本文介绍了一种通过在可控且氧浓度可变的环境中分娩，以在新生小鼠中诱导缺氧的实验方案。出生时经历氧浓度变化的小鼠模型，其参与诱导自闭症等行为表型改变的miRNA表达水平发生了持久性变化。
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摘要
摘要
围产期由于不同原因可能导致不同程度的缺氧，从而影响发育。本研究旨在探讨小鼠新生儿期轻度至重度缺氧的后果，重点关注其与自闭症谱系障碍（ASD）相关的神经退行性胎儿脑功能障碍之间的潜在联系。
我们通过在不同氧浓度的可控环境中培育新生小鼠来诱导其缺氧。结果显示，缺氧小鼠大脑皮层和海马体中HIF-1α（缺氧标志物）水平升高，且这些区域的神经退行性变增加。此外，我们观察到缺氧组中与自闭症谱系障碍（ASD）相关的miRNA表达发生改变（包括miR-19a-3p、miR-361-5p、miR-150-5p、miR-126-3p和miR-499a-5p），这与既往在人类及动物ASD模型中的研究结果一致。这些分子改变伴随有行为学变化，例如活动量减少、运动速度下降、社交互动减少以及重复性行为增加，同时在经历缺氧条件的小鼠中还表现出更强的趋角行为倾向。尽管在12% O2组（轻度缺氧）中已可检测到行为和分子层面的变化，但更显著的变化出现在更严重的缺氧组，即10% O2和8% O2组。
总体而言，研究结果表明，新生儿缺氧可引发与神经退行性疾病相关的持久性分子改变，并导致行为后果。此外，即使在正常分娩情况下，早期发育阶段暴露于缺氧环境也可能损害记忆和学习能力。这些结果凸显了对暴露于缺氧的新生儿进行早期检测和干预的必要性，以预防长期的神经系统问题。miRNA 的水平在发育过程中受到调控，其在组织中（尤其是在生殖细胞中）的改变构成了对下一代的风险因素。这些分析为研究缺氧条件下影响功能和行为变化的调控通路提供了基础。
引言
缺氧被定义为一种氧气缺乏的状态，可引发独特的细胞和分子反应，这些反应对于理解其在多种病理过程中的作用至关重要。缺氧会扰乱发育过程，导致分子、细胞和神经元层面的改变与损伤。此外，早期暴露于缺氧环境会干扰中枢神经系统（CNS）的发育，损害轴突连接和突触形成1。
此外，尽管低氧已被证明对中枢神经系统（CNS）的发育具有不利影响，但在特定条件下（如胚胎发生期间），它也可能发挥重要的生理作用。生理性低氧是指在胚胎发育过程中，氧水平自然处于较低状态，且这种状态对发育有益。该过程可通过促进无氧代谢使胚胎细胞产生能量，通过加速血管生成支持循环系统的发育，确保心脏和骨骼的正常发育，并刺激神经嵴细胞的迁移2。相反，若低氧发生在其生理环境之外，则可能对发育和整体健康产生不利影响，包括胚胎发育异常，可能导致早产甚至胚胎致死1。因此，低氧是一个重要的公共卫生问题，因为在正常分娩过程中，许多新生儿都会经历低氧状态，而护理人员或医务人员往往未能及时察觉3。此外，与低氧相关的神经元连接改变还与神经发育障碍相关，包括自闭症谱系障碍（ASD）和智力障碍1。
从分子角度来看，缺氧可通过改变调控突触功能的基因表达，影响神经发育，从而破坏神经元连接，并促进神经发育障碍的发生4。
临床上，新生儿缺氧通过激素和代谢途径影响中枢神经系统（CNS）的发育1。在急性缺氧发生时，下丘脑迅速释放促肾上腺皮质激素释放激素和精氨酸加压素，进而促使腺垂体释放促肾上腺皮质激素，随后激活胎儿肾上腺皮质产生糖皮质激素，其反应程度与缺氧的强度和持续时间相关。下丘脑-垂体-肾上腺 （HPA）轴对急性应激的这一快速反应，凸显了糖皮质激素在调控相关基因表达、蛋白质合成和细胞代谢过程中，限制应激生理影响并维持胎儿内环境稳态的关键作用5,6。
正常氧水平降低会激活多种缺氧应答反应，其中大多数反应由转录因子缺氧诱导因子（Hypoxia-Inducible Factors, HIFs）和细胞氧传感器（如脯氨酰羟化酶，prolyl hydroxylases, PHDs）调控1。HIF-1 是 O2 稳态的调节因子，体外（in vitro）研究表明其由 HIF-1α 和 HIF-1β 两个亚基组成的异源二聚体78。在缺氧条件下，复合物中氢原子被羟基取代的反应减弱，导致 HIF-1α 积累，并与 HIF-1β 形成二聚体。随后，HIF-1 二聚体转位至细胞核，激活数百个基因的转录1。
