本文介绍了一种通过在可控且氧浓度可变的环境中分娩，以在新生小鼠中诱导缺氧的实验方案。出生时经历氧浓度变化的小鼠模型，其参与诱导自闭症等行为表型改变的miRNA表达水平发生了持久性变化。
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本文内容
摘要
摘要
围产期由于不同原因可能导致不同程度的缺氧，从而影响发育。本研究旨在探讨小鼠新生儿期轻度至重度缺氧的后果，重点关注其与自闭症谱系障碍（ASD）相关的神经退行性胎儿脑功能障碍之间的潜在联系。
我们通过在不同氧浓度的可控环境中培育新生小鼠来诱导其缺氧。结果显示，缺氧小鼠大脑皮层和海马体中HIF-1α（缺氧标志物）水平升高，且这些区域的神经退行性变增加。此外，我们观察到缺氧组中与自闭症谱系障碍（ASD）相关的miRNA表达发生改变（包括miR-19a-3p、miR-361-5p、miR-150-5p、miR-126-3p和miR-499a-5p），这与既往在人类及动物ASD模型中的研究结果一致。这些分子改变伴随有行为学变化，例如活动量减少、运动速度下降、社交互动减少以及重复性行为增加，同时在经历缺氧条件的小鼠中还表现出更强的趋角行为倾向。尽管在12% O2组（轻度缺氧）中已可检测到行为和分子层面的变化，但更显著的变化出现在更严重的缺氧组，即10% O2和8% O2组。
总体而言，研究结果表明，新生儿缺氧可引发与神经退行性疾病相关的持久性分子改变，并导致行为后果。此外，即使在正常分娩情况下，早期发育阶段暴露于缺氧环境也可能损害记忆和学习能力。这些结果凸显了对暴露于缺氧的新生儿进行早期检测和干预的必要性，以预防长期的神经系统问题。miRNA 的水平在发育过程中受到调控，其在组织中（尤其是在生殖细胞中）的改变构成了对下一代的风险因素。这些分析为研究缺氧条件下影响功能和行为变化的调控通路提供了基础。
引言
缺氧被定义为一种氧气缺乏的状态，可引发独特的细胞和分子反应，这些反应对于理解其在多种病理过程中的作用至关重要。缺氧会扰乱发育过程，导致分子、细胞和神经元层面的改变与损伤。此外，早期暴露于缺氧环境会干扰中枢神经系统（CNS）的发育，损害轴突连接和突触形成1。
此外，尽管低氧已被证明对中枢神经系统（CNS）的发育具有不利影响，但在特定条件下（如胚胎发生期间），它也可能发挥重要的生理作用。生理性低氧是指在胚胎发育过程中，氧水平自然处于较低状态，且这种状态对发育有益。该过程可通过促进无氧代谢使胚胎细胞产生能量，通过加速血管生成支持循环系统的发育，确保心脏和骨骼的正常发育，并刺激神经嵴细胞的迁移2。相反，若低氧发生在其生理环境之外，则可能对发育和整体健康产生不利影响，包括胚胎发育异常，可能导致早产甚至胚胎致死1。因此，低氧是一个重要的公共卫生问题，因为在正常分娩过程中，许多新生儿都会经历低氧状态，而护理人员或医务人员往往未能及时察觉3。此外，与低氧相关的神经元连接改变还与神经发育障碍相关，包括自闭症谱系障碍（ASD）和智力障碍1。
从分子角度来看，缺氧可通过改变调控突触功能的基因表达，影响神经发....
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方案
所有实验方案均经埃尔吉耶斯大学地方动物实验伦理委员会（HAYDEK）批准，并在许可证号21/216下进行。
1. 实验动物
注意：本研究涉及来自埃爾西耶斯大學貝圖爾-齊亞·埃倫基因與幹細胞中心（GENKÖK）轉基因單元的 Balb/c 小鼠。
- 使用2月龄、平均体重为18–25 g的Balb/c小鼠。将小鼠饲养在温度为20 ± 2°C、湿度为52 ± 3%、12小时光照/12小时黑暗循环（6:00–18:00）的环境中。
- 给予小鼠标准鼠粮喂养，每周更换垫料，并提供自由摄食和饮水。
注意：分子学研究在GENKÖK的基因组学与低氧实验室以及博佐克大学组织学与胚胎学实验室进行。“STOP点”表示可在指定温度下暂停并保存实验工作的节点。
2. 缺氧模型的建立
- 设计实验，包括4个组，分别为3个缺氧组和1个假手术对照组。
- 将健康的雌性小鼠与健康的雄性小鼠交配，获得健康的妊娠雌鼠，最终将其分为以下各组：重度缺氧（8% O2）（n = 4）、中度缺氧（10% O2） （n = 4）、轻度缺氧（12% O2）（n....
