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方法文章

达乌尔黄鼠肝脏低温保存及移植研究

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DOI：

10.3791/68444

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2025年7月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education, 3NHC Key Laboratory of Organ Transplantation, 4Key Laboratory of Organ Transplantation, Chinese Academy of Medical Sciences, 5Organ Transplantation Clinical Medical Research Center of Hubei Province, 6Department of Hepatic Surgery and Liver Transplantation Center of the Third Affiliated Hospital, Organ Transplantation Institute, Sun Yat-sen University, 7Guangdong Province engineering laboratory for transplantation medicine, Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, 8Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 9College of Life Science, Shenyang Normal University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在达乌尔黄鼠（Daurian ground squirrel, DGS）中建立长期肝脏低温保存与移植模型的方案，该技术在标准啮齿类动物模型中一直具有较大挑战性。

摘要

在肝移植中，供体移植物在长时间冷保存后实现功能恢复是一个重大挑战。尽管标准啮齿类动物模型（如小鼠和大鼠）已有成熟的手术方案，但同样面临这一难题，从而限制了对移植后功能恢复及宿主-移植物免疫相容性等关键问题的研究。本文中，我们成功建立了一种新型肝移植模型，采用 obligate 休眠动物——达乌尔黄鼠（DGS；Spermophilus dauricus），该动物具有对极深度低温-复温以及缺血-再灌注转换过程的内在适应能力。在我们的实验条件下，达乌尔黄鼠受体在接受24小时冷保存后的肝脏移植后，在为期7天的观察期内存活率达到100%；而采用相同操作的Sprague-Dawley（SD）大鼠受体在术后24小时存活率为0%。因此，达乌尔黄鼠及其他耐寒哺乳动物模型为研究器官冷适应机制和移植耐受性提供了独特且可靠的平台，有助于推动移植医学领域新疗法或手术策略的发展。

引言

冷-复温以及缺血-再灌注是导致肝脏移植物损伤的重要因素，会增加早期移植物功能障碍的风险。尽管在小鼠和大鼠等标准啮齿类动物中进行的肝移植已成功建立1,2，但由于这些对低温敏感的物种在研究冷适应机制方面提供的信息有限，器官保存和移植医学的发展受到了阻碍。

在合适的冷适应物种中建立移植研究模型可能填补这一空白。例如，哺乳动物冬眠者已进化出适应长时间低温环境和/或食物匮乏的能力3,4。在冬眠期间，其生理状态会周期性地在蛰眠状态和阵发性觉醒状态之间转换，从而能够很好地适应低核心体温，并耐受快速复温及血液再灌注。值得注意的是，能够冬眠的地松鼠即使在活跃的恒温状态下，对缺血-再灌注损伤的耐受性也强于大鼠5,6。近年来，受冬眠动物启发的研究揭示了一些冷适应机制和可药物干预的靶点，这些靶点可通过调控显著减轻冷保存引起的损伤，并改善非冬眠物种离体组织和器官的功能恢复7,8,9,10,11。

本文方案改编自大鼠肝移植的既定操作流程12,13,14，现介绍一种适用于达乌尔黄鼠（DGS；Spermophilus dauricus）的肝脏获取、静态冷保存及移植方案。达乌尔黄鼠是一种分布于中国北方的冬眠啮齿类动物。在本研究条件下，无论供体处于常温（活跃）状态还是低温（蛰眠）状态，其肝脏在4 ˚C的威斯康星大学（UW）溶液中保存24小时后进行移植，受体达乌尔黄鼠的术后存活率均达到100%。相比之下，采用相同操作流程的Sprague-Dawley（SD）大鼠受体存活率为0%，明确显示出达乌尔黄鼠肝移植模型的优势。我们预计，在达乌尔黄鼠或其他实验室培育的耐寒物种（如十三条纹地松鼠（Ictidomys tridecemlineatus）和叙利亚仓鼠（Mesocricetus auratus））中，其他器官的长期冷保存与移植同样可实现，从而为研究人员提供独特的机会，用于研究移植物的长期功能恢复、宿主与移植物相容性，并测试新型药物。

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方案

所有动物实验均经北京大学实验动物护理与使用机构委员会批准（编号：LSC-WangSQ-2）。本研究中使用的关键仪器列于材料表中，并在图1中展示。

注意：在实验室环境中对野生捕获的冬眠啮齿类动物（如十三条纹地松鼠）进行饲养和繁殖的方法已有描述15,16。本研究中使用的地松鼠（DGS）由在张家口市草原捕获的怀孕雌性地松鼠在实验室中繁殖产生。实验时动物年龄约为1-2岁。对于最初捕获的怀孕雌性地松鼠，已在抵达实验室前清除寄生虫。动物到达实验室后进行了隔离，并检测常见病毒，检测结果为阴性的个体被保种饲养。