神经元对氧气的依赖性使其特别容易受到缺氧应激的影响。因此，缺氧可通过损害轴突导向和突触发育，对脑生理功能产生显著影响，并对神经元功能造成长期后果9。这些神经元连接的改变可能增加多种神经发育障碍的风险，例如自闭症谱系障碍（ASDs）和智力障碍9,10。
围产期窒息是指在分娩过程中发生的缺氧，可由多种围产期事件引起，例如母胎出血、脐带受压、胎盘并发症、子宫破裂、肩难产或新生儿未能成功进行首次呼吸。这一严重事件每年在全球范围内影响约四百万新生儿，并导致一百万例新生儿死亡11,12,13。尽管大多数婴儿能够存活于缺氧事件，但部分患儿会发展为缺氧缺血性脑病，进而引发永久性神经系统问题，如癫痫发作障碍、脑性瘫痪、认知发育迟缓和运动功能缺陷。此外，窒息和缺血还可能导致多个器官和系统功能障碍，包括中枢神经系统（28%）、心血管系统（25%）、肾脏（50%）和肺脏（23%）11。
此外，脑血管系统的不成熟以及自主调节功能较差是导致新生儿易发生缺血风险的因素。在这些过程中，炎症和氧化应激是新生儿缺氧缺血性损伤及相关细胞死亡机制的主要介质。异常的细胞凋亡可能使发育中的大脑面临运动和认知功能障碍的风险14。
鉴于自闭症谱系障碍（ASD）的复杂性，有必要了解其潜在的遗传基础，这些遗传基础似乎具有多基因结构，以及决定其发展的环境因素。特别是，ASD的多基因基础提示其病因是多因素的，即遗传易感性与包括缺氧在内的外部因素相互作用。同卵双胞胎中观察到的60%–92%的同病率凸显了遗传因素的重要性，而异病率则表明环境因素也发挥作用。自闭症的患病率估计为13/10,000，且近年来这一比率被认为有所上升15。研究支持孕期暴露于环境因素可能增加自闭症风险的假说，但由于诊断标准、对照组、样本量和暴露评估方法的不同，这些研究的结果常常不一致15,16。
尽管独特的神经病理学发现尚不明确，但研究揭示了大脑存在微观和功能异常。这些异常提示，与病因相关的关键时期可能是在宫内，且发病过程可能始于产前阶段15。妊娠期间的暴露是关于自闭症潜在危险因素的流行病学研究的主要关注点。特别是，产科并发症可能增加自闭症谱系障碍（ASD）风险的假设已得到许多研究的支持，但这些影响的程度和后果在不同研究之间存在差异17。
除了遗传因素外，表观遗传机制在缺氧条件下调控基因表达中也起着关键作用。值得注意的是，miRNA 在细胞对缺氧的响应中是一种重要的调控机制，例如其对 HIF 的影响。在缺氧早期阶段，miRNA 水平的特定变化可促进 HIF-1 的积累，并维持 HIF-2 和 HIF-3 水平的稳定18。尽管在缺氧和缺血条件下许多 miRNA 的表达谱均发生改变，但仅有少数缺氧相关 miRNA 被证实具有功能作用并影响 HIF 的表达。这解释了为何不同的人体组织由于 miRNA 表达具有组织特异性，因而对缺氧的响应存在差异18。
新兴数据还表明，特定的miRNA与自闭症谱系障碍（ASD）的病理机制有关。在我们之前的研究中，我们发现miR-19a-3p、miR-361-5p、miR-150-5p、miR-126-3p和miR-499a-5p（这些miRNA已知在癌症中调控细胞存活、分化和应激反应）在ASD患者中表现出异常表达，可能影响神经发育结局。随后，我们在ASD小鼠模型的血液、下丘脑和精子样本中验证了这些结果，显示出基因调控变化与该疾病之间存在一致的关联19。这些结果表明，这些miRNA在生长和发育关键阶段的下调可能对ASD等疾病的发展产生显著影响。这进一步证明了新生儿缺氧对分子和行为特征的深远影响。
在本研究中，我们检测了轻度至中度新生儿缺氧对成年后患自闭症风险的影响。为此，我们让新生小鼠暴露于不同水平的缺氧环境中。结果表明，出生时经历缺氧的小鼠在成年后表现出行为改变，更重要的是，在分子水平上呈现出与自闭症谱系障碍（ASD）相关的异常。因此，我们的研究结果为缺氧的长期影响提供了有价值的信息。