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结果
在本研究中，怀孕的Balb/c小鼠在分娩期间暴露于8% O2（重度）、10% O2（中度）和12% O2（轻度）的低氧环境中，并在出生后继续维持相应的低氧条件5分钟，以建立轻度、中度和重度新生儿低氧模型。假手术对照组小鼠则在常氧（21% O2）条件下分娩，随后在标准饲养条件下饲养。这有助于分离不同氧浓度对小鼠的真实影响，确保实验结果的有效性。
建立新生小鼠缺氧模型后，处死一组新生小鼠进行免疫组织化学染色（HIF1α 和 H&E 染色），以检测缺氧暴露对新生小鼠脑组织的影响。对剩余小鼠在2月龄时进行行为学测试。行为学测试完成后，处死小鼠并进行全脑组织病理学评估，检测海马组织和血液样本中 miR-19a-3p、miR-361-5p、miR-150-5p、miR-126-3p 和 miR-499a-5p 的表达谱。
免疫组织化学分析显示，在缺氧条件下，新生脑组织中HIF1-α的表达水平升高
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讨论
围产期缺氧是一种主要的新生儿健康问题，可通过干扰关键的发育过程，导致分子、细胞和神经元层面的改变，并与多种神经发育障碍相关，包括自闭症谱系障碍（ASD）1。尽管重度缺氧的即时效应已被广泛研究，但围产期轻度至中度缺氧的长期后果仍知之甚少。本研究旨在填补这一空白，通过考察新生儿缺氧后的神经行为学和分子学结局，揭示了这两个领域中的显著改变。为实现这一目标，我们建立了一种多层次的小鼠新生儿缺氧模型，并进行了全面的组织病理学、行为学和分子学分析。该实验方案旨在模拟临床环境中常见的轻度至中度缺氧事件，这类事件致死性较低，但仍可引发持久的影响。
本方案中的关键步骤是通过在分娩期间将怀孕小鼠暴露于特定的低氧环境中，以诱导产前/产后低氧，随后对部分新生小鼠额外进行5分钟的低氧暴露。该方法使我们能够系统地研究不同程度的低氧及其对神经发育的影响，同时优化暴露时机，以在保证存活率的前提下获得可测量的分子和行为学效应。对新生小鼠脑组织的组织病理学检查包括缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）的免疫组织化学染色，以确认低氧诱导及细胞应激反应。在小鼠2月龄时进行的行为.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由土耳其科学技术研究理事会（TÜBİTAK）资助，作者感谢塞拉莱廷·戈克塔什（转基因动物设施）和生物学家塞尔达·塔什德米尔（行为学实验室）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (-20 °C) 冰箱 | Siemens | KD86NAWE0N | |
| (+4 °C) 冷却块 | Antagen Bioscience | https://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/ | |
| (+4 °C) 冰柜 | Siemens | KD86NAWE0N | |
| (-20 °C) 冷却块 | Cleaver Sientific | https://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/ | |
| 无水乙醇 | Merck | 1070172511 | |
| 乙酸铵 | Sigma | 238074-500G | |
| 分析天平 | Adam Equipment | LAB214i | |
| 氯仿 | Merck | 1024451000 | |
| 柠檬酸 | Merck | 100241 | |
| 计算机 | HP | https://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1 | |
| EDTA | Sigma | E9884-1KG | |
| Entellan | Merck | 107961 | |
| 伊红 | Merck | 109844 | |
| Eppendorf 管 (1.5 mL) | ?solab | 078.03.021 | |
| Ethovision 系统 | Noldus | https://noldus.com/ethovision-xt | |
| 恒温干燥箱 | NUVE | EN 400/500 N/A | |
| Falcon 管 (15 mL) | Isolab | 078.02.001 | |
| 甲醛 | Merck | 104002 | |
| 热成像相机 | Samsung | SC2000 | |
| 苏木精 | Merck | 105175 | |
| HIF-1α 抗体 | Bioss | bs-20398R | |
| 缺氧培养舱 | Biospherix | A-Chamber | |
| 异丙醇 | Merck | 1096342511 | |
| Light Cycler 480 II | Roche | 5015278001 | |
| 大理石埋藏实验笼 | Vishnu | https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel | |
| 微量离心管 (1.5 mL) | Greiner | 616201 | |
| 移液器吸头 (100 µL) | Greiner | 774353 | |
| 移液器吸头 (1000 µL) | Greiner | 778353 | |
| 移液器 (10 µL) | Gilson | FD10001 | |
| 移液器 (100 µL) | Gilson | FD10004 | |
| 移液器 (1000 µL) | Gilson | FD10003 | |
| 移液器吸头 (10 µL) | Greiner | 772353 | |
| 移液器 (2 µL) | Gilson | GFAM00064 | |
| 显微镜 | Olympus | Bx53 | |
| miRCURY LNA RT 试剂盒 (cDNA 合成试剂盒) | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR 试剂盒 | Qiagen | 339346 | |
| 多孔板 | Roche | 4729692001 | |
| 纳米分光光度计 | Shimadzu | C101-E112 | |
| 新物体识别实验装置 | Global Biotech | 137 | |
| 旷场实验装置 | Global Biotech | 117 | |
| Oxycycler | Biospherix | A42OC | |
| 石蜡 | Leica | 39602012 | |
| PBS 片剂 | Sigma | P4417-50TAB | |
| PCR 仪 | Sensoquest | T3-0140 | |
| 板式离心机 | Peqlab | 91-PSPIN-P | |
| Prism | GraphPad | https://www.graphpad.com/ | |
| 蛋白酶 K | Sigma | P6556-10MG | |
| QIAzol 裂解试剂 | Qiagen | 79306 | |
| SDS | Sigma | 8170342500 | |
| 二抗 | Abcam | A0545-1ML | |
| 社交互动实验三室装置 | Global Biotech | 118 | |
| 离心机 | Gilson | PMC880 | |
| 注射器 (2 mL) | Baybi | https://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler | |
| 尾悬吊实验装置 | 自制，可在 Harvard Apparatus 找到类似产品 | 自制，可在 (https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html) 找到类似产品 | |
| 恒温混匀仪 | Eppendorf | #5355 | |
| Trizma 碱 | Sigma | 1503-1KG | |
| 涡旋振荡器 | Heidolph | 541-10000-00-1 | |
| 二甲苯 | Isolab | 9,90,01,92,501 |
参考文献
- Bonkowsky, J. L., Son, J. -H. Hypoxia and connectivity in the developing vertebrate nervous system. Dis Model Mech. 11 (12), dmm037127(2018).
- Dunwoodie, S. L. The role of hypoxia in development of the mammalian embryo. Dev Cell. 17 (6), 755-773 (2009).
- B....
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