是，这两种代谢物分别还可作为NO的前体物质和储存分子。NO的代谢物，尤其是硝酸盐，在某些食物中含量较高。因此，通过检测位于NO下游的cGMP浓度变化，有助于估算有活性的NO含量，从而在不受原有亚硝酸盐和硝酸盐干扰的情况下确定NO的丰度。

既往研究主要依赖于测量血浆¹²和血小板¹³中的cGMP浓度，但对实体组织中cGMP浓度的测定则较少见。能够测定实体组织中cGMP浓度的方法将有助于表征一氧化氮（NO）在特定器官中的活性。本研究旨在建立一种利用竞争性ELISA检测实体组织中cGMP的简化方法。使用竞争性ELISA的一个优势在于，其所需的设备在大多数关注NO研究的实验室中均常见，例如常用于其他用途的酶标仪。相比之下，其他一些检测方法则需要在NO相关实验中较少使用的设备，例如显微镜^14,15、闪烁计数器¹⁶或激光器¹⁷。除了设备易得之外，竞争性ELISA检测cGMP还具有高灵敏度；cGMP浓度可低至0.1皮摩尔（pmol）/mL¹⁸。通过对cGMP ELISA试剂盒（材料表）说明书¹⁸进行少量修改，成功建立了一种利用竞争性ELISA测定实体组织中cGMP的方法。

方案

所有动物实验均按照美国国家糖尿病、消化系统与肾脏疾病研究所（NIDDK）动物护理与使用委员会批准的分子医学分部动物研究方案（ASP K049-MMB-23）进行。组织采集遵循MedStar健康研究所机构动物护理与使用委员会制定的指南（方案编号：2006001373 2020-017）。本研究使用了4只3月龄的约克夏杂交猪（两雄两雌），体重在30–35 kg之间。图1展示了cGMP ELISA试剂盒操作步骤的示意图。研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

图1：实验方案示意图。 该示意图展示了cGMP ELISA试剂盒的操作步骤。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 组织样本制备

注意：组织在采集前经肝素钠溶液灌注，并在使用前于 -80 °C 保存。有关组织样本采集的详细信息，请参见 Park 等人¹⁹。

1. 组织样本处理
   1. 在开始操作前，将组织粉碎器、镊子和勺子置于干冰上预冷10分钟。
   2. 称取过量的组织样本，因为在粉碎过程中可能会有部分损失（回收率约为90%）。
      注意：此前使用170 mg的过量组织获得了成功结果。可根据需要增加或减少组织质量。确保组织质量能够提供足够的样本体积，以满足后续组织样本乙酰化和稀释步骤的要求。
   3. 将组织加入置于干冰上的粉碎器中。
   4. 用液氮快速冷冻组织，并让液氮完全挥发。
   5. 盖上粉碎器盖子，用锤子敲击15次。
      注意：若无法使用或不可采用该粉碎装置，则需在保持组织冷冻或至少冰上冷藏的条件下，用剪刀或手术刀将其尽可能切成小片。此步骤可确保良好的均质化效果，尤其对于较硬的组织至关重要。
   6. 将珠磨均质管去皮归零，使用预冷的勺子和镊子将粉碎后的组织转移至均质管中。
   7. 记录加入珠磨均质管中的组织质量，以便后续将浓度从摩尔浓度转换为每单位质量的摩尔数。样本应始终保持在冰上。
   8. 向均质管中加入0.1 N盐酸，其体积（以微升计）为组织质量（以毫克计）的相应倍数。
      注意：适当的稀释可使样本检测值落在标准曲线范围内。不同组织类型的合适稀释倍数需通过试验确定。在先前的实验中，骨骼肌组织采用1:10的稀释比例，肝脏组织采用1:5的稀释比例，均获得了成功结果。作为参考，若处理100 mg组织，1:10的稀释比例需加入1,000 µL的0.1 N盐酸，而1:5的稀释比例则需500 µL。
   9. 使用珠磨均质器或其他等效技术对组织样本进行均质化。
      注意：均质过程中可间歇性地将样本置于冰上冷却。若无珠磨均质器，也可采用其他能有效破坏细胞并形成组织匀浆的方法替代，例如旋转式均质器或超声波均质器。
   10. 在保持样本温度为4 °C的条件下，以17,000 × g 的转速离心匀浆液30分钟。
       注意：骨骼肌组织匀浆液若稀释不足，会变得过于黏稠并呈凝胶状。此现象在离心后最为明显。
   11. 将上清液转移至微量离心管中，并在4 °C条件下以17,000 × g 的转速再次离心10分钟。
   12. 取部分上清液转移至微量离心管中，并将样本置于冰上保存。
       注意：使用250 μL上清液进行乙酰化处理已获得成功结果。如需暂停实验流程，可将这些样本在-80 °C冷冻保存，最长可保存48小时。建议在乙酰化当天测量用于该步骤的上清液体积。

