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方法文章

达乌尔黄鼠肝移植术后管理及用于单细胞RNA测序的样本采集

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DOI：

10.3791/68443

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2025年9月16日

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1Department of Hepatic Surgery and Liver Transplantation Center of the Third Affiliated Hospital, Organ Transplantation Institute, Sun Yat-sen University; Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, Guangdong Province Engineering Laboratory for Transplantation Medicine, 2Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 3Collage of Life Science, Shenyang Normal University, 4Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology; Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education, Chinese Academy of Medical Sciences, NHC Key Laboratory of Organ Transplantation, 5The School of Life Science, Peking University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了达乌尔黄鼠（DGS；Spermophilus dauricus）肝脏的延长冷保存及原位移植的操作步骤，达乌尔黄鼠是一种典型的季节性冬眠动物。方案包括获取肝脏移植物和血液样本以进行预后评估，以及对这些样本进行单细胞水平研究的处理方法。

摘要

移植物功能恢复及移植物与宿主之间的免疫相容性是肝移植术后主要的预后问题。关键在于，传统的使用大鼠或小鼠的啮齿类动物模型对于研究低温保存过程中移植物损伤机制提供的信息十分有限。这一局限凸显了建立替代模型的必要性。由于来自耐寒性达乌尔黄鼠（DGS；Spermophilus dauricus）的肝移植物能够耐受长时间的低温保存，因而可在移植后实现较高的存活率。基于此，本方案详细阐述了移植后DGS实验动物所需的关键术后护理及生理学监测措施。此外，本方案还提供了制备高质量肝移植物样本的标准化操作流程，以用于后续多种分析技术，包括用于转录组学分析的单细胞RNA测序（scRNA-seq）以及组织病理学检查。成功制备高质量的DGS移植物样本，是将传统与前沿方法应用于这一非传统但极具相关性的模型研究中的关键第一步。本方案将有助于获取DGS的多组学信息，从而推动未来在冬眠啮齿类动物及其他特殊生物体中开展外科干预和疾病模型研究。

引言

在过去的二十年中，越来越多的研究人员意识到，冬眠物种卓越的适应能力为揭示生物适应的新机制提供了宝贵的机会，并可为器官保存和代谢康复等多个医学领域带来突破性进展1,2,3,4,5,6,7,8。目前，已首次建立了针对冬眠动物——达乌尔黄鼠（DGS；Spermophilus dauricus）肝脏的长时间低温保存及原位移植的完整外科手术方案。显然，达乌尔黄鼠的耐寒特性使得供体移植物能够实现更长时间的低温储存，并显著提高受体动物移植后的存活率。因此，亟需后续的标准化操作流程，以监测术后动物的恢复情况，并为多种组织病理学和组学研究准备样本。

鉴于树鼩（DGS）与标准啮齿类动物模型之间存在显著的生理差异，以及受体动物在肝移植术后复杂的动态生理变化，从中获取高质量样本对于后续分析至关重要，进而有助于理解移植后的移植物-宿主生理学。除了采用常规方法采集、处理和检测血液及肝组织样本外，成功分离肝脏实质细胞（即肝细胞）以及包括内皮细胞、星状细胞、枯否细胞和其他免疫细胞在内的非实质细胞（NPCs），将有助于借助快速发展的单细胞多组学技术阐明术后复杂的细胞与分子相互作用。为此，基于胶原酶灌注的经典方法自20世纪50年代初以来已被建立并持续优化9,10,11。然而，DGS肝脏独特的解剖结构、血管重建术后引起的粘连以及手术触发的肝脏移植物生理改变，均要求对细胞提取条件进行精细调整。

本方案为肝移植术后胸导管引流液（DGSs）的术后管理和样本采集提供了详细的指导。具体而言，本方案能够从肝移植物中高产量、高细胞活性地分离肝细胞，并详细说明了分离肝细胞后续用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）的处理步骤。

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方案

所有动物实验均经北京大学实验动物伦理委员会批准（编号：LSC-WangSQ-2）。本研究中使用的长爪沙鼠由实验室自行繁育，其亲代为在张家口市草原捕获的怀孕雌性长爪沙鼠。实验时动物年龄约为1-2岁。选用体重在180 g至400 g之间的雄性和雌性长爪沙鼠作为供体和受体。受体体重略大于供体，差异小于50 g。所用试剂和设备详见材料表。

