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无血液污染的小鼠鼻腔灌洗液采集

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DOI：

10.3791/68451

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2025年7月11日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Kindai University Faculty of Medicine, 2Department of Arts and Sciences, Kindai University Faculty of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种避免小鼠鼻腔灌洗液（NLF）中血液污染的新方法。由于该方法可确保收集无血液污染的NLF，因此能够更准确地检测免疫组分及多种呼吸道病原体。

摘要

上呼吸道样本，包括鼻灌洗液（NLF）和鼻拭子，可用于检测引起呼吸道疾病的病原体，例如病毒和细菌。NLF 已被用于研究呼吸系统中的细胞和体液成分，例如评估黏膜疫苗接种后免疫球蛋白（Ig）A 的诱导情况。在实验啮齿类动物中，NLF 样本可通过经咽部或经气管途径采集。尽管已有报道称经咽部途径采集 NLF 样本的效率高于经气管途径，但经咽部途径采集的 NLF 样本常被血液污染，从而影响原始 NLF 样本中细胞和体液成分的水平。因此，本研究旨在建立一种新的实验小鼠 NLF 采集方法，以最大限度减少血液污染。简言之，在分离小鼠下颌之前，先将棉球置于口腔内以吸收血液。待出血停止后，将微量移液器插入后鼻孔，用 200 µL 磷酸盐缓冲液冲洗两次（最终体积：400 µL/只小鼠），以收集 NLF 样本。为检测血液污染，采用了一种简单且灵敏的法医用鲁米诺试验来检测血红蛋白。鲁米诺试验显示，采用传统方法（不使用棉球）采集的 NLF 样本中可检测到血液污染，而采用新方法（使用棉球）采集的样本中则未检测到。由于血液污染的存在，采用传统方法采集的 NLF 样本中总 IgA 和 IgG 浓度高于新方法采集的样本；已知血液中的 IgA 和 IgG 水平远高于 NLF。因此，该独特方法可作为一种简单且灵敏的方法，用于从实验小鼠中采集无血液污染的 NLF 样本。

引言

在临床和基础研究中，适当的样本采集方法对于评估结果至关重要。鼻腔灌洗是一种用于分析呼吸道中细胞和体液成分的灌洗技术1,2,3。临床上，鼻腔灌洗液（NLF）已被用作生物标志物发现的有效非侵入性样本，多项研究支持其在多种呼吸系统疾病中的应用，包括鼻窦炎、囊性纤维化和一般性呼吸系统疾病4,5,6,7。在实验动物中，NLF也被用于研究呼吸系统疾病模型，包括流感、2019冠状病毒病（COVID-19）和过敏性疾病3,8,9。该方法广泛用于测定关键炎症生物标志物，如多形核细胞和细胞因子，这些指标常被用于评估对过敏原、哮喘和呼吸道感染的反应10,11,12。最近，为了评估潜在鼻内疫苗候选物的有效性和安全性，常从实验动物采集NLF样本，并定量检测NLF样本中病原体和免疫球蛋白（Ig）的水平作为评价指标13。

在实验小鼠中，鼻腔灌洗液（NLF）可通过经咽部或经气管方法采集。在经咽部方法中，将包括腭咽区域的小鼠头部与喉部分离，然后通过咽部开口将导管插入至后鼻孔，注入磷酸盐缓冲液（PBS），并从鼻孔收集NLF14。经气管方法则通过气管进入呼吸道，无需切断头部，从而从鼻孔收集NLF，以最大限度降低血液污染的风险。尽管这两种主要方法已被用于实验小鼠的NLF采集，但两种传统方法均存在各自的局限性。研究表明，由于经气管灌洗液可能泄漏至口腔，经气管方法所获得的NLF量低于经咽部方法。先前的研究显示，在注入PBS后，经气管法和经咽部法回收的NLF液体积分别为70%–80%和90%–100%14。尽管经咽部方法可获得较经气管方法更多的NLF，但在操作过程中不可避免地会出现一定程度的血液污染14,15。类似地，多项研究报道，NLF样本常被高水平的血清蛋白污染16,17,18。这可能会干扰呼吸道疾病特异性生物标志物在NLF中的检测与定量分析19。此外，由于血液中的IgA和IgG含量远高于NLF，这种污染也可能影响NLF样本中免疫球蛋白（Ig），特别是IgA和IgG的浓度。