2. 标准品制备

注意：在准备 ELISA 微孔板的当天配制标准品。

1. ELISA 缓冲液的配制
   1. 将解冻的 10 倍浓缩 ELISA 缓冲液加入含有 90 mL 超纯水的玻璃瓶中。
      注意：请用配制好的 ELISA 缓冲液冲洗残留的 10 倍浓缩 ELISA 缓冲液，并将冲洗液倒回玻璃瓶中。4 °C 保存，可稳定存放长达 2 个月。
2. 标准品储备液的配制
   1. 向标准品小瓶中加入 1 mL ELISA 缓冲液，振荡至完全溶解。
      注意：4 °C 保存，可稳定存放长达 6 周。
3. 标准品系列稀释
   1. 标记一个试管为标准品 B，另九个试管分别为标准品 0 至标准品 8。
   2. 向标记为标准品 B 的试管中加入 9.9 mL ELISA 缓冲液。
   3. 将 100 µL 标准品储备液（cGMP 浓度为 300 pmol/mL）转移至标准品 B 管中，充分涡旋混匀。
   4. 将标准品 B 管中的溶液 1,000 µL 转移至标准品 1 管中。
   5. 向标记为标准品 0 以及标准品 2 至标准品 8 的各试管中分别加入 500 μL ELISA 缓冲液。
   6. 涡旋混匀标准品 1，然后从中转移 500 µL 溶液至标准品 2 管中。
   7. 涡旋混匀标准品 2，然后从中转移 500 µL 溶液至标准品 3 管中。
   8. 继续将 500 μL 溶液从标准品 n-1 转移至标准品 n，每次转移后务必充分涡旋混匀各标准品管。
   9. 从标准品 8 管中弃去 500 µL 溶液。
      注意：为获得最佳标准曲线，请在指定步骤中充分涡旋混匀各标准品。标准品 0 至标准品 8 的最终体积均为 500 μL。标准品配制后应于 4 °C 保存，并在稀释当日使用。

3. 乙酰化

注意：在乙酰化反应过程中，乙酰基会被添加到 cGMP 分子的 2' 羟基上，从而改变 cGMP 的结构，使抗体的结合亲和力提高约 10 倍，增强检测的灵敏度。对于 cGMP 含量超过 1.0 pmol/mL 的样品，可不进行乙酰化处理，省略此步骤。是否需要进行乙酰化应根据具体实验情况，通过实验确定。

1. 氢氧化钾溶液的配制
   1. 向氢氧化钾试剂瓶中加入 10 mL 超纯水，配制成 4 M 的溶液。
      注意：氢氧化钾溶解过程中不要盖紧瓶盖。可在室温下保存数月。
2. 组织样品的乙酰化
   1. 向 250 μL 样品等分试样中加入 50 μL（5:1）4 M 氢氧化钾溶液，随后迅速加入 12.5 μL（20:1）乙酸酐。
   2. 涡旋振荡 15 秒。
   3. 向样品中再加入 12.5 μL 4 M 氢氧化钾溶液，并短暂涡旋。
   4. 可选步骤：若骨骼肌样品在乙酰化步骤后发生凝固，可在 17,000 × g 离心 10 分钟。
3. 标准品的乙酰化
   1. 向标记为“标准品 0”的试管中加入 100 μL 4 M 氢氧化钾溶液，立即再加入 25 μL 乙酸酐。
   2. 将标准品涡旋振荡 15 秒。
   3. 向标准品中加入 25 μL 4 M 氢氧化钾溶液，并短暂涡旋。
   4. 对剩余编号的标准品重复上述步骤。
      注意：所有样品和标准品的涡旋时间应保持一致，以确保结果的可重复性。