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方案
所有实验方案均经埃尔吉耶斯大学地方动物实验伦理委员会（HAYDEK）批准，并在许可证号21/216下进行。
1. 实验动物
注意：本研究涉及来自埃爾西耶斯大學貝圖爾-齊亞·埃倫基因與幹細胞中心（GENKÖK）轉基因單元的 Balb/c 小鼠。
- 使用2月龄、平均体重为18–25 g的Balb/c小鼠。将小鼠饲养在温度为20 ± 2°C、湿度为52 ± 3%、12小时光照/12小时黑暗循环（6:00–18:00）的环境中。
- 给予小鼠标准鼠粮喂养，每周更换垫料，并提供自由摄食和饮水。
注意：分子学研究在GENKÖK的基因组学与低氧实验室以及博佐克大学组织学与胚胎学实验室进行。“STOP点”表示可在指定温度下暂停并保存实验工作的节点。
2. 缺氧模型的建立
- 设计实验，包括4个组，分别为3个缺氧组和1个假手术对照组。
- 将健康的雌性小鼠与健康的雄性小鼠交配，获得健康的妊娠雌鼠，最终将其分为以下各组：重度缺氧（8% O2）（n = 4）、中度缺氧（10% O2） （n = 4）、轻度缺氧（12% O2）（n = 4）以及常氧（21% O2） 作为假手术对照组（n = 4）。
- 为诱导缺氧，将妊娠小鼠转移至缺氧实验室，并在E21.5日之前72小时开始进行监测。
- 检测缺氧组妊娠小鼠的分娩时间点，并在分娩后立即将其放入缺氧舱中。根据各组设定（见步骤2.2）调节每个缺氧舱中的氧气浓度。
- 仅将新生小鼠置于缺氧环境中5分钟，随后立即转移至正常饲养条件。
注意：若将受试对象置于缺氧环境中的时间更长，可能导致死亡。 - 从每组中随机选取2只新生小鼠，用于确认缺氧诱导的损伤并确定性别。其余仔鼠在哺乳期间继续与其母鼠共同饲养，直至哺乳期结束，以便在成年阶段进行进一步的分子和行为学检测（实验设计见补充图1）。
3. 性别鉴定以评估缺氧对新生期不同性别的潜在影响差异
- 分别称量每只小鼠（每组随机选取两只）的体重，以计算所需麻醉剂剂量。腹腔注射给予每公斤体重100 mg的氯胺酮和每公斤体重10 mg的赛拉嗪。
- 小鼠完全麻醉后，立即通过颈椎脱位实施安乐死，并迅速采集尾部组织置于无菌、已标记的1.5 mL离心管中（可暂停点，-80 °C保存） °C)
- 立即收集所有脑组织并转移至含有10%甲醛的离心管中，用于后续分析（一个暂停点，25 °C）。
- 准备组织以进行DNA提取。
- 准备尾部样本并在25℃下解冻 °C（如有必要）。加入300 µ含 1 M Tris、0.5 M EDTA、4% SDS 的裂解缓冲液 L，dH₂O2O2 和蛋白酶K加入样品中。
- 匀浆处理样品。
- 通过涡旋充分混匀样品，并在55℃下孵育过夜 °C.
- 第二天，加入100 µL 乙酸铵，涡旋混匀片刻。在 12,000 g 20分钟，25 °C
- 进行相分离。
- 小心地将澄清的水相转移至新的无菌、已标记的1.5 mL离心管中。
- 加入500 µL 的异丙醇，25℃孵育 5 分钟 °C（一个停止点，-20 °C). 以 12,000 离心 g 10 分钟，25 °C
- 洗涤DNA沉淀。
- 检查管底沉淀物后，小心弃去上清液。
- 加入1000 µL 的 70% 乙醇，轻轻敲击离心管使沉淀悬浮。在 7500 g 在25℃下持续10分钟 °C
- 纯化DNA。
- 检查管底沉淀物后，小心弃去上清液。
- 使用10 µ使用L型微量移液器去除残留乙醇，并使其完全干燥。
- 加入100 µL 无核酸酶水（NFW）重悬沉淀。4 °C孵育 °C，10-15 分钟。
- 定量并储存DNA。
- 使用分光光度计测定DNA浓度。将DNA样本储存在+4℃ °C，直至进一步使用。（一个暂停点）。
- 进行聚合酶链式反应（PCR）。
- 实验设计 SRY-F, SRY-R 和间接的 PAX6-F PAX6-R 引物（参见 补充表1).