为应对这些挑战，本研究旨在建立一种独特、简单且可靠的经咽部方法，用于从实验小鼠采集鼻腔灌洗液（NLF）样本，以最大化样本产量并最小化血液污染。在实验过程中，将棉球置入小鼠口腔内以抑制血液污染，随后注入磷酸盐缓冲液（PBS），从鼻孔收集NLF样本。采用法医学技术——基于鲁米诺的化学发光法测定NLF中的血液污染水平，该方法可对NLF样本中的血红蛋白（Hb）水平进行半定量分析；采用新方法收集的NLF样本中鲁米诺反应呈阴性。因此，当前这一新方法可提高NLF样本质量，适用于多种生物学实验，如抗体酶联免疫吸附测定（ELISAs）、细胞因子谱分析、免疫学和医学生物标志物检测，以及小鼠呼吸系统疾病模型研究。

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方案

所有实验操作均经近畿大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并依照美国国立卫生研究院（NIH）提出的标准进行20。本研究使用8周龄雄性C57BL/6小鼠。本研究中所用试剂和设备的信息列于材料表中。

1. 鼻腔灌洗液采集

  1. 根据机构批准的方案，使用 5% 异氟烷处死小鼠21。
  2. 将小鼠仰卧于手术板上，并通过固定四肢将其固定。
  3. 使用 1 mL 注射器从心脏采血。
  4. 使用剪刀切开腹腔，暴露内脏器官和膈肌。
  5. 用剪刀切开膈肌和肋骨，使右心房可见。
  6. 用剪刀穿刺右心房以进一步清除血液。
  7. 在牵拉舌头的同时，将三个棉球塞入动物口腔内。
  8. 在抬高头部（鼻部朝上位置）的同时，用剪刀分离下颌，以防止鼻腔灌洗液（NLF）被血液污染。
  9. 更换新的棉球，以避免血液污染。
  10. 待出血停止后，向后鼻孔注入 200 µL 无菌 PBS，并将从鼻孔排出的鼻腔灌洗液（NLF）收集至 1.5 mL 离心管中。
  11. 重复步骤 1.10 一次。

2. 使用鲁米诺化学发光法检测血液污染

  1. 使用1.5 mL离心管，将1 mg鲁米诺和5 mg过氧化钠（Na2O2）溶于1 mL无菌水中，配制储备液。
    注：终浓度为1 mg/mL鲁米诺和5 mg/mL Na2O2。
  2. 用铝箔包裹离心管，4 °C保存备用。
  3. 用去离子水将储备液稀释10倍，得到工作液。
    注：终浓度为0.1 mg/mL鲁米诺和0.5 mg/mL Na2O2。
  4. 将2 µL NLF样本加入96孔板的孔中。
  5. 向每孔加入100 µL稀释后的鲁米诺溶液。
  6. 短暂振荡96孔板，使样本与鲁米诺溶液充分混匀。
  7. 在暗处直接观察鲁米诺的化学发光现象。
  8. 如有需要，可使用发光仪对血红蛋白浓度进行半定量分析。