4. 组织样本稀释

1. 将预设比例的ELISA缓冲液和一份乙酰化样品加入微量离心管中。
   注意：每个样品需要进行两种不同的稀释。通过反复试验确定稀释比例，使测得的cGMP浓度落在标准曲线范围内。为了使百分比值保持在20%至80%之间，必须针对每种类型的组织通过实验确定相应的稀释比例。在先前对肝脏组织的测定实验中，1:2和1:3的稀释比例获得了理想的百分比值结果。这些比例在骨骼肌组织中也取得了成功。然而，骨骼肌组织可能存在差异，可能需要进一步稀释样品。
2. 可选步骤：如果组织样品加入ELISA缓冲液后形成沉淀，请以17,000 × g 离心10分钟。

5. ELISA 微孔板制备

1. 乙酰胆碱酯酶（AChE）示踪剂的制备
   1. 向AChE示踪剂小瓶中加入6 mL ELISA缓冲液，轻轻振摇以溶解。
      注意：样品可在4 °C下保存最多2周。切勿涡旋。
2. 抗血清的制备
   1. 向抗血清小瓶中加入6 mL ELISA缓冲液，轻轻振摇以溶解。
      注意：可在4 °C下保存至少4周。切勿涡旋。
3. 样品与标准品孵育
   1. 涡旋标准品0。
   2. 向ELISA微孔板中，每孔加入50 µL标准品0，共加5个孔（NSB和B₀；图2）。
   3. 向含有标准品0的两个孔（NSB；图2）中，各加入50 μL ELISA缓冲液。
   4. 使用同一枪头，将标准品1至8以50 µL等分试样，每个浓度设两个复孔，依次加入ELISA微孔板中。从最稀释的标准品（标准品8）开始，依次向浓度更高的标准品加样，直至所有标准品加完。
      注意：在将每个标准品加入孔中前，应反复吹吸数次。加样前需涡旋混匀各标准品。
   5. 每个样品在加入孔中前需先涡旋混匀，然后以50 µL等分试样，每孔设两个或三个复孔。
   6. 向每个NSB、B₀、标准品和样品孔中加入50 μL AChE示踪剂（图2）。
   7. 向每个B₀、标准品和样品孔中加入50 μL抗血清（图2）。
   8. 用盖板膜覆盖ELISA微孔板，于4 °C孵育18小时。
      注意：凡指示需涡旋的操作，务必执行，以确保结果一致。
4. 洗涤缓冲液的制备
   1. 向玻璃瓶中加入200 mL超纯水和500 µL 400倍浓缩洗涤缓冲液。
   2. 使用注射器向玻璃瓶中加入100 µL吐温-20（polysorbate 20）。
   3. 轻轻振摇瓶子以混匀。
      注意：洗涤缓冲液可在4 °C下保存最多2个月。若需用于完整的96孔微孔板，则将超纯水、400倍浓缩洗涤缓冲液和吐温-20的体积加倍。
   4. 使用前将洗涤缓冲液转移至洗瓶中。
5. Ellman试剂的制备
   注意：应在ELISA微孔板显色当天进行配制。
   1. 向避光容器中加入20 mL超纯水。
   2. 取部分超纯水溶解Ellman试剂。
   3. 将溶解后的Ellman试剂转移至避光容器中。
   4. 用Ellman试剂冲洗其原装瓶。
   5. 用移液器将全部溶液转移回避光容器中。
6. ELISA微孔板的洗涤
   1. 将ELISA微孔板倒置以弃去孔内液体，并将倒置的微孔板轻敲在纸巾上，确保各孔排空。
   2. 使用洗瓶向各孔中加入洗涤缓冲液。
   3. 轻轻振荡ELISA微孔板5秒，然后倾去洗涤缓冲液，并在纸巾上轻敲以去除残留液体。
   4. 再次用洗涤缓冲液充满ELISA微孔板，轻轻振荡30秒后倾去液体，重复此步骤共四次，每次倾倒后均需在纸巾上轻敲微孔板以去除残留液体。
      注意：充分洗涤ELISA微孔板，以避免吸光度读数不准确。
7. ELISA微孔板的显色与读数
   1. 将Ellman试剂转移至试剂槽中。
   2. 迅速使用多通道移液器向空白孔、NSB孔、B₀孔、TA孔、标准品孔和样品孔中各加入200 µL Ellman试剂。
   3. 向TA孔中加入5 μL AChE示踪剂。
   4. 用封口膜覆盖ELISA微孔板，置于避光容器中，在室温下振荡孵育60–90分钟。
      注意：以B₀孔作为判断合适孵育时间的指标。理想的B₀孔应明显呈黄色，但不过深。
   5. 移去封口膜，在412 nm波长下测定ELISA微孔板的光密度。
      注意：扣除空白孔后，B₀孔的吸光度在0.3 AU至1.0 AU之间，表明ELISA微孔板显色充分。
   6. 可选： 若显色不足，可重新覆盖封口膜，继续在避光容器中孵育一段时间；若显色过度，则弃去Ellman试剂，用洗涤缓冲液冲洗一次，再重新加入Ellman试剂进行显色。

