本文介绍了一种在达乌尔黄鼠（Daurian ground squirrel, DGS）中建立长期肝脏低温保存与移植模型的方案，该技术在标准啮齿类动物模型中一直具有较大挑战性。
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本文内容
摘要
摘要
在肝移植中，供体移植物在长时间冷保存后实现功能恢复是一个重大挑战。尽管标准啮齿类动物模型（如小鼠和大鼠）已有成熟的手术方案，但同样面临这一难题，从而限制了对移植后功能恢复及宿主-移植物免疫相容性等关键问题的研究。本文中，我们成功建立了一种新型肝移植模型，采用 obligate 休眠动物——达乌尔黄鼠（DGS；Spermophilus dauricus），该动物具有对极深度低温-复温以及缺血-再灌注转换过程的内在适应能力。在我们的实验条件下，达乌尔黄鼠受体在接受24小时冷保存后的肝脏移植后，在为期7天的观察期内存活率达到100%；而采用相同操作的Sprague-Dawley（SD）大鼠受体在术后24小时存活率为0%。因此，达乌尔黄鼠及其他耐寒哺乳动物模型为研究器官冷适应机制和移植耐受性提供了独特且可靠的平台，有助于推动移植医学领域新疗法或手术策略的发展。
引言
冷-复温以及缺血-再灌注是导致肝脏移植物损伤的重要因素，会增加早期移植物功能障碍的风险。尽管在小鼠和大鼠等标准啮齿类动物中进行的肝移植已成功建立1,2，但由于这些对低温敏感的物种在研究冷适应机制方面提供的信息有限，器官保存和移植医学的发展受到了阻碍。
在合适的冷适应物种中建立移植研究模型可能填补这一空白。例如，哺乳动物冬眠者已进化出适应长时间低温环境和/或食物匮乏的能力3,4。在冬眠期间，其生理状态会周期性地在蛰眠状态和阵发性觉醒状态之间转换，从而能够很好地适应低核心体温，并耐受快速复温及血液再灌注。值得注意的是，能够冬眠的地松鼠即使在活跃的恒温状态下，对缺血-再灌注损伤的耐受性也强于大鼠5,6。近年来，受冬眠动物启发的研究揭示了一些冷适应机制和可药物干预的靶点，这些靶点可通过调控显著减轻冷保存引起的损伤，并改善非冬眠物种离体组织和器官的功能恢复7,8,9....
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方案
所有动物实验均经北京大学实验动物护理与使用机构委员会批准（编号：LSC-WangSQ-2）。本研究中使用的关键仪器列于材料表中，并在图1中展示。
注意：在实验室环境中对野生捕获的冬眠啮齿类动物（如十三条纹地松鼠）进行饲养和繁殖的方法已有描述15,16。本研究中使用的地松鼠（DGS）由在张家口市草原捕获的怀孕雌性地松鼠在实验室中繁殖产生。实验时动物年龄约为1-2岁。对于最初捕获的怀孕雌性地松鼠，已在抵达实验室前清除寄生虫。动物到达实验室后进行了隔离，并检测常见病毒，检测结果为阴性的个体被保种饲养。
1. 术前准备
- 实验动物
- 使用成年地鼠（DGS），年龄1-2岁，雌雄不限，体重介于180 g至400 g之间，作为供体和受体。受体体重略大于供体，差异小于50 g。
- 对照组使用成年SD大鼠，年龄8-10周，雌雄不限，体重200-300 g，作为供体和受体。在整个实验过程中，需佩戴外科口罩、实验服和丁腈手套；在处理和转移DGS动物时，还需额外佩戴加厚皮革手套。
注：大鼠的外科技术已在其他文献中充分记载。本....