1. 移植后护理

  1. 将肝移植术后DGSs饲养在温暖、清洁的环境中，保持12小时光照/12小时黑暗循环，提供标准实验室饲料和饮水 随意摄取.
  2. 每日监测体重，观察腹部切口有无出血，并评估受体的精神状态和活动水平。
  3. 术后立即皮下注射头孢呋辛（16 mg/kg）和布托啡诺（0.05 mg/kg），每12小时一次，持续3天。
  4. 每日肌肉注射他克莫司（1 mg/kg），直至组织采集前24小时。
    注意：由于DGS主要来源于野生捕获个体，移植相关的免疫学因素仍不可忽略。DGS之间的移植被视为同种异体移植（而非同系移植）。若研究需要排除免疫学因素（如排斥反应），应确保术后规范使用他克莫司。

2. 肝脏移植物样本制备

  1. 溶液与仪器的准备
    1. 配制 50 mL 含 500 µM EGTA（无 Ca²⁺）的 HBSS2+- 和 Mg2+无血清，pH 7.4。使用前在40 °C水浴中预热。
    2. 将胶原酶 IV（0.4 mg/mL）溶解于 50 mL HBSS（含 Ca）中2+ 和 Mg2+并在40 °C水浴中孵育30分钟。
    3. Percoll 溶液：将 Percoll 与 10× PBS 按 9:1 (v/v) 的比例混合，再用 1× PBS 按 9:1 (v/v) 的比例稀释至 15 mL 离心管中。将溶液置于冰上保存。
      注意：每个DGS需准备5 mL 90% Percoll溶液。
    4. 使用前将手术器械浸入70%乙醇中30分钟。
    5. 组装灌流系统，包括可调速的蠕动泵、硅胶管和水浴装置。用温热的生理盐水冲洗管路以排除气泡，并在管路出口处连接一个无菌的0.22 µm滤器。
      注意：在排除气泡之前，需先用70%乙醇彻底冲洗重复使用的管路15分钟，随后用ddH₂O完全冲洗。2O 去除残留乙醇，15 分钟。
  2. 动物实验操作
    1. 麻醉移植后的DGS 通过 按 1 mL/100 g 体重剂量腹腔注射 2.5% 三溴乙醇。通过检测反射消失（如脚趾挤压反应）确认麻醉完全。
    2. 剃除腹部毛发，将DGS固定于手术板上，腹部朝上。
    3. 用70%乙醇喷洒动物腹部区域，然后使用尖头剪刀和齿镊在皮肤和腹膜上做较大的十字形切口，以打开腹腔。
    4. 用棉签轻轻将肠管移至腹腔右侧，直至清晰暴露肝移植物、门静脉（PV）和下腔静脉（IVC）图1A).
      注意：由于肝移植术后腹腔内存在粘连，需使用湿润的棉签轻轻分离粘连组织。
    5. 将5 mL注射器插入吻合口下方的下腔静脉（IVC），采集1–2 mL血液，拔出针头后立即用干燥棉签对穿刺部位施加轻柔压力以实现止血图1B).
      注意：为减少出血，可用1 mL注射器的针头（约30 G）替换原针头。
    6. 以斜面朝上的方向，使用22G导管与血管表面呈15°角轻柔穿刺门静脉，随后回撤导管针芯。确认穿刺成功后，再轻柔地将导管沿血管推进1-1.5 cm。使用血管夹固定导管位置图1C).
      注意：如果导管放置正确，可见回血现象。若门静脉插管失败或遇到技术困难，可改为插管肝下腔静脉，并将门静脉作为灌注液流出通道。
    7. 以6-8 mL/min的速度启动灌注泵，用温热的生理盐水灌注，然后将上述0.22 µm滤器连接至导管。
    8. 灌流一旦完成 通过 PV 启动后，切开下腔静脉以允许血液流出。需要 50–80 mL 生理盐水以实现充分灌注（图1D).
      注意：在此过程中，当移植肝脏转变为淡黄白色时，表明灌注成功。肝脏表面可能仍存在一些暗红色的淤血区域，无法完全清除，这可能是由于术中肝损伤（如缺血-再灌注损伤）所致。
    9. 在用50–80 mL温盐水充分灌注后，暂停泵的运行。
    10. 在左外侧叶基底部使用2-0丝线结扎，随后切除结扎远端的肝叶。同样，中叶亦在其基底部以相同方法进行结扎并切除。图1E，F).
      注意：进行部分肝切除旨在为多种实验目的最大化利用移植肝脏，同时减少胶原酶缓冲液的消耗，并促进肝脏的充分消化。
    11. 将切除的肝组织分成若干份：一份用于分离鼻咽癌细胞并进行单细胞RNA测序，其余部分用4%多聚甲醛固定以进行组织学切片，或在液氮中速冻用于其他实验。