图2：微孔板布局。竞争性ELISA实验中微孔板布局的示例。NSB表示非特异性结合孔。B₀表示最大结合孔。TA表示总活性孔。Std.表示标准品孔及其对应的编号。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 转换为浓度

1. 结合乙酰胆碱酯酶（AChE）示踪剂的计算
   1. 取两个空白孔吸光度的平均值，并从每个孔的吸光度中减去该平均值。
      注：后续所有计算均使用扣除空白后的吸光度值。
   2. 计算非特异性结合（NSB）、B₀ 和空白孔吸光度的平均值。
   3. 使用以下公式计算校正后的 B₀ 吸光度：
      
      注：Corr. 表示校正后，Abs. 表示吸光度，Avg. 表示平均值。若空白孔的平均吸光度（已扣除空白平均值）为负数，则在计算中使用零。
   4. 使用以下公式计算每个标准品和样品的 比值：
      
   5. 将每个样品的 比值乘以 100，计算出百分比 。
      注：百分比在 20% 至 80% 范围内的样品位于标准曲线范围内。
2. 标准曲线计算
   1. 计算每个标准品（1 至 8 号）重复孔的 比值的平均值。
   2. 使用以下公式计算每个标准品平均 比值的 logit 值：
      
   3. 以各标准品的已知浓度（表 1）作为 X 值，以其 logit 值作为 Y 值，计算斜率和 Y 轴截距。
   4. 以已知 cGMP 标准品浓度的 log₁₀ 作为 X 值，以其 logit 值作为 Y 值，计算决定系数。
      ​注：请确认决定系数接近 1。
3. 样品中 cGMP 浓度计算（单位：pmol/mL）
   1. 使用以下公式计算每个样品的 logit 值：
      
   2. 使用以下公式计算每个样品中 cGMP 的浓度（单位为每毫升样品中含有的 cGMP 皮摩尔数）：
      
      注：D.R. 表示稀释倍数。对于用盐酸以 1:5 稀释比例稀释的肝组织匀浆样品，其匀浆稀释倍数总和为 6。对于用 ELISA 缓冲液以 1:2 稀释比例稀释的肝组织样品，其缓冲液稀释倍数总和为 3。因此，括号内的项需乘以 18。
4. 样品中 cGMP 浓度计算（单位：nmol/g）
   1. 使用以下公式计算每孔中 cGMP 的纳摩尔数：
      
   2. 使用以下公式计算每个乙酰化样品中组织的克数：
      
      注：“mg of tissue”表示加入匀浆管中的组织质量（单位为毫克）。“volume of HCl used”表示用于样品匀浆稀释的 0.1 N 盐酸体积。
   3. 使用以下公式计算用 ELISA 缓冲液稀释的每个样品中组织的克数：
      
      注：“volume of sample diluted”表示被 ELISA 缓冲液稀释的样品体积。“250 μL”表示被乙酰化的样品体积。文中提到的“reagents”指乙酰化试剂 4 M KOH 和乙酸酐。
   4. 使用以下公式计算每孔中组织的克数：
      
      注：“volume of buffer”表示在将样品加入孔板前，用于稀释组织样品的 ELISA 缓冲液体积。
   5. 将每孔中 cGMP 的纳摩尔数除以每孔中组织的克数，计算 cGMP 浓度（单位：nmol/g）。

标准品编号	cGMP 浓度 (pmol/mL)
标准品 1	3.0
标准品 2	1.5
标准品 3	0.75
标准品 4	0.375
标准品 5	0.1875
标准品 6	0.09375
标准品 7	0.046875
标准品 8	0.0234375