1. 术前准备

  1. 实验动物
    1. 使用成年地鼠（DGS），年龄1-2岁，雌雄不限，体重介于180 g至400 g之间，作为供体和受体。受体体重略大于供体，差异小于50 g。
    2. 对照组使用成年SD大鼠，年龄8-10周，雌雄不限，体重200-300 g，作为供体和受体。在整个实验过程中，需佩戴外科口罩、实验服和丁腈手套；在处理和转移DGS动物时，还需额外佩戴加厚皮革手套。
      注：大鼠的外科技术已在其他文献中充分记载。本文所述方案重点在于DGS的肝移植技术。
  2. 使用6 F和8 F的导入鞘分别制作门静脉（PV）和肝下下腔静脉（IHIVC）的套管。每个套管包括一个主体部分和长度为2 mm的延伸部分。用蚊式钳轻轻夹持套管，在其圆周上制作多个环形凹槽（图2）。
    注：PV和IHIVC的直径因DGS的体型和性别而有显著差异。因此，建议术前准备5-F、6-F、7-F和8-F的套管，以便术中适当选择。通常情况下，5-F或6-F套管适用于PV，而7-F或8-F套管适用于IHIVC。
  3. 使用手术刀将22 G和24 G静脉导管分别切成双斜面管状结构，作为胆管（3 mm）和肝动脉（2 mm）的支架。
    注：避免对支架施加过大压力，以免导致管腔狭窄或闭塞，影响受体存活。

2. 供体手术

  1. 初始步骤
    1. 使用5%异氟烷浓度（气流速1 L/min）进行麻醉诱导，2%异氟烷浓度（气流速1 L/min）维持麻醉。
    2. 将DGS置于仰卧位，固定于带有加热垫的板上，以维持术中体温。剃除腹部区域的毛发并进行消毒 用聚维酮碘和70%乙醇交替涂抹皮肤3次。
  2. 灌流前肝脏的分离
    1. 通过夹捏脚趾确认麻醉深度。从剑突延伸至耻骨联合，并横向至腋中线，做十字形切口。使用蚊式钳提起剑突，并在其后方放置一支5 mL注射器作为支撑。
    2. 横断镰状韧带。从膈下腔静脉（SHIVC）分离出左膈静脉，并用7-0缝线结扎。电灼肝脾韧带。
    3. 使用棉签仔细分离右肾静脉上方的下腔静脉（IHIVC）周围组织。用7-0缝线结扎近肝脏处汇入下腔静脉（IHIVC）的右肾上腺静脉和腰静脉。
    4. 在胆总管（CBD）前壁做一小切口。插入胆道支架，并用7-0丝线缝合固定。缝线一端留约5 mm长度，以利于后续与受体胆总管进行吻合。
    5. 分离肝固有动脉（PHA）、胃十二指肠动脉（GDA）和肝总动脉（CHA）周围的组织。
    6. 向阴茎静脉（雄性供体）或髂内静脉丛（雌性供体）注入1.5 mL肝素化生理盐水（300 IU/mL）。
  3. 肝脏灌注
    1. 在左肾静脉下方分离腹主动脉。将7号静脉注射针插入主动脉，并用夹子固定。
    2. 切开膈肌，并在胸主动脉上放置血管夹。
    3. 通过主动脉插管，使用输液泵以180–210 mL/h的速度向肝脏灌注20–30 mL冷UW溶液。切开胸腔内静脉和右肾静脉上方的下腔静脉（IHIVC），以使灌注液流出。
      注意：使用棉签调整肝叶位置，以确保灌注均匀，特别注意中叶和右叶。当整个肝脏呈现均匀的苍白色时，表明灌注完成。
    4. 灌注期间，切除胆囊。
      注意：与大鼠不同，豚鼠具有胆囊。为防止术后因胆汁凝固导致胆道阻塞，必须切除胆囊，并用UW溶液冲洗胆管。
  4. 灌注后肝脏移植物获取
    1. 使用显微镊子将门静脉从周围结缔组织中分离。用7-0缝线结扎并横断幽门静脉。在脾静脉水平横断门静脉主干。
    2. 远端结扎并切断胃十二指肠动脉（GDA）。在肝总动脉（CHA）前壁做一小切口。将肝动脉支架插入CHA，并用7-0丝线固定，留出一端约5 mm长，以利于后续与受体CHA的吻合。
    3. 尽可能靠近膈肌处解剖SHIVC。
    4. 分离尾状叶与胃之间的连接。切断背侧韧带后，充分游离肝脏。
    5. 将肝脏放入盛有冷UW溶液的7厘米钢碗中，将钢碗转移至4 °C冰箱中保存。
      注意：若肝脏冷保存时间超过24小时，需在UW溶液中添加抗生素以降低感染风险；建议每24小时更换一次UW溶液。