- 按如下方法配制PCR反应液（每份样品）：5 µL 的 PCR 缓冲液（10x），4 µL of MgCl2, 4 µL 的 dNTPs，0.5 µ四种引物各31 L µL of dH2O 和 0.5 µL 的 Taq 聚合酶。
注意：Taq聚合酶应在使用前最后加入，以确保最佳扩增效果。 - 准备标记好的 PCR 管，并将其置于 +4 °C 冷却架。分配 45 µ将混合液 L 加入试管中。
- 轻轻敲击反应板，确保PCR混合液液滴位于管底。
- 加入5 µ加入 DNA 样本并用移液器轻轻吹打。短暂涡旋振荡，然后离心管子。
- 将试管放入PCR仪中，并将程序设置为以下条件：首先在95℃孵育 °C 下 5 分钟，40 个循环的变性在 94 °C，退火 57 °C，45 秒；72 ℃延伸 °C，持续1分钟。循环结束后，在72℃进行最终延伸 °C，10 分钟，随后在 40 °C 无限期。
- 使用2%琼脂糖凝胶电泳对结果样本进行可视化。
注意：显示两条条带的样本为雄性，仅显示一条条带的样本为雌性。
4. 新生小鼠缺氧损伤的确认
- 通过显微镜评估处死小鼠后采集的脑组织，以确认缺氧损伤，并通过免疫组织化学方法检测HIF-1α。
- 固定组织并进行石蜡包埋。
- 将组织在甲醛中保存12小时，然后用水洗涤6小时。
- 通过系列乙醇脱水固定组织，每种浓度（70%、80%、90%）各1天，随后在100%乙醇中处理3小时。将组织置于二甲苯中15分钟以透明化。
- 将组织依次转移至石蜡I、II、III中，每步1小时。第三小时结束后，正确摆放脑样本方向，并将其包埋于洁净石蜡中。
- 使用旋转式切片机从石蜡块中切下5 µm厚的切片。
- 制备载玻片。
- 进行苏木精-伊红（HE）染色时，将切片置于普通玻璃载玻片上。
- 进行免疫组织化学染色时，将切片置于带正电荷的玻璃载玻片上。
注：（可暂停点），此阶段可将载玻片存档，以备后续评估和操作。
- 进行HE染色。
- 将样本浸入二甲苯I溶液中10分钟。
- 将样本再浸入二甲苯II溶液中10分钟。
- 将样本依次转移至浓度递减的酒精溶液中，每种浓度1分钟：100%、96%、80%。
- 用蒸馏水洗涤样本2分钟。
- 将样本浸入苏木精溶液中8分钟，然后用蒸馏水洗涤2分钟。
- 洗涤后，用酸性酒精处理样本1秒，随后进行1分钟洗涤。
- 将样本置于氨水中10秒，然后重复1分钟洗涤。
- 将样本置于70%酒精中30秒。
- 将样本浸入伊红溶液中10分钟。
- 逐步将样本转移至浓度递增的酒精溶液中，每种浓度1分钟：96%、96%、100%。
- 将样本依次浸入二甲苯I、II、III溶液中，每种1分钟。
- 加盖盖玻片。
- 使用显微镜观察。
- HE染色后，在光学显微镜下观察各组小鼠的全脑组织。
- 评估海马区和皮质区的神经元变性及细胞周围/血管周围水肿情况。
- 固定组织并进行石蜡包埋。
- 进行HIF-1α染色。
- 将样本置于带正电荷的载玻片上，在67 °C孵育箱中孵育过夜，以确保充分固定。
- 将切片依次通过二甲苯I和二甲苯II溶液，完成脱蜡。
- 将切片依次置于100%、96%、80%和70%乙醇溶液中，每种5分钟，随后用蒸馏水冲洗5分钟，以完成再水化。
- 将切片置于0.01 M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中，以665 W微波处理两个5分钟循环，以暴露抗原表位。
- 在室温（RT）下冷却切片20分钟。
- 使用疏水笔标记切片边缘，然后用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。
- 将切片在含3%过氧化氢的甲醇溶液中孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。
- 再次用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。
- 为防止非特异性免疫球蛋白结合，将切片与防UV试剂孵育7分钟。
- 将切片与抗HIF-1α一抗（1:200稀释）在4 °C孵育过夜。
- 用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。
- 向切片加入生物素标记的二抗，在室温下孵育40分钟。
- 再次用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。
- 向切片加入链霉亲和素溶液，在室温下孵育30分钟。
- 用PBS洗涤切片3次，每次5分钟。
- 加入3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色，同时在光学显微镜下观察反应进程。
- 使用改良Gill II苏木精溶液对切片进行复染，以染色细胞核。
- 通过梯度乙醇（70%、80%、96%、100%）脱水处理切片。
- 将切片在二甲苯I和二甲苯II溶液中各孵育10分钟，以透明化。
- 使用封片剂和盖玻片封片。
- 在光学显微镜下观察封片后的切片，评估海马区和前额叶皮质区域。
- 使用开源图像处理软件测量免疫反应水平。
5. 行为学实验
- 确认缺氧后，让剩余的小鼠继续与母鼠完成哺乳期。
- 在出生后第21天根据肛殖距进行性别鉴定，并按性别将动物分笼饲养。当缺氧组和假手术对照组小鼠达到2月龄时，进行行为学实验。
- 在进行行为学测试之前，将受试对象置于测试环境中适应15–30分钟。
- 确保在不同受试对象和试验之间使用70%乙醇对所有设备/仪器进行消毒。
- 进行新物体识别（NOR）实验。
- 将相机置于能够清晰观察和监测受试对象的位置。
- 安装合适的视频追踪软件。
- 准备测试区域（一个60 cm × 60 × 厘米 × 40 cm 的箱子）中放置两个不比小鼠大的物体。确保两个物体大小和形状相似，并易于接触（10 cm） × 距离墙壁10 cm且保持平行。
- 第1天：熟悉阶段：
- 将小鼠放入含有两个相同物体的实验区域中，让其在设定的时间内（例如10分钟）自由探索物体。
- 在本次实验中，观察并记录小鼠与每个物体相处的时间，同时记录小鼠面向或与每个物体互动的次数。
- 第2天：新物体引入：
- 将第1天使用的一个熟悉物体替换为一个新物体（在外观、质地或形状上不同）。
- 将小鼠放回实验区域，使其自由探索，持续时间与第一阶段相同。
- 记录小鼠与熟悉物体（第1天的物体）和新物体接触的总时间。记录小鼠朝向或与每个物体互动的次数。
- 使用以下公式计算辨别指数（DI）以评估小鼠的记忆与学习能力：
辨别指数（DI）= {（在新物体上花费的时间 − 在熟悉物体上花费的时间）/（在两个物体上花费的总时间）} × 100.