      注意：为节省时间，步骤 2.2.11 可由另一人与后续步骤同时进行。
    12. NPCs的分离。将组织切成约1-2 mm大小3 在RPMI-1640培养基中将组织切碎，并按照制造商说明使用gentleMACS进行酶消化（见材料表）。使用自动细胞计数仪测定细胞活力和细胞浓度。
      注意：步骤 2.2.12 与步骤 2.2.13–2.3.5 同时进行。
    13. 剪断膈肌并夹闭肝上腔静脉（图1G).
    14. 将进样管转移至预热的EGTA缓冲液中。以6-8 mL/min的流速重新启动泵。
    15. 定期夹闭下腔静脉5-10秒，以促进灌注液在肝实质内均匀分布。夹闭期间肝脏会明显肿胀，松开后则恢复松弛状态。
      注意：必须避免长时间中断引流，因为持续阻塞可能导致肝脏周围薄弱的结缔组织破裂，干扰肝毛细血管床的灌注或液体动力学。此外，持续性阻塞可能因肝细胞对机械力敏感而影响细胞活力，并降低细胞收获率。
    16. 在用 40–50 mL EGTA 溶液灌注后，以 4–6 mL/min 的速度开始胶原酶缓冲液灌注，持续 8–10 分钟。短暂夹闭流出血管，步骤同上。图1H).
      注意：胶原酶灌注 5-6 分钟后，肝脏会明显变软，并出现表面裂纹。如果未出现这些形态学变化，应将灌注速度降至 3-4 mL/min，并将总消化时间延长至 12-13 分钟。完成 50 mL 胶原酶灌注后，肝脏呈现易碎、类似豆腐的质地，这是消化充分的标志图1I).
    17. 停止泵并移除插管。将肝脏从体内切除，放入含有10 mL冰冻DMEM/F12培养基的5 cm培养皿中。
  3. 肝细胞纯化
    1. 将肝脏撕碎以释放细胞，并将细胞悬液转移至一个顶部放置70 µm滤网的50 mL锥形管中。
    2. 离心细胞悬液（50 × g）后 g 4 °C下离心3分钟，弃上清液，用20 mL 1× PBS重悬沉淀。重复此步骤3次。最后一次离心后，用5 mL DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀。
    3. 轻轻将细胞悬液与等体积的90% Percoll溶液在15 mL离心管中混合。以200 x g 4 °C 下离心 10 分钟。
      注意：Percoll 离心后，混合物分为三层：上层（约 0.5–1 mL）含有死细胞，而活肝细胞则集中在下层（约 0.5–0.8 mL）（图2产量为 5-8 × 107 具有活性的肝细胞 >该方案通常可获得80%的细胞存活率。图3A，B).
    4. 小心吸除死亡细胞和上清液，避免剧烈扰动各层，用 10 mL DMEM/F12 培养基重悬活细胞。在 50 x g 4 °C下离心5分钟。
    5. 弃去上清液，用含2%胎牛血清的1×PBS重悬纯化的肝细胞，终体积为1-5 mL，终浓度为500-1200个细胞/µL。
    6. 将肝细胞与NPCs按数量1:1的比例混合，即通过混合10,000个肝细胞和10,000个NPCs制备细胞悬液。
  4. 单细胞RNA测序
    注意：步骤 2.4.1–2.4.3 按照基于液滴的单细胞 3′ 基因表达文库制备试剂盒的用户指南进行操作12采用基于液滴的微流控单细胞分隔与条形码标记平台，该平台包括乳液中凝胶微珠（GEM）生成、cDNA文库构建以及遵循标准流程的Illumina测序等关键步骤。
    1. 为进行GEM生成与条形码标记，使用含有20,000个肝细胞和NPCs的细胞悬液。细胞捕获效率不低于60%。
    2. cDNA扩增前，根据用户指南对GEM-RT反应后的样本进行纯化处理12.
    3. 文库构建
    4. 使用测序平台对单细胞RNA文库进行测序，每个样本达到150 Gb的测序深度；使用Cell Ranger（v8.0.0）将原始碱基识别文件拆分为FASTQ文件。
    5. 将FASTQ文件比对到 Ictidomys tridecemlineatus 基因组（NCBI登录号：GCF_016881025.1）用于表达量定量，完成实验流程。

