快速诊断 结核分枝杆菌 基于实时荧光PCR的感染与耐药性检测

摘要

本文介绍了一种利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术检测Mycobacterium tuberculosis及其药物耐药性的实验方案。

摘要

结核病（TB）是一个重大的健康问题，对脆弱人群的影响尤为严重。耐药结核病的出现和传播对全球公共卫生构成了严重威胁。传统的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）诊断方法，如涂片显微镜检查和培养，存在显著局限性，常导致临床治疗延误。为应对这一挑战，已开发出一种基于实时荧光PCR的高效诊断方案。该方法可从检测样本中提取高质量的MTB核酸，并在关键耐药位点识别其耐药状态。与传统方法相比，该技术将检测时间显著缩短至数小时内，使患者在初次就诊后即可迅速确定感染及耐药情况。检测灵敏度超过85%，特异性达到95%。这种非侵入性技术不仅最大限度减少了患者的不适，而且由于其成本低、效率高，有助于在基层医疗机构实现准确诊断。总体而言，该方法代表了结核病诊断领域的重要进步。

引言

结核病（TB）是由Mycobacterium tuberculosis（MTB）引起的一种慢性传染病，是全球十大死因之一¹。耐药结核病（DR-TB）对结核病防控工作构成了重大挑战。中国疾病预防控制中心（中国CDC）发布的《无结核社区创建行动方案（2022—2027年）》强调，应对所有细菌学确诊的肺结核患者进行早期耐药筛查²。该方案提倡采用新型分子诊断技术，以提升耐药结核病的检出能力，缩短诊断周期，最大限度发现耐药结核病病例，确保规范化的治疗与管理，并落实必要的感染控制措施³。此外，《关于进一步加强耐药结核病防治工作的通知》（2023年第4号）要求在全国范围内推广先进诊断技术，督促对所有细菌学确诊的结核病患者及时开展耐药筛查，实现耐药筛查全覆盖，提高诊断的规范化水平，并增强医疗服务可及性⁴。

耐药结核病（DR-TB）指对至少一种抗结核药物产生耐药性的结核病病例。目前的分类包括利福平耐药（RR）、单药耐药、多药耐药、耐多药（MDR）、前广泛耐药（pre-XDR）和广泛耐药（XDR）结核病。一项关于耐药结核病流行病学的全球荟萃分析揭示了令人担忧的耐药率：耐多药结核病（MDR-TB）为11.6%，异烟肼耐药为15.7%，利福平耐药为9.4%，单药耐药为11.8%。这些数据凸显了耐药结核病的严重性和复杂性⁵。

利福平和异烟肼是结核病治疗的核心药物。然而，世界卫生组织（WHO）指出，尽管已有针对利福平耐药的快速诊断技术，但尚缺乏相应的异烟肼耐药检测工具。这一缺口阻碍了对耐多药结核病（MDR-TB）的及时诊断。该疾病的临时定义为 "利福平耐药结核病" 反映了这一诊断局限性，凸显了在快速检测对其他药物耐药性方面能力不足的问题^6,7据世界卫生组织估计，耐异烟肼结核病病例的流行率是耐利福平病例的两倍。仅依赖利福平耐药筛查可能遗漏异烟肼单耐药结核病（Hr-TB）。⁸未被检出的耐高异烟肼结核病（Hr-TB）患者若接受标准治疗方案，面临更高的治疗失败、复发以及发展为耐多药结核病（MDR-TB）的风险⁹乙胺丁醇耐药性同样令人担忧。作为结核病和耐多药结核病（MDR-TB）治疗的关键药物，中国2017年耐药结核病基线调查报告显示，新发病例中乙胺丁醇耐药率为4.9%，复治病例中为17.2%¹⁰.