注意：较高的辨别指数（DI）表明对新物体的兴趣更大，提示记忆和学习能力较好。DI 接近 0 表明无偏好，提示对熟悉物体的兴趣均等或记忆较差。 - 使用辨别指数（DI）客观评估小鼠的学习和记忆能力，该评估基于小鼠的自然好奇心及其识别和区分熟悉物体与新物体的能力。
- 进行悬尾实验（TST）
- 将摄像头安装在能够清晰观察并监测小鼠的位置。安装合适的视频追踪软件。
- 准备实验装置，确保空间可同时容纳3只小鼠。
- 使用高25 cm的硬纸板隔板，以20 cm的间隔将小鼠隔开，使其在测试期间无法看到彼此。
- 用胶带裁剪出12厘米长的条状物，小心地将其粘贴在每只小鼠的尾部，确保尾部牢固固定且不造成损伤。将胶带贴于尾端2厘米处，以便悬吊小鼠时不会对其造成伤害。
- 将小鼠悬吊后记录其行为6分钟。
- 在记录时间结束时，停止录像，取出小鼠并将其放回饲养笼中。分析视频以确定主动运动的持续时间和静止不动的持续时间。
注意：这将有助于了解应激反应，因为静止不动通常表明一种习得性无助或应激状态。小鼠的不动程度常用于衡量行为绝望或应激反应，这可能与应激或抑郁状态的影响相关。 - 根据小鼠在强制悬吊条件下表现出的运动与静止模式，评估其情绪状态及应对压力的机制。
- 进行弹珠埋藏实验
- 将一个空笼子（20 cm × 35 cm × 15 cm）的容器中放入高度为 5 cm 的玉米芯，摆放 20 颗弹珠，分为 5 行，每行 4 颗，确保弹珠在表面均匀分布。
- 将实验对象置于笼子的一角，确保其能够自由进入笼内全部区域。
- 给予小鼠20分钟时间探索笼子。在此期间，小鼠可能会表现出一定的埋藏行为，试图用玉米芯垫料覆盖弹珠。20分钟后，将小鼠从笼中移出。
- 在20分钟内统计小鼠将多少颗弹珠埋藏于玉米芯下方。记录被埋藏弹珠的总数，该数值是行为学检测的关键指标。
注意：小鼠掩埋弹珠的数量通常被用作评估其焦虑、强迫行为或新奇恐惧的指标。掩埋弹珠的数量越多，往往提示焦虑水平或强迫倾向越高。 - 根据被掩埋的玻璃珠总数，评估小鼠的焦虑相关行为和强迫倾向，可用于评估治疗或实验条件的影响。
- 进行社交互动测试。
- 将摄像头安装在能够清晰观察并监测小鼠的位置。
- 将摄像头连接到计算机，并设置合适的视频追踪软件。建立一个矩形区域（60 cm × 40 cm × 25 cm）并带有两堵墙（40 cm × 25 厘米）并设有两个门（8 厘米）以分隔三个腔室。
- 放置一个笼子（15 cm × 10 cm）内放置一只实验对象熟悉的小鼠，另一个笼子（15 cm × 10 cm）的笼子，内含一只此前未与实验对象接触过的小鼠。
- 开始记录，并将受试对象置于中间隔室。
注意：本实验中使用的非实验动物小鼠必须与实验动物性别相同且健康。 - 监测受试对象5分钟，并用摄像机记录。持续时间结束后，停止录制，取出小鼠并将其放回饲养笼中。
- 使用SIT软件分析小鼠的社交互动时间和社会新奇性倾向，并与假手术对照组进行比较。
注意：在社交行为（如理毛或嗅探）上花费更多时间，而在回避或表现出攻击性行为上花费较少时间，可被解释为具有较高的社交能力。回避互动、更多时间独处或表现出更强的攻击性，可能提示存在焦虑、社交退缩或社交互动能力下降。
- 进行旷场实验。
- 将摄像头放置在能够清晰观察和监测小鼠的位置。将摄像头连接至计算机，并设置合适的视频追踪软件。
- 设置测试区域（一个60 cm × 60 cm × 40 cm 的盒子），并用假想的线条将盒子划分为 16 个方格。
- 开始记录，并将小鼠小心地放置在旷场中央。观察并记录小鼠5分钟内的行为。
- 在持续时间结束时，停止记录，取出小鼠并将其放回饲养笼中。
- 使用追踪软件测量动物的外部和内部行为，包括行走、攀爬、逃避、理毛、静止不动、总穿越次数、排便和排尿，以评估其焦虑水平、运动能力、探索行为及情绪活动。
- 进行莫里斯水迷宫（MWM）测试。
- 在行为学实验室中，将直径120 cm、深60 cm的水迷宫稳定放置于23 ℃环境中 ± 1 °C.