3. 通过ELISA定量测定IgA和IgG

  1. 在96孔板的各孔中加入100 µL/孔的总抗小鼠IgA（20 ng/孔；200 ng/mL）或IgG（10 ng/孔；100 ng/mL）抗体进行包被 （参见 材料表).
  2. 密封培养板，于4 °C过夜孵育。
  3. 用 300 μL/孔的溶液洗涤平板三次 含0.05% Tween 20的洗涤缓冲液 每次用 PBS 洗涤后，将平板在纸巾上拍干。
  4. 每孔加入 200 µL 含 10% 胎牛血清（FBS）和 0.2% Tween 20 的 PBS 稀释液。
  5. 将培养板在室温（RT）下孵育60分钟。
  6. 吸去检测稀释液，然后将酶标板在纸巾上拍干。
  7. 使用检测稀释液配制100 ng/mL的小鼠IgA或IgG标准品，并进行2倍系列稀释：50 ng/mL、25 ng/mL、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.13 ng/mL、1.56 ng/mL和0.78 ng/mL。
    注意：每孔所需各标准品体积为 100 µL。
  8. 用适当的稀释液将样本稀释：血清（104 至 106），NLF（10、50、200 和 500），以及 BALF（101 至 104).
    注意：每个样本每孔所需体积为 100 µL。
  9. 向相应的孔中加入 100 µL 的 IgA 或 IgG 标准品及样品。
  10. 室温孵育平板75分钟。
  11. 用洗涤缓冲液每孔300 µL洗涤平板三次，每次洗涤后将平板在纸巾上拍干。
  12. 稀释辣根过氧化物酶标记的抗小鼠F(ab')₂片段抗体2 抗体（参见 材料表) 用适当的稀释倍数的检测稀释液：104倍比稀释
    注意：每孔所需体积为 100 µL。
  13. 加入100 µL稀释后的辣根过氧化物酶标记的抗小鼠F(ab')2 每孔加入抗体。
  14. 室温孵育平板75分钟。
  15. 用洗涤缓冲液每孔300 µL洗涤5次，每次洗涤后将酶标板在吸水纸上拍干。
  16. 每孔加入 100 µL 含四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢的底物溶液。
  17. 将培养板在室温下孵育5分钟。
  18. 加入 50 µL 终止液，2 N 硫酸（2N H2SO4)，加入每个孔中。
  19. 使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。
  20. 利用标准曲线测定每个样本中IgA和IgG的浓度。

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结果

采用传统方法或新型方法，通过经咽途径从C57BL/6小鼠采集鼻腔灌洗液（NLF）样本。如图1所示，采用传统方法采集的NLF样本呈轻微粉红色（图1A）；而采用新型方法采集的NLF样本则透明清澈（图1B）。由于该差异似乎源于传统方法采集过程中NLF样本中的血液污染，因此使用鲁米诺反应检测了NLF样本中的血液污染情况。如图2所示，采用传统方法采集的NLF样本中化学发光呈阳性，表明存在血液污染（图2A）；而采用新型方法采集的NLF样本中化学发光呈阴性（图2B）。为排除小鼠本身可能存在出血倾向，还采用标准的经气管灌洗法收集了支气管肺泡灌洗液（BALF）；该BALF样本未见血液污染。上述结果表明，新型NLF采集方法优于传统方法。

为了确定鼻...

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讨论

鼻腔灌洗是一种获取呼吸系统疾病（如流感和 COVID-19）生化、细胞学及生物学信息的重要技术23。除了可鉴定多种浸润性细胞外，还可通过 ELISA、免疫印迹和定量聚合酶链式反应等多种方法，分析鼻腔灌洗液（NLF）样本中呼吸道的非细胞成分1,19,24。本研究采用两种不同的 NLF 采集方法——传统方法与新方法——进行了比较。研究结果表明，血液污染会影响 NLF 中 IgA 和 IgG 的浓度。由于血液污染最可能发生在下颌分离过程中，因此建立了一种简单的新方法：在小鼠口腔内放置三个棉球，以吸收血液并阻止样本流向口腔，从而避免了 NLF 中的血液污染。因此，这种采集 NLF 的新方法比传统方法更为准确。