目前，对于残留结核分枝杆菌耐药性的检测，人工培养仍是部分实验室的首选方法，但实时荧光PCR技术在结核病耐药性检测方面优于传统方法：在检测与定量方面，实时荧光PCR通过实时监测荧光信号提供精确的定量分析，而传统方法缺乏这种准确性。传统实验方法耗时长、劳动强度大，需要经过培训的专业人员操作，且主观性强。相比之下，实时PCR通过计算机捕获荧光探针和信号，最大限度地减少了人为误差。传统的数据分析方法更具主观性，而实时PCR则通过扩增曲线、标准曲线等分析手段实现准确且客观的分析。这些进步使实时荧光PCR成为检测结核分枝杆菌耐药性的首选方法¹¹。

总之，耐药结核病（DR-TB）已成为全球性危机。对异烟肼、利福平和乙胺丁醇等关键药物的耐药性进一步加剧了结核病防控的难度。及时且准确地检测药物耐药性对于指导个体化治疗方案、提高治疗成功率以及遏制耐药结核病的威胁至关重要。

为应对诊断挑战，本研究采用了一种试剂盒，该试剂盒利用痰液样本可在3.5小时内鉴定Mycobacterium tuberculosis并检测耐药突变，此过程依托实时荧光定量PCR（qPCR）技术实现。该方法操作简便、成本低廉且准确可靠，是抗击耐药结核病（DR-TB）的有力工具。

方案

本研究已获得新疆生产建设兵团第五师医院伦理委员会批准，伦理批号为LLWYH2025001，不存在伦理冲突。所用试剂和设备详见材料表。

1. 样品采集

1. 使用世界卫生组织（WHO）推荐的国际标准化带螺旋盖的痰液采集瓶，或密封塑料盒和蜡纸盒来收集痰液样本。
2. 在痰液容器上标注患者姓名、编号（初诊患者的门诊序号或复诊患者的登记号）、检查项目以及容器顺序编号1、2、3（1 = 当日即时痰，2 = 夜间痰，3 = 次日晨痰）。对于无痰患者，可通过雾化诱导痰液采集法收集样本。
   注意：工作人员应评估所采集痰液样本的质量。样本量一般应维持在 3–5 mL。合格样本包括干酪样痰、褐色带血痰、含少量新鲜血液的痰或黏液痰。不合格样本（如唾液）应在进一步指导后重新送检。

2. 痰液预处理

1. 根据所采集痰液的体积，向痰液容器中加入其体积1至2倍的4% NaOH溶液。振荡并混合内容物2分钟。
2. 将容器置于生物安全柜中，室温下静置15分钟，在此期间多次振荡以确保痰液完全液化。
   注意：NaOH具有腐蚀性，操作时需小心。若痰液未完全液化，可延长振荡时间。此步骤在整个实验过程中尤为重要。

3. 试剂准备（PCR前区域）

1. 试剂准备：在指定的PCR前区域准备试剂。将冷冻试剂解冻至室温，涡旋振荡5–10秒，然后在室温下以3000 × g 离心5–10秒。
   注意：该试剂为双体系（A/B），必须分别配制。
2. PCR主混合液的配制
   1. 混合液A：取一个1.5 mL微量离心管，加入(n + 3) × 19.6 µL的RIF PCR Mix A和(n + 3) × 0.4 µL的TB酶。涡旋振荡5–10秒，在室温下以3000 × g 离心5–10秒（PCR Mix A：60 µL）。
   2. 混合液B：另取一个1.5 mL微量离心管，加入(n + 3) × 19.6 µL的RIF PCR Mix B和(n + 3) × 0.4 µL的TB酶。操作同上，进行涡旋振荡和离心（PCR Mix B：60 µL）。
3. 储存与使用：将配制好的主混合液储存于≤−18 °C。若不立即使用，应在4小时内使用完毕。
   注意：该方案同样适用于EMB和INH试剂。
4. 分装PCR主混合液：将20 µL的PCR Mix A和Mix B分别分装至不同的PCR薄壁反应管中。将分装后的反应管放入密封袋中，转移至核酸提取区域。