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结果
手术操作的平均持续时间为：供体手术平均 24.8 ± 2.3 分钟，修肝操作 15.4 ± 1.3 分钟，受体手术 52.7 ± 5.1 分钟，无肝期 14.2 ± 1.5 分钟。
接受在低温 UW 溶液中保存 24 小时的肝脏移植物的大鼠，无论移植前是否处于冬眠状态（n = 8）或非冬眠状态（n = 4），术后 7 天的存活率均为 100%（图 9）。术后第 7 天未观察到血管闭塞现象。所有肝动脉均通过支架技术保持灌注。相比之下，所有接受其他 SD 大鼠提供的肝脏移植物、且同样在低温 UW 溶液中保存 24 小时的 SD 大鼠（n = 9），均在移植后 12 小时内死亡。
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讨论
在Kamada双袖套技术的基础上2，我们成功建立了首个用于DGS的原位肝移植模型。由于DGS与传统大鼠模型之间存在解剖学差异，因此在材料准备、手术操作及术后管理方面需采取特定的注意事项。
冬眠和脂肪储备等因素导致成年DGS个体体重存在显著差异，范围从150 g到400 g，且雄性和雌性之间有明显差别。因此，供体和受体的谨慎选择至关重要。理想情况下，受体体重应略高于供体，体重差异不应超过50 g。
DGS 中的血管直径也因大小和性别而存在显著差异。建议术前准备从 5-F 到 8-F 不同规格的套管，以便对 PV 和 IHIVC 吻合进行最佳选择。手工吻合也是 IHIVC 重建的一种可行方案。值得注意的是，DGS 的肝动脉相较于普通 SD 大鼠相对较粗，因此建议进行动脉吻合。我们已成功采用支架法进行动脉吻合14,17。然而，仍需进一步研究以评估动脉吻合的影响及其必要性.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了非传染性慢性疾病-国家科技重大专项（2023ZD0507600）和国家自然科学基金（82371794 和 82170671）的支持。同时受到浙江大学教育基金会、院士兰娟人才基金的资助。我们还要感谢威斯康星大学奥什科什分校的 Dana K. Merriman 教授在繁育十三纹地松鼠方面所做的工作，以及她在实验室繁育冬眠啮齿类动物模型方面慷慨分享的宝贵见解与经验。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带针的3-0缝线 | 金环医疗产品有限公司 | R315 | 用于皮肤缝合 |
| 7-0 丝线缝合线 | 布雷因特里，SCI公司 | SUT-S103 | |
| 7F 导引鞘 | 北京德迈医疗科技有限公司 | DQ07083818S | 用于IHIVC的袖带 |
| 8-0 缝合线带针 | 金环医疗产品有限公司 | H821 | 用于SHIVC吻合术 |
| 8F 导引鞘 | 北京德迈医疗科技有限公司 | DQ08083818S | 用于IHIVC的袖带 |
| 麻醉机 | RWD life Science Co. | R500 | |
| 止血电凝 | 宁波舜业医疗科技有限公司 | BDD-YE-DT-1 | |
| 布氏钳（微弯） | 金钟医疗器械有限公司 | XEC120 | SHIVC |
| 布托啡诺 | 天津药物研究院 pharmaceutical Co., Ltd | H12020275 | 止痛药 |
| 头孢呋辛钠 | Esseti Farmaceutici S.r.l | H20160013 | 抗生素 |
| 棉签 | 福清健康 &和整体医学 | 20230R | |
| 弯曲显微镊 | RWD生命科学有限公司 | F11031-11 | 外科手术器械 |
| 弯曲显微剪刀 | 66 Vision Tech Co., Ltd. | 54108B | 手术器械 |
| 纱布拭子 | 优贝医用材料有限公司 | 21080274 | |
| 肝素钠注射液 | 华北制药股份有限公司 | 2101131-2 | |
| 输液泵 | Howkmed有限公司 | HK-400 | |
| 异氟烷 | RWD生命科学有限公司 | 21070201 | |
| 微针持针器 | World Precision Instruments Co., Ltd. | 555408NT | 手术器械 |
| 微型血管夹 | RWD life Science Co. | R31005-06 | PV 和 IHIVC |
| 微型血管夹施夹器 | RWD生命科学有限公司 | R34001-14 | 手术器械 |
| 持针器 | RWD life Science Co. | F31025-13 | 腹部闭合 |
| 生理盐水 | 浙江天瑞药业有限公司 | 716092103 | |
| 直头微型镊子 | RWD生命科学有限公司 | F11029-11 | 手术器械 |
| 手术显微镜 | Leica | M650 | |
| 手术平台 | N/A | N/A | 定制，磁性 |
| 组织镊 | RWD生命科学有限公司 | F12002-12 | 手术器械 |
| 组织剪 | RWD生命科学有限公司 | S12003-09 | 手术器械 |
| UW 溶液 | 器官回收系统 | SPS-1 | 器官灌注与保存 |
参考文献
- Zeng, Q., et al. Successful orthotopic liver transplantation in mice utilizing microcomputed tomography angiography. J Vis Exp. (199), e65537(2023).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in ....
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