表1：标准品浓度。 标准品1至8的已知浓度。

结果

连续五天每天一次在饲料中给予约克夏家猪氯化钠（0.15 mmol/kg）或¹⁵N标记的硝酸盐（0.15 mmol/kg）处理，随后在组织采集前用肝素钠（0.9%氯化钠）溶液进行灌注；所有采集细节此前已有发表¹⁹。按照所述ELISA方案，测定四只约克夏家猪臀肌和肝脏中的cGMP浓度。肝脏组织以0.1 N盐酸（HCl）按1:5稀释比例稀释，臀肌组织则按1:10稀释比例稀释，以沉淀蛋白质。HCl稀释后的匀浆样品经乙酰化处理后，再分别以1:2和1:3的稀释比例用ELISA缓冲液稀释肝组织和臀肌组织样品。cGMP浓度的测定方法如上所述。将吸光度值转换为每毫升制备样品中cGMP的皮摩尔数，再根据上述方案换算为每克组织中cGMP的纳摩尔数（nmol/g组织）。

在上述条件下，测得的肝组织中cGMP浓度获得了最佳的实验结果。猪肝组织中对照组和硝酸盐处理组的cGMP浓度分别为0.0202 nmol/g ± 0.003 nmol/g 组织和0.0364 nmol/g ± 0.011 nmol/g 组织（图3）。多个指标证实了结果的可靠性。扣除空白值后，B₀ 孔的吸光度范围为0.466至0.475，处于0.3 AU至1.0 AU范围内，表明使用Ellman试剂的微孔板显色充分。标准曲线质量较高，表现为从标准品1到标准品8的吸光度逐步递增，且标准曲线具有良好线性，其决定系数（R²）为0.99。每个检测孔的百分比（31.5%–71.2%）均处于20%–80%之间，表明所有样品均位于标准曲线的可靠范围内。具备上述特征的样品可用于结果分析。

在臀肌组织中测得的cGMP浓度导致实验结果不理想。由于臀肌样本孔的多数百分比值（3.69%–27.3%）低于20%，表明需要进一步稀释样本，才能使吸光度落在标准曲线范围内，因此将臀肌结果标记为“不理想”。猪臀肌组织中对照组和硝酸盐处理组的cGMP浓度分别为1.22 nmol/g ± 0.49 nmol/g组织和0.732 nmol/g ± 0.18 nmol/g组织（图未显示）。臀肌样本的吸光度与肝脏样本的B₀孔及标准品相同。使用此类不理想的样本可能导致错误结论，因此需要制备更稀释的样本，并重新测定cGMP浓度。

图3：肝脏组织中cGMP浓度。经氯化钠（0.15 mmol/kg）或¹⁵N标记的硝酸盐（0.15 mmol/kg）处理后猪肝脏中cGMP的平均浓度，单位为nmol/g组织。n = 4；误差线表示标准差；数据采用Welch's t检验进行分析；ns表示无显著性差异。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本实验方案提供了使用竞争性ELISA法测定固体组织中cGMP浓度所需步骤的操作说明。cGMP浓度的变化可反映组织中一氧化氮（NO）含量的差异。通过研究固体组织中的这些差异，可阐明不同器官中NO的相关信息。

在该实验方案中，组织样本首先被均质化以用于ELISA检测。该过程始于将一定质量的固体组织进行速冻，随后将其粉碎。在均质化步骤之前对组织进行破碎，旨在帮助珠磨均质器更有效地裂解细胞。组织在0.1 N盐酸中进行均质化，以沉淀蛋白质，该技术亦见于其他方法中。^20,21最后，将固体和沉淀物与可溶性组分分离 通过 离心。为制作标准曲线，将cGMP储备液（300 pmol cGMP/mL）进行系列稀释，得到八种不同浓度的标准品。标准品与样品均经过乙酰化处理，以提高检测灵敏度，最低可检测至0.1 pmol cGMP/mL。该灵敏度的提升源于乙酰基与cGMP形成共价键，从而增强抗血清中各抗体与乙酰化cGMP的结合能力。¹⁸乙酰化标准品和样品可确保各孔间cGMP结合的一致性。若预期微孔板各孔中cGMP浓度超过1.0 pmol/mL，则可省略标准品和样品的乙酰化步骤。¹⁸.