- 将迷宫划分为四个假想的象限，并在迷宫墙壁每个象限的中央悬挂不同形状和颜色的视觉线索，距离底部约20 cm。将一个长17 cm、直径10 cm的平台置于距墙壁20 cm处。
注意：迷宫、提示物和平台的位置不应发生改变，以便小鼠能够准确训练其记忆。 - 将迷宫填充至21-26 °将水加至平台下方1厘米处，并用黑色多表面丙烯酸染料染色。
注意：若使用其他品系的小鼠，应将水染成与小鼠体色形成对比的颜色，以便观察。 - 将摄像头放置在能够捕捉完整图像的位置，并将其连接到计算机上的MWM软件。
注意：平台位置应在程序中为第五天的试验设定。 - 测试持续5天，每天进行四次试验。前四天，每天开始时将受试动物小心地放入水迷宫的不同象限，其面部朝向水箱壁，随即开始记录并启动试验。
- 在第5天测试计划中指定平台位置。
注意：此举可防止受试对象形成关联记忆。将受试对象小心地放入水中，并维持适宜的水温，对于避免引入额外应激至关重要。每次试验持续5分钟，满足以下任一条件即自动结束：（i）受试对象到达平台；（ii）达到5分钟时间上限。在连续数天的试验过程中，受试对象应逐渐学会平台的位置，并以更短的时间找到它。 - 第五天，移除平台，并按照先前所述方法将小鼠小心地放入迷宫的某一区域。
注意：当（i）小鼠找到并踏上平台，或（ii）达到5分钟时间限制时，试验将自动结束。健康的小鼠应能定位先前平台的位置。软件将自动计算每次试验中小鼠找到平台所需的时间，并用于评估受试动物的短期和长期记忆及学习能力。
6. 成年小鼠缺氧损伤的确认
- 行为学测试完成后，通过颈椎脱位法处死实验动物。
- 从每组（包括假手术对照组）中选取6只小鼠，采集海马组织和血液样本，用于分子分析（第7节）。
- 将剩余4只小鼠的脑组织置于10%甲醛溶液中，以检测新生期缺氧暴露对成年期脑形态的影响。
- 采用第4节中 previously 描述的相同技术，对成年小鼠脑组织进行组织学分析。
7. 从成年期样品中分离总RNA
- 向每份组织样本和500 µL血液中加入500 µL Trizol。
- 对于脑组织，使用注射器匀浆样本。
- 在室温下孵育混合物5分钟。
- 向每根试管中加入200 µL氯仿，并在室温下额外孵育5分钟。
- 在+4 °C下以12,000 g离心20分钟。
- 小心转移水相（RNA）至新的无菌管中。
- 加入异丙醇（与水相体积比为1:1），并将混合物在-20 °C过夜孵育。（可停止点 / -20 °C）。
- 次日，在+4 °C下以12,000 g离心10分钟。
- 小心弃去上清液，并向沉淀中加入1000 µL 75%乙醇。
- 在+4 °C下以7,500 × g离心5分钟。
- 重复乙醇洗涤步骤两次。
注意：如果沉淀过少，一次洗涤即可。 - 弃去上清液，让沉淀在室温下空气干燥。
- 待完全干燥后，用50 µL无核酸酶水（NFW）重悬沉淀，并在冰上+4 °C孵育10–15分钟。
- 通过分光光度法测定RNA浓度。
- 将RNA样本储存于-80 °C，直至进一步分析。
8. 互补DNA（cDNA）合成
- 在4°C冷却架上操作，准备从血液和脑组织中分离的RNA样品。
- 准备带标签的PCR管。
- 根据制造商说明书混合cDNA合成试剂盒的试剂。
- 为每个样品配制总共14 µL的反应混合液，并分装至各管中。
- 向混合液中加入6 µL RNA样品。
- 在PCR仪中按照制造商规定的温度和时间条件进行cDNA合成。
注意：此步骤合成的cDNA可保存在-80 °C，待后续使用。 - 将合成的cDNA按1:5比例稀释。
- 将稀释后的cDNA储存于-80 °C，用于后续qPCR分析。
9. miRNA（miR-19a-3p、miR-361-5p、miR-150-5p、miR-126-3p、miR-499a-5p）及U6小核RNA（作为归一化对照）表达的定量实时PCR检测
- 为每种miRNA设计引物（引物序列见补充表2）。
- 根据制造商说明书配制PCR反应体系。
- 将14 µL反应混合液加入96孔PCR板的每个孔中。
- 向每个孔中加入6 µL按1:5稀释的cDNA，使总反应体积达到20 µL。
- 每个样本进行复孔PCR扩增，以减少实验误差，反应程序如下：95 °C预变性120 s，随后进行45个循环（95 °C变性10 s，56 °C退火与扩增60 s），最后进行熔解曲线分析（60 °C保持15 s，然后升至95 °C）。
- 采用Ct值（循环阈值）分析结果，并使用2-ΔΔCt法对数据进行归一化处理。
10. 统计分析
- .使用直方图、Q-Q 图和 Shapiro-Wilk 检验评估 miRNA 表达数据的正态性。
- 如果数据呈正态分布，则使用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。
- 如果数据不符合正态分布，则应用 Kruskal-Wallis 检验、学生 t 检验（student's t-test）或 Mann-Whitney U 检验。
- 在评估每组内性别差异时，根据数据分布情况使用学生 t 检验（student's t-test）或 Mann-Whitney U 检验。统计学显著性由 p 值小于 0.05（p < 0.05）确定。