3. 离体 移植物制备

注意：准备一个敞开的冰容器。整个后桌操作均需在冰上进行。

  1. 用血管夹固定门静脉（PV）套管的手柄，并使用蚊式钳将其稳定。轻柔地将门静脉穿过套管，确保无扭曲发生。将门静脉翻折覆盖在套管上，并用7-0缝线固定（图3）。
  2. 对肝下腔静脉（IHIVC）套管重复上述操作（步骤3.1）。
  3. 经胆囊管向胆管灌注2 mL UW溶液，随后结扎胆囊管。
  4. 经门静脉套管向肝脏移植物冲洗8–10 mL冷生理盐水，以清除冷保存后的残留UW溶液。
  5. 在肝下腔静脉套管与肝脏右下叶之间的IHIVC段上放置一根7-0丝线缝线。
  6. 旋转肝脏以暴露其上表面。在短肝上腔静脉（SHIVC）两侧角处各放置一根8-0固定缝线，从外向内插入。

4. 受体操作

  1. 初始步骤请参考供体手术方案，并重复步骤 2.1。
  2. 受体肝脏游离
    1. 通过夹趾法确认麻醉深度。从剑突至耻骨联合行正中切口。使用蚊式钳将剑突向上牵拉，并在下方放置一支 5 mL 注射器以抬高下腔静脉（SHIVC）。将双侧肋弓向两侧牵开。
    2. 按照步骤 2.2.2 中所述进行韧带和血管的处理。
    3. 按照步骤 2.2.3 中所述游离肝下下腔静脉（IHIVC）。
    4. 切断肝脏与后腹膜之间的韧带附着。小心地将钝头镊子置于 SHIVC 后方，并在其周围放置一根 7-0 丝线缝线。
    5. 使用 7-0 丝线缝线在近端结扎胆总管（CBD），并在结扎线上方切断。用棉签轻轻分离胆管与门静脉（PV）。
    6. 在结扎线之间切断胃十二指肠动脉（GDA）和肝固有动脉（PHA）。在肝总动脉（CHA）末端创建一个 Y 形分叉。在 PHA 的结扎线上保留一段 2 cm 长的缝线以备后续使用。
    7. 游离门静脉（PV）的左右分支。在每一分支上各放置一根 5 cm 长的 7-0 固定缝线，以便后续操作。
  3. 受体肝脏切除
    1. 将异氟烷浓度降低至 0.5%，气流速度设为 0.5 L/min。
      注：通过调节异氟烷挥发罐维持约每秒一次的呼吸频率。在整个无肝期持续评估麻醉深度，以防止术中知晓或因麻醉过深导致呼吸抑制。
    2. 在右肾静脉上方夹闭 IHIVC，随后在幽门静脉上方夹闭 PV。使用 2 mL 注射器在 10 秒内向右 PV 注入 1.5 mL 生理盐水，以冲洗肝脏内的血液。
    3. 通过牵拉围绕 SHIVC 放置的 7-0 丝线缝线轻柔地向上牵拉膈肌，然后在 SHIVC 上应用血管夹，夹闭时包括部分膈肌组织。
    4. 在肝脏上方不远处切断 SHIVC。固定两侧 PV 分支上的 7-0 固定缝线，并在其上方切断 PV。紧贴肝实质切断 IHIVC。迅速切断所有残留的韧带连接，完整移除肝脏。
  4. SHIVC 重建
    1. 将移植肝正位放入腹腔。利用供体自带的 8-0 缝线，在受体 SHIVC 的两个角部从内向外穿线，作为固定缝线并打结固定。
    2. 使用血管夹轻轻向外牵拉右侧固定缝线的游离端，以对齐 SHIVC。
    3. 从左侧角开始，使用同一根缝线以连续缝合法缝合后壁，共 8–10 针。随后缝合前壁，共 10–12 针，从右向左进行。在完成前壁缝合之前，冲洗 SHIVC 腔以排出空气，防止空气栓塞（图 4）。
  5. PV 重建
    1. 利用置于 PV 两个分支上的 5 cm 固定缝线，通过血管夹轻柔向上牵拉，抬高 PV。在 PV 分支的中点处做一切口。
    2. 用肝素化生理盐水（300 IU/mL）冲洗 PV 管腔，然后将套管插入 PV 并用 7-0 丝线缝线固定。
    3. 依次松开 PV 和 SHIVC 上的血管夹，恢复移植物灌注，结束无肝期（图 5）。
  6. IHIVC 吻合操作参照 PV 步骤进行。先松开供体侧的 7-0 缝线，再移除受体侧的血管夹。
  7. 肝动脉重建
    1. 应用微血管夹阻断受体 CHA 的血流。
    2. 在受体 CHA 末端 Y 形分叉处做一小切口。用肝素化生理盐水（300 IU/mL）冲洗 CHA 管腔，然后将支架插入 CHA 并用 7-0 丝线缝线固定。
    3. 结扎供体和受体两侧的固定缝线，防止支架移位。松开微血管夹以恢复动脉血流（图 6）。
  8. 胆管重建：
    1. 在受体胆总管（CBD）前壁做一小切口。将胆管支架插入受体 CBD 管腔，并用 7-0 丝线缝线固定。
    2. 结扎供体和受体两侧的固定缝线，防止支架移位（图 7）。
  9. 重建操作完成后，使用连续锁边 3-0 缝线分两层关闭腹部切口（图 8）。
  10. 将受体动物置于清洁、加温的笼子中，在送回动物饲养设施前每 1–2 小时监测一次恢复情况。术后连续 3 天每日皮下注射布托啡诺（0.3 mg/kg）以提供镇痛。