在将样品加入孔板之前，使用ELISA缓冲液对样品进行进一步稀释。额外的稀释使样品的信号落在标准曲线范围内，并使其成分更接近非特异性结合孔（NSB）、B₀孔和标准品孔中的内容，从而实现体系的一致性。除了样品和标准品外，还需在孔中加入其他几种溶液。在NSB孔中，加入ELISA缓冲液（含或不含乙酰化试剂），但不加抗血清，目的是测定乙酰胆碱酯酶标记物（与cGMP结合的乙酰胆碱酯酶）在缺乏抗血清中特异性抗体的情况下，与孔板表面附着的小鼠IgG结合的量。B₀孔中含有ELISA缓冲液（含乙酰化试剂）、AChE标记物和抗血清，因此B₀孔反映了在没有cGMP竞争时AChE标记物的结合能力。所有孔加样完成后，将微孔板进行孵育，随后洗涤。向各孔中加入Ellman试剂。最后，在加入Ellman试剂后，向TA孔中添加AChE标记物。该孔用于反映AChE标记物的催化活性，而不受抗体结合至微孔板上的标记物量的影响。微孔板在室温下显色，使AChE标记物催化显色反应。

实验方案中的多个步骤可能影响检测结果；为获得最佳结果，在执行以下步骤时需格外谨慎。在匀浆步骤以及乙酰化后，需确定每种组织类型的合适稀释倍数，以确保样品的检测值落在标准曲线范围内。配制标准品时，每次取样前或加入样品后，溶液均应充分涡旋振荡或混匀，以确保各标准品达到预期的cGMP浓度。在乙酰化步骤中，每个标准品和样品应以相同的时长进行涡旋振荡，以获得一致的吸光度读数。在将样品或标准品加入相应孔板前，也应立即进行涡旋振荡，以提高cGMP浓度测定的准确性。充分洗涤微孔板有助于提高吸光度值的准确性，因为它可彻底去除孔中未结合的乙酰胆碱酯酶示踪物。加入Ellman试剂后，应给予足够时间让微孔板显色，并注意观察颜色变化，尤其是B₀孔的吸光度值。需要注意的是，cGMP浓度较低的样品在复孔或三复孔之间的浓度差异可能大于高浓度样品。检测更高浓度的样品可能有助于缓解此问题。此外，为消除不同微孔板之间的差异，相同组织类型的样品应尽可能在同一块板上进行检测。遵循上述建议可提高检测数据的质量。

上述方案可推广至其他柔软的实体组织。进一步优化本方案中的组织制备部分，可能获得适用于处理硬组织（包括骨骼）的方法，后者因其血管化特性而具有研究价值。该技术的持续发展有望建立一种适用于多种实体组织中cGMP浓度测定的方法，从而为获取几乎任何组织中一氧化氮（NO）丰度的额外信息提供有力工具。尽管上述竞争性ELISA方案是测定cGMP浓度并估算NO丰度的有效技术，但仍存在两个显著局限性：（1）该检测无法区分由可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）和颗粒型鸟苷酸环化酶（pGC）合成的cGMP。利钠肽可激活pGC活性²²，因此通过该通路引起的cGMP变化并不反映NO丰度的变化；（2）此外，磷酸二酯酶（PDE）的活性会影响ELISA检测结果。多种PDE可水解cGMP，从而在NO激活sGC后降低其浓度²³。因此，PDE的催化活性可能掩盖cGMP浓度与NO丰度之间的关联。对于主要旨在获取精确cGMP浓度而非仅观察其变化趋势的实验，建议添加PDE5抑制剂（如西地那非）以防止cGMP降解。可在样本采集前约1小时向动物给予西地那非（药效可持续达4小时²⁴）；若无法实现体内给药，也可将西地那非直接加入采集后的样本中。若在组织采集后抑制PDE活性，应将西地那非加入0.1 N盐酸溶液中，使组织在含有西地那非的条件下进行匀浆。需同时检测加与不加西地那非的样本，以确保动物处理与西地那非之间无交叉干扰。