4. 核酸提取与样品上样（提取区域）

1. 将1.2 mL完全液化的痰样本在室温下以15,058 × g 离心5分钟。弃去上清液，保留沉淀。可选：若设备允许，可对整个消化后的样本进行离心。
2. 用1.2 mL生理盐水重悬沉淀，涡旋混匀后在室温下以15,058 × g 离心5分钟。重复此洗涤步骤三次。
3. 向沉淀中加入250 µL结核杆菌提取缓冲液，涡旋混匀，并在99 °C下进行热裂解10分钟。冷却至室温后，在室温下以15,058 × g 离心1分钟，收集上清液（即提取样本）。
   注意：对于黏稠样本，可增加液化缓冲液体积或延长涡旋时间。若样本仅用于DNA提取，应延长液化时间以确保完全消化。
4. 使用微量移液器将5 µL提取样本或阴性/阳性对照加入各PCR薄壁反应管中。立即密封各管并正确标记。
5. 将装有样本的PCR管涡旋5-10秒，并短暂离心（5-10秒）。随后将PCR管转移至PCR扩增区域。

5. PCR 扩增（扩增区域）

注意：利福平、乙胺丁醇和异烟肼耐药检测程序已在红石PCR仪上设定（表1、表2和表3），循环条件已包含在内。

1. 将已加样的PCR薄壁反应管放入热循环仪中进行扩增。
2. 进入热循环仪操作界面，点击实验向导，选择实验类型为标准熔解曲线（如图1所示）。
3. 点击板编辑器，横向选择两个相邻的空白孔位，并从右侧面板中分配相应的药物模板以定义一个样本（如图2所示）。
4. 设置阴性/阳性对照及样本信息，点击开始启动程序。运行时间为2小时22分钟。
5. 程序结束后，将密封的PCR薄壁反应管转移至密封袋中，封好袋口，并按生物危害废物处理。
6. 在热循环仪上点击分析以处理数据。
   注：本方法的检测限如下：复合组：10 细菌/mL；利福平：20,000 细菌/mL；异烟肼：10,000 细菌/mL；乙胺丁醇：10,000 细菌/mL。（检测限（LoD）数据来源于试剂说明书提供的765例临床样本的统计分析。）

6. 结果解读

1. 通过比较测试样本与阳性对照的熔解温度（Tm）差异来确定突变情况。
   ​注意：野生型（药物敏感型）：样本在四个通道中的 Tm 值均与阳性对照相符（偏差 ≤1 °C）。突变型（药物耐药型）：任一通道中的 Tm 值比阳性对照低 ≥2 °C（ΔTm ≥2 °C）。

结果

本研究采用实时荧光PCR结合熔解曲线分析，对17例结核病患者的痰液样本进行了检测。此外，另有30例患者接受了 利福平 耐药性检测，其中20例进行了耐药性测试 异烟肼 和 乙胺丁醇实时荧光PCR方法对目标物的阳性检出率达到88.2% 结核分枝杆菌 复合物。

利福平的耐药率为13.3%，异烟肼为15.0%，提示部分患者可能存在耐药情况。大量样本未检出耐药性（利福平为26.7%，异烟肼为20.0%），可能与细菌载量较低或检测方法的敏感性问题有关。 乙胺丁醇 耐药性检出率相对较低，为5.0%，但有45.0%的样本未检出，显示出该方法在检测乙胺丁醇耐药性方面存在局限性。建议将此方法与其他方法（如基因测序）联合使用，以提高检测准确性。

检测...

讨论

在全球范围内，结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC）耐药菌株的出现已显著增加了结核病（TB）患者治疗的复杂性。特别是耐多药（MDR）和广泛耐药（XDR）结核病，对结核病的防控构成了严峻挑战¹²。快速检测耐药性对于制定合理的治疗方案、防止治疗失败以及遏制耐药菌株的进一步传播至关重要^13,14。基于核酸扩增技术（NAAT）的检测方法（如实时荧光PCR）因其良好的稳定性及较短的检测周期，已在结核病诊断中得到广泛应用¹⁵。然而，要被认可为一种经过验证的用于结核病诊断的NAAT方法，该检测技术必须具备高可靠性、高灵敏度、高特异性和良好的可及性¹⁶。大多数基于PCR的结核病检测方法以IS6110为靶标，用于肺部及肺外样本中结核分枝杆菌（MTB）的鉴定。据报道，与培养法相比，基于IS6110序列的PCR检测在不同...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
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结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变检测试剂盒	厦门智山生物科技有限公司	24030801
结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测试剂盒	厦门智山生物科技有限公司	24011101
结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒	厦门智山生物科技有限公司	24031001
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