达乌尔黄鼠肝移植术后管理及用于单细胞RNA测序的样本采集

摘要

本方案描述了达乌尔黄鼠（DGS；Spermophilus dauricus）肝脏的延长冷保存及原位移植的操作步骤，达乌尔黄鼠是一种典型的季节性冬眠动物。方案包括获取肝脏移植物和血液样本以进行预后评估，以及对这些样本进行单细胞水平研究的处理方法。

摘要

移植物功能恢复及移植物与宿主之间的免疫相容性是肝移植术后主要的预后问题。关键在于，传统的使用大鼠或小鼠的啮齿类动物模型对于研究低温保存过程中移植物损伤机制提供的信息十分有限。这一局限凸显了建立替代模型的必要性。由于来自耐寒性达乌尔黄鼠（DGS；Spermophilus dauricus）的肝移植物能够耐受长时间的低温保存，因而可在移植后实现较高的存活率。基于此，本方案详细阐述了移植后DGS实验动物所需的关键术后护理及生理学监测措施。此外，本方案还提供了制备高质量肝移植物样本的标准化操作流程，以用于后续多种分析技术，包括用于转录组学分析的单细胞RNA测序（scRNA-seq）以及组织病理学检查。成功制备高质量的DGS移植物样本，是将传统与前沿方法应用于这一非传统但极具相关性的模型研究中的关键第一步。本方案将有助于获取DGS的多组学信息，从而推动未来在冬眠啮齿类动物及其他特殊生物体中开展外科干预和疾病模型研究。

引言

在过去的二十年中，越来越多的研究人员意识到，冬眠物种卓越的适应能力为揭示生物适应的新机制提供了宝贵的机会，并可为器官保存和代谢康复等多个医学领域带来突破性进展^{1,2,3,4,5,6,7,8}。目前，已首次建立了针对冬眠动物——达乌尔黄鼠（DGS；Spermophilus dauricus）肝脏的长时间低温保存及原位移植的完整外科手术方案。显然，达乌尔黄鼠的耐寒特性使得供体移植物能够实现更长时间的低温储存，并显著提高受体动物移植后的存活率。因此，亟需后续的标准化操作流程，以监测术后动物的恢复情况，并为多种组织病理学和组学研究准备样本。

鉴于树鼩（DGS）与标准啮齿类动物模型之间存在显著的生理差异，以及受体动物在肝移植术后复杂的动态生理变化，从中获取高质量样本对于后续分析至关重要，进而有助于理解移植后的移植物-宿主生理学。除了采用常规方....

方案

所有动物实验均经北京大学实验动物伦理委员会批准（编号：LSC-WangSQ-2）。本研究中使用的长爪沙鼠由实验室自行繁育，其亲代为在张家口市草原捕获的怀孕雌性长爪沙鼠。实验时动物年龄约为1-2岁。选用体重在180 g至400 g之间的雄性和雌性长爪沙鼠作为供体和受体。受体体重略大于供体，差异小于50 g。所用试剂和设备详见材料表。

1. 移植后护理

1. 将肝移植术后DGSs饲养在温暖、清洁的环境中，保持12小时光照/12小时黑暗循环，提供标准实验室饲料和饮水 随意摄取.
2. 每日监测体重，观察腹部切口有无出血，并评估受体的精神状态和活动水平。
3. 术后立即皮下注射头孢呋辛（16 mg/kg）和布托啡诺（0.05 mg/kg），每12小时一次，持续3天。
4. 每日肌肉注射他克莫司（1 mg/kg），直至组织采集前24小时。
   注意：由于DGS主要来源于野生捕获个体，移植相关的免疫学因素仍不可忽略。DGS之间的移植被视为同种异体移植（而非同系移植）。若研究需要排除免疫学因素（如排斥反应），应确保术后规范使用他克莫司。

2. 肝脏移植物样本制备

1. 溶液与仪器的准备
   1. 配制 ....

结果

将移植物在4 °C下保存24小时后移植至DGS模型中，术后第3天和第6天的组织学检查显示，肝脏小叶结构正常，炎症、坏死或胆汁淤积等异常表现极少，与假手术组相当（图4A-C）。

从术后DGS中分离原代肝细胞大约需要1小时。采用所述方案，可获得超过5 × 10⁷个肝细胞，细胞活力约为80%（图3A、B）。分离得到的原代肝细胞与肝脏非实质细胞（NPCs）混合后用于后续单细胞RNA测序分析，聚类分析结果显示共存在12种细胞类型（图5）。

讨论

根据描述DGS中供体肝脏冷保存和移植的方案，本文所述步骤详细介绍了移植了至少冷保存24小时肝脏的DGS术后监测及个体化药物管理。本方案可实现受体在移植后存活超过7天，显示出冬眠动物作为器官保存^13,14和移植研究模型相比标准啮齿类模型的明显优势。

此处，两步胶原酶灌注程序已根据DGS肝脏独特的组织特性进行了调整（图6）。调整后的酶浓度（0.4 mg/mL 胶原酶）和消化时间（8–10 分钟）使分离得到的肝细胞存活率超过80%。这对于单细胞RNA测序（scRNA-seq）等下游分析至关重要，因为此类分析需要高质量的单个细胞以实现可靠的转录组谱分析。此外，本方案还验证了在移植后移植物获取过程中整合部分肝切除的可行性。如步骤2.2.10–2.2.11所述，未消化的左外侧叶和方叶可用于非实质细胞分离、生化检测以及组织病理学切片。从剩余肝组织中分离的肝细胞可提供足够的材料用于后续的scRNA-seq分析。该方法结合部.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1× PBS	Servicebio	G4202
10× PBS	Servicebio	G4207
4% 多聚甲醛	Biosharp	BL539A
丁丙诺啡	Shafei	H12020276
套管（22 G）	BBRAUN	4254090B
头孢呋辛	Selleck	E4838
细胞培养皿（60 mm）	NEST	705001
胶原酶 IV	Sigma-Aldrich	C5138
锥形管（15 mL）	NEST	601052
锥形管（50 mL）	NEST	602052
棉签	家用商店
Countstar 自动细胞计数仪	Ruiyu	Countstar Rigel S2
DMEM/F12	Gibico	C11330500BT
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
FBS	Gibco	10099-141
滤器（0.22 μm）	Merck Millipore	SLGP033RB
滤器（70 μm）	Biologix	15-1070
gentleMACS	Miltenyi	130-093-235
HBSS（含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）	Servicebio	G4204
HBSS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）	Servicebio	G4203
NPCs 解离试剂盒	Miltenyi	130-096-730
Percoll	Cytiva	17-0891-09
蠕动泵	Yuyan	BT100
RPMI-1640	Gibico	C11875500BT
生理盐水	SRB	SRB009
测序仪	Illumina	NovaSeq X Plus
硅胶管	Tygon	E-3603
丝线缝合线	ETHICON	SA845G
注射器（1 mL）	Lige Science	LG05-124	仅需注射器针头
注射器（2 mL）	Lige Science	LG05-124	仅需注射器筒体
他克莫司	Selleck	S5003
移液管	Biologix	30-0138A1
三溴乙醇	Sigma-Aldrich	T48402
水浴锅	Grant	SAP2