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结果

手术操作的平均持续时间为：供体手术平均 24.8 ± 2.3 分钟，修肝操作 15.4 ± 1.3 分钟，受体手术 52.7 ± 5.1 分钟，无肝期 14.2 ± 1.5 分钟。

接受在低温 UW 溶液中保存 24 小时的肝脏移植物的大鼠，无论移植前是否处于冬眠状态（n = 8）或非冬眠状态（n = 4），术后 7 天的存活率均为 100%（图 9）。术后第 7 天未观察到血管闭塞现象。所有肝动脉均通过支架技术保持灌注。相比之下，所有接受其他 SD 大鼠提供的肝脏移植物、且同样在低温 UW 溶液中保存 24 小时的 SD 大鼠（n = 9），均在移植后 12 小时内死亡。

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讨论

在Kamada双袖套技术的基础上2，我们成功建立了首个用于DGS的原位肝移植模型。由于DGS与传统大鼠模型之间存在解剖学差异，因此在材料准备、手术操作及术后管理方面需采取特定的注意事项。

冬眠和脂肪储备等因素导致成年DGS个体体重存在显著差异，范围从150 g到400 g，且雄性和雌性之间有明显差别。因此，供体和受体的谨慎选择至关重要。理想情况下，受体体重应略高于供体，体重差异不应超过50 g。