注意：所有分析均应使用适当的统计软件进行。此处使用 GraphPad Prism 8。 - 使用直方图、Q-Q 图和 Shapiro-Wilk 检验评估行为实验结果数据的正态性。
- 如果数据呈正态分布，则使用双因素方差分析（Two-Way ANOVA）。
- 对于非正态分布的数据，执行 Kruskal-Wallis 检验、学生 t 检验（Student's t-test）或 Mann-Whitney U 检验。
- 根据数据分布情况，使用学生 t 检验（student's t-test）或 Mann-Whitney U 检验评估每组内的性别差异。同样，若 p 值小于 0.05（p < 0.05），则认为结果具有统计学显著性。
- 对于免疫组织化学分析，采用双因素方差分析（Two-Way ANOVA）后接 Tukey 事后检验（Tukey's post-hoc test），以比较雌性和雄性组别。
- 为比较每种缺氧条件下雌性和雄性组别，使用 Sidak 事后检验（Sidak's post-hoc test）。若 p 值小于 0.05（p < 0.05），则判定为具有统计学显著性。
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结果
在本研究中，怀孕的Balb/c小鼠在分娩期间暴露于8% O2（重度）、10% O2（中度）和12% O2（轻度）的低氧环境中，并在出生后继续维持相应的低氧条件5分钟，以建立轻度、中度和重度新生儿低氧模型。假手术对照组小鼠则在常氧（21% O2）条件下分娩，随后在标准饲养条件下饲养。这有助于分离不同氧浓度对小鼠的真实影响，确保实验结果的有效性。
建立新生小鼠缺氧模型后，处死一组新生小鼠进行免疫组织化学染色（HIF1α 和 H&E 染色），以检测缺氧暴露对新生小鼠脑组织的影响。对剩余小鼠在2月龄时进行行为学测试。行为学测试完成后，处死小鼠并进行全脑组织病理学评估，检测海马组织和血液样本中 miR-19a-3p、miR-361-5p、miR-150-5p、miR-126-3p 和 miR-499a-5p 的表达谱。
免疫组织化学分析显示，在缺氧条件下，新生脑组织中HIF1-α的表达水平升高
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讨论
围产期缺氧是一种主要的新生儿健康问题，可通过干扰关键的发育过程，导致分子、细胞和神经元层面的改变，并与多种神经发育障碍相关，包括自闭症谱系障碍（ASD）1。尽管重度缺氧的即时效应已被广泛研究，但围产期轻度至中度缺氧的长期后果仍知之甚少。本研究旨在填补这一空白，通过考察新生儿缺氧后的神经行为学和分子学结局，揭示了这两个领域中的显著改变。为实现这一目标，我们建立了一种多层次的小鼠新生儿缺氧模型，并进行了全面的组织病理学、行为学和分子学分析。该实验方案旨在模拟临床环境中常见的轻度至中度缺氧事件，这类事件致死性较低，但仍可引发持久的影响。
本方案中的关键步骤是通过在分娩期间将怀孕小鼠暴露于特定的低氧环境中，以诱导产前/产后低氧，随后对部分新生小鼠额外进行5分钟的低氧暴露。该方法使我们能够系统地研究不同程度的低氧及其对神经发育的影响，同时优化暴露时机，以在保证存活率的前提下获得可测量的分子和行为学效应。对新生小鼠脑组织的组织病理学检查包括缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）的免疫组织化学染色，以确认低氧诱导及细胞应激反应。在小鼠2月龄时进行的行为...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由土耳其科学技术研究理事会（TÜBİTAK）资助，作者感谢塞拉莱廷·戈克塔什（转基因动物设施）和生物学家塞尔达·塔什德米尔（行为学实验室）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (-20 °C) 冰箱 | Siemens | KD86NAWE0N | |
| (+4 °C) 冷却块 | Antagen Bioscience | https://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/ | |
| (+4 °C) 冰柜 | Siemens | KD86NAWE0N | |
| (-20 °C) 冷却块 | Cleaver Sientific | https://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/ | |
| 无水乙醇 | Merck | 1070172511 | |
| 乙酸铵 | Sigma | 238074-500G | |
| 分析天平 | Adam Equipment | LAB214i | |
| 氯仿 | Merck | 1024451000 | |
| 柠檬酸 | Merck | 100241 | |
| 计算机 | HP | https://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1 | |