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结果

将移植物在4 °C下保存24小时后移植至DGS模型中，术后第3天和第6天的组织学检查显示，肝脏小叶结构正常，炎症、坏死或胆汁淤积等异常表现极少，与假手术组相当（图4A-C）。

从术后DGS中分离原代肝细胞大约需要1小时。采用所述方案，可获得超过5 × 107个肝细胞，细胞活力约为80%（图3A、B）。分离得到的原代肝细胞与肝脏非实质细胞（NPCs）混合后用于后续单细胞RNA测序分析，聚类分析结果显示共存在12种细胞类型（图5）。

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讨论

根据描述DGS中供体肝脏冷保存和移植的方案，本文所述步骤详细介绍了移植了至少冷保存24小时肝脏的DGS术后监测及个体化药物管理。本方案可实现受体在移植后存活超过7天，显示出冬眠动物作为器官保存13,14和移植研究模型相比标准啮齿类模型的明显优势。

此处，两步胶原酶灌注程序已根据DGS肝脏独特的组织特性进行了调整（图6）。调整后的酶浓度（0.4 mg/mL 胶原酶）和消化时间（8–10 分钟）使分离得到的肝细胞存活率超过80%。这对于单细胞RNA测序（scRNA-seq）等下游分析至关重要，因为此类分析需要高质量的单个细胞以实现可靠的转录组谱分析。此外，本方案还验证了在移植后移植物获取过程中整合部分肝切除的可行性。如步骤2.2.10–2.2.11所述，未消化的左外侧叶和方叶可用于非实质细胞分离、生化检测以及组织病理学切片。从剩余肝组织中分离的肝细胞可提供足够的材料用于后续的scRNA-seq分析。该方法结合部...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由非传染性慢性疾病-国家科技重大专项（2023ZD0507600）、国家自然科学基金资助项目（82170671、92254301、32230048、82371794、32301306）、国家R&D 计划（2024YFA0916804）以及浙江大学教育基金会院士兰娟·树森人才基金

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1× PBSServicebioG4202
10× PBSServicebioG4207
4% 多聚甲醛BiosharpBL539A
丁丙诺啡ShafeiH12020276
套管（22 G）BBRAUN4254090B
头孢呋辛SelleckE4838
细胞培养皿（60 mm）NEST705001
胶原酶 IVSigma-AldrichC5138
锥形管（15 mL）NEST601052
锥形管（50 mL）NEST602052
棉签家用商店
Countstar 自动细胞计数仪RuiyuCountstar Rigel S2
DMEM/F12GibicoC11330500BT
EGTASigma-AldrichE4378
FBSGibco10099-141
滤器（0.22 μm）Merck MilliporeSLGP033RB
滤器（70 μm）Biologix15-1070
gentleMACSMiltenyi130-093-235
HBSS（含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）ServicebioG4204
HBSS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）ServicebioG4203
NPCs 解离试剂盒Miltenyi130-096-730
PercollCytiva17-0891-09
蠕动泵YuyanBT100
RPMI-1640GibicoC11875500BT
生理盐水SRBSRB009
测序仪Illumina NovaSeq X Plus
硅胶管TygonE-3603
丝线缝合线ETHICONSA845G
注射器（1 mL）Lige ScienceLG05-124仅需注射器针头
注射器（2 mL）Lige ScienceLG05-124仅需注射器筒体
他克莫司SelleckS5003
移液管Biologix30-0138A1
三溴乙醇Sigma-AldrichT48402
水浴锅GrantSAP2

参考文献

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