DGS 中的血管直径也因大小和性别而存在显著差异。建议术前准备从 5-F 到 8-F 不同规格的套管，以便对 PV 和 IHIVC 吻合进行最佳选择。手工吻合也是 IHIVC 重建的一种可行方案。值得注意的是，DGS 的肝动脉相较于普通 SD 大鼠相对较粗，因此建议进行动脉吻合。我们已成功采用支架法进行动脉吻合14,17。然而，仍需进一步研究以评估动脉吻合的影响及其必要性...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了非传染性慢性疾病-国家科技重大专项（2023ZD0507600）和国家自然科学基金（82371794 和 82170671）的支持。同时受到浙江大学教育基金会、院士兰娟人才基金的资助。我们还要感谢威斯康星大学奥什科什分校的 Dana K. Merriman 教授在繁育十三纹地松鼠方面所做的工作，以及她在实验室繁育冬眠啮齿类动物模型方面慷慨分享的宝贵见解与经验。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带针的3-0缝线金环医疗产品有限公司R315用于皮肤缝合
7-0 丝线缝合线布雷因特里，SCI公司SUT-S103
7F 导引鞘 北京德迈医疗科技有限公司DQ07083818S用于IHIVC的袖带
8-0 缝合线带针金环医疗产品有限公司H821用于SHIVC吻合术
8F 导引鞘 北京德迈医疗科技有限公司DQ08083818S用于IHIVC的袖带
麻醉机RWD life Science Co.R500
止血电凝宁波舜业医疗科技有限公司BDD-YE-DT-1
布氏钳（微弯）金钟医疗器械有限公司XEC120SHIVC
布托啡诺天津药物研究院 pharmaceutical Co., LtdH12020275止痛药
头孢呋辛钠Esseti Farmaceutici S.r.lH20160013抗生素
棉签福清健康 &和整体医学20230R
弯曲显微镊RWD生命科学有限公司F11031-11外科手术器械
弯曲显微剪刀66 Vision Tech Co., Ltd.54108B手术器械
纱布拭子优贝医用材料有限公司21080274
肝素钠注射液华北制药股份有限公司2101131-2
输液泵Howkmed有限公司HK-400
异氟烷RWD生命科学有限公司21070201
微针持针器World Precision Instruments Co., Ltd.555408NT手术器械
微型血管夹RWD life Science Co.R31005-06PV 和 IHIVC
微型血管夹施夹器RWD生命科学有限公司R34001-14手术器械
持针器RWD life Science Co.F31025-13腹部闭合
生理盐水浙江天瑞药业有限公司716092103
直头微型镊子RWD生命科学有限公司F11029-11手术器械
手术显微镜LeicaM650
手术平台N/AN/A定制，磁性
组织镊RWD生命科学有限公司F12002-12手术器械
组织剪RWD生命科学有限公司S12003-09手术器械
UW 溶液器官回收系统SPS-1器官灌注与保存 

参考文献

  1. Zeng, Q., et al. Successful orthotopic liver transplantation in mice utilizing microcomputed tomography angiography. J Vis Exp. (199), e65537(2023).
  2. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat: technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
  3. Dausmann, K. H., Glos, J., Ganzhorn, J. U., Heldmaier, G. Hibernation in a tropical primate. Nature. 429 (6994), 825-826 (2004).
  4. Arnold, C. Hibernation science harnessed to treat obesity and modify metabolism. Nat Med. 30 (10), 2700-2703 (2024).
  5. Lindell, S. L., et al. Natural resistance to liver cold ischemia-reperfusion injury associated with the hibernation phenotype. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 288 (3), G473-G480 (2005).
  6. Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. The arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia. Stroke. 37 (5), 1261-1265 (2006).
  7. Zhang, L., et al. Cross-species metabolomic profiling reveals phosphocholine-mediated liver protection from cold and ischemia/reperfusion. Am J Transplant. 24 (11), 1979-1993 (2024).
  8. Zhang, X., et al. Cold-induced FOXO1 nuclear transport aids cold survival and tissue storage. Nat Commun. 15 (1), 2859(2024).
  9. Zhang, X., et al. 5-aminolevulinate improves metabolic recovery and cell survival of the liver following cold preservation. Theranostics. 12 (6), 2908-2927 (2022).
  10. Ou, J., et al. iPSCs from a hibernator provide a platform for studying cold adaptation and its potential medical applications. Cell. 173 (4), 851-863.e16 (2018).
  11. Ratigan, E. D., McKay, D. B. Exploring principles of hibernation for organ preservation. Transplant Rev (Orlando). 30 (1), 13-19 (2016).
  12. Chen, X. C., et al. Reduced complications after arterial reconnection in a rat model of orthotopic liver transplantation. J Vis Exp. (165), (2020).
  13. Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. J Vis Exp. (65), (2012).
  14. Nagai, K., Yagi, S., Uemoto, S., Tolba, R. H. Surgical procedures for a rat model of partial orthotopic liver transplantation with hepatic arterial reconstruction. J Vis Exp. (73), (2013).
  15. Vaughan, D. K., Gruber, A. R., Michalski, M. L., Seidling, J., Schlink, S. Capture, care, and captive breeding of 13-lined ground squirrels, Spermophilus tridecemlineatus. Lab Anim (NY). 35 (4), 33-40 (2006).
  16. Merriman, D. K., Lahvis, G., Jooss, M., Gesicki, J. A., Schill, K. Current practices in a captive breeding colony of 13-lined ground squirrels (Ictidomys tridecemlineatus). Lab Anim (NY). 41 (11), 315-325 (2012).
  17. Lehmann, T. G., Bunzendahl, H., Langrehr, J. M., Neuhaus, P. Arterial reconstruction in rat liver transplantation-a new tubing technique of the common hepatic artery. Transpl Int. 18 (1), 56-64 (2005).

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