尽管存在局限性，该检测方法仍被用于深入了解一氧化氮信号的下游传递过程。总之，将固体组织中cGMP浓度的测定与其他一氧化氮检测方法相结合，有助于更全面地理解一氧化氮在器官中的作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL BD 透明口服注射器	Becton Dickinson	50382903052177
14 mL 圆底试管	Falcon	352059
2.0 ml 微量离心管，多种规格	Olympus Plastics	24-283A
30–300 µL 多通道移液器	Eppendorf	3125000052
乙酸酐（cGMP 试剂盒内）	Cayman Chemical Company	400031	98% 纯度 危险：易燃，腐蚀性：严重灼伤皮肤，造成眼部损伤，急性毒性 安全操作：远离点火源，在通风区域操作，佩戴手套
cGMP 乙酰胆碱酯酶示踪剂（cGMP 试剂盒内）	Cayman Chemical Company	481020	磷酸氢二钾，氯化钠，  磷酸二氢钾，牛血清白蛋白，叠氮化钠，EDTA，cGMP AChE 示踪剂 危险：健康危害：反复暴露可导致器官毒性， 腐蚀性：眼部损伤， 皮肤和呼吸道刺激物 安全操作：在通风区域操作，佩戴手套
cGMP ELISA 抗血清（cGMP 试剂盒内）	Cayman Chemical Company	481022	磷酸氢二钾，氯化钠，  磷酸二氢钾，牛血清白蛋白，  叠氮化钠，EDTA，兔抗-cGMP 多克隆抗血清 危险：健康危害：反复暴露可导致器官毒性， 腐蚀性：眼部损伤， 皮肤和呼吸道刺激物，急性毒性 安全操作：在通风区域操作，佩戴手套
cGMP ELISA 标准品（cGMP 试剂盒内）	Cayman Chemical Company	481024	磷酸氢二钾，氯化钠，  磷酸二氢钾，牛血清白蛋白，  叠氮化钠，EDTA，cGMP 标准品 危险：健康危害：反复暴露可导致器官毒性， 腐蚀性：眼部损伤， 皮肤和呼吸道刺激物 安全操作：在通风区域操作，佩戴手套
环磷酸鸟苷（cGMP）ELISA 试剂盒	Cayman Chemical Company	581021
ELISA 缓冲液浓缩液 10X（cGMP 试剂盒内）	Cayman Chemical Company	400060	1 M 磷酸盐，1% BSA，4 M 氯化钠，10 mM EDTA，0.1% 叠氮化钠 危险：健康危害：反复暴露可导致器官毒性， 腐蚀性：眼部损伤， 皮肤和呼吸道刺激物 安全操作：在通风区域操作，储存于带可关闭盖子的容器中，佩戴手套
ELISA 试剂储液槽	Pierce（现为 Thermo Fisher Scientific）	15075
Ellman 试剂（cGMP 试剂盒内）	Cayman Chemical Company	400050	磷酸氢二钾，氯化钠，磷酸二氢钾，乙酰硫代胆碱（碘化物），5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸) 危险：急性毒性，健康危害：器官毒性，腐蚀性：眼部损伤，皮肤刺激物，呼吸道刺激物 安全操作：在通风区域操作，佩戴手套
盐酸	Sigma-Aldrich	320331	危险：腐蚀性：腐蚀金属，严重灼伤皮肤，眼部损伤，呼吸道刺激物 安全操作：在通风区域操作，佩戴手套
液氮	Robert's Oxygen		氮气 危险：压缩气体：存在低温灼伤、冻伤和窒息风险 安全操作：在通风区域操作，佩戴手套
小鼠抗兔 IgG 包被板（cGMP 试剂盒内）	Cayman Chemical Company	400006	危险：无
New Classic MF 天平	Mettler Toledo
轨道摇床	Stovall Life Science Inc.（现为 IBI Scientific）	15-453-211（因型号而异）
Parafilm 封口膜	Bemis Company, Inc.	3023-4526（因型号而异）
聚山梨酯 20（cGMP 试剂盒内）	Cayman Chemical Company	400035	危险：无
氢氧化钾（cGMP 试剂盒内）	Cayman Chemical Company	400029	85% 纯度 危险：腐蚀性：腐蚀金属和皮肤， 眼部损伤，急性毒性 安全操作：在通风区域操作，佩戴手套
Precellys Evolution 匀浆仪	Bertin Technologies	PE000062-PEVO0-A
Precellys 组织裂解试剂盒（硬组织匀浆）	Bertin Technologies	P000911-LYSK0-A
Sense 微孔板读板仪	HIDEX	425-301
Sorvall Legend Micro 17R 离心机	Thermo Fisher Scientific	75002441
组织研磨器	Cellcrusher	Cellcrusher 试剂盒
Vortex Genie 2 涡旋振荡器	Scientific Industries	SI-0246
洗瓶	Sigma-Aldrich	Z423092
洗涤缓冲液浓缩液 400X（cGMP 试剂盒内）	Cayman Chemical Company	400062	磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，水 危险：腐蚀性：眼部损伤，急性毒性，皮肤刺激物，器官毒性 安全操作：在通风区域操作，佩戴手套