| EDTA | Sigma | E9884-1KG | |
| Entellan | Merck | 107961 | |
| 伊红 | Merck | 109844 | |
| Eppendorf 管 (1.5 mL) | ?solab | 078.03.021 | |
| Ethovision 系统 | Noldus | https://noldus.com/ethovision-xt | |
| 恒温干燥箱 | NUVE | EN 400/500 N/A | |
| Falcon 管 (15 mL) | Isolab | 078.02.001 | |
| 甲醛 | Merck | 104002 | |
| 热成像相机 | Samsung | SC2000 | |
| 苏木精 | Merck | 105175 | |
| HIF-1α 抗体 | Bioss | bs-20398R | |
| 缺氧培养舱 | Biospherix | A-Chamber | |
| 异丙醇 | Merck | 1096342511 | |
| Light Cycler 480 II | Roche | 5015278001 | |
| 大理石埋藏实验笼 | Vishnu | https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel | |
| 微量离心管 (1.5 mL) | Greiner | 616201 | |
| 移液器吸头 (100 µL) | Greiner | 774353 | |
| 移液器吸头 (1000 µL) | Greiner | 778353 | |
| 移液器 (10 µL) | Gilson | FD10001 | |
| 移液器 (100 µL) | Gilson | FD10004 | |
| 移液器 (1000 µL) | Gilson | FD10003 | |
| 移液器吸头 (10 µL) | Greiner | 772353 | |
| 移液器 (2 µL) | Gilson | GFAM00064 | |
| 显微镜 | Olympus | Bx53 | |
| miRCURY LNA RT 试剂盒 (cDNA 合成试剂盒) | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR 试剂盒 | Qiagen | 339346 | |
| 多孔板 | Roche | 4729692001 | |
| 纳米分光光度计 | Shimadzu | C101-E112 | |
| 新物体识别实验装置 | Global Biotech | 137 | |
| 旷场实验装置 | Global Biotech | 117 | |
| Oxycycler | Biospherix | A42OC | |
| 石蜡 | Leica | 39602012 | |
| PBS 片剂 | Sigma | P4417-50TAB | |
| PCR 仪 | Sensoquest | T3-0140 | |
| 板式离心机 | Peqlab | 91-PSPIN-P | |
| Prism | GraphPad | https://www.graphpad.com/ | |
| 蛋白酶 K | Sigma | P6556-10MG | |
| QIAzol 裂解试剂 | Qiagen | 79306 | |
| SDS | Sigma | 8170342500 | |
| 二抗 | Abcam | A0545-1ML | |
| 社交互动实验三室装置 | Global Biotech | 118 | |
| 离心机 | Gilson | PMC880 | |
| 注射器 (2 mL) | Baybi | https://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler | |
| 尾悬吊实验装置 | 自制，可在 Harvard Apparatus 找到类似产品 | 自制，可在 (https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html) 找到类似产品 | |
| 恒温混匀仪 | Eppendorf | #5355 | |
| Trizma 碱 | Sigma | 1503-1KG | |
| 涡旋振荡器 | Heidolph | 541-10000-00-1 | |
| 二甲苯 | Isolab | 9,90,01,92,501 |
参考文献
- Bonkowsky, J. L., Son, J. -H. Hypoxia and connectivity in the developing vertebrate nervous system. Dis Model Mech. 11 (12), dmm037127(2018).
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