鲁米诺化学发光已用于刑事侦查中检测犯罪现场的血液；其原理基于血红蛋白（Hb）类似过氧化物酶的活性对底物的氧化作用，在暗场条件下鲁米诺试剂会发出可见的蓝...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢近畿大学医学院微生物学系的Seiichi Omura博士、Cong Thanh Nguyen医学博士、哲学博士、Kota Moriguchi医学博士、哲学博士、Reona Shiro医学博士以及Sandesh Rimal理学硕士，以及大阪大学微生物病研究前沿中心BIKEN创新疫苗研究联盟实验室病毒疫苗组的Hirotaka Ebina博士、Shinya Okamura博士和Yasuo Yoshioka博士提供的有益讨论。我们还向近畿大学生命科学研究所以及其成员致以诚挚谢意，感谢他们提供的出色技术协助。本研究工作得到了日本文部科学省通过文部科学省奖学金（MEXT，2021–2025）（I.A.）、日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金KAKENHI项目JP23K06493（F.S.）、JP21K07287/JP24K10500（A.-M. P.）和JP22K18378/JP24K10163（I.T.），以及近畿大学研究推进资助项目KD2406（F.S.）和KD2506（I.T.）的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物固定针日本东京市，Natsume Seisakusho有限公司KN-358-A我们使用动物固定针固定小鼠。该固定针为不锈钢材质；总长度23 mm；针尖长度15 mm。
BD OptEIATM TMB 底物试剂盒BD 生物科学公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥555214我们加入了100 μ每孔加入 TMB 底物溶液 L。
钟罩NANA我们使用钟形罩进行麻醉。
透明平底免疫非无菌96孔板 赛默飞世尔科技，美国纽约州罗切斯特442404我们采用带有MaxiSorp表面处理的透明平底非无菌96孔免疫板进行酶联免疫吸附测定。
棉球日本东京Sansho有限公司94-1951我们使用棉球以避免血液污染。棉球的直径为7 mm。
胎牛血清Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市172012-500 ML在检测稀释液中加入10%胎牛血清。
镊子（用于科研实验的微型镊子，弯头）日本东京，山椒有限公司91-1506我们使用解剖镊进行解剖。型号：HSC 551-10；总长度：105 mm。
镊子（精密镊）日本东京，山椒有限公司91-2772我们使用解剖镊进行解剖。型号：HSC 607-12；总长度：120 mm；尖端直径：0.3 mm。
山羊抗小鼠IgA-UNLBSouthernBiotech，美国阿拉巴马州伯明翰1040-01我们使用100 μL的溶液对96孔透明平底免疫非无菌板进行了包被 μ每孔 L（每孔 20 ng）总免疫球蛋白 A。
异氟烷 Viatris Inc.，美国宾夕法尼亚州卡农斯堡NA我们使用异氟烷进行麻醉。
鲁米诺反应试剂盒日本大阪市，富士胶片和光纯药株式会社124-06511我们使用鲁米诺反应试剂盒检测NLF样本中的血红蛋白。
微量离心管日本东京沃森有限公司131-7155C我们使用了  用于收集NLF和BALF的微量离心管（1.5 mL带锁盖、圆底、软触盖的微量离心管）
Milli-Q 水德国达姆施塔特默克公司Milli-Q Direct 8我们使用MilliQ水配制鲁米诺反应溶液。
Mini-Shaker PSU-2TBiosan有限公司，拉脱维亚里加PSU-2T我们使用 Mini-Shaker PSU-2T 振荡 96 孔板。
小鼠品系CLEA Japan, Inc.，日本东京NA我们使用了4个月大的C57BL/6雄性小鼠。
Nunc MicroWell 96孔，Nunclon Delta处理，平底微孔板赛默飞世尔科技 Nunc A/S，Kamstrupvej，罗斯基勒，丹麦136101我们使用了 NuncTM 微孔板TM 用于鲁米诺试验的96孔Nunclon Delta处理平底微孔板
辣根过氧化物酶标记的AffiniPure F(ab')2 片段化山羊抗小鼠IgG，F(ab')2 片段特异性（对人、牛和马血清蛋白的交叉反应最小）Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.，美国宾夕法尼亚州西格罗夫115-036-072我们加入了100 μ辣根过氧化物酶标记的AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG，F(ab')2 片段特异性检测抗体（10,000倍稀释）加入各孔。
磷酸盐缓冲液Sigma-Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市D8537-500ML我们使用杜氏磷酸盐缓冲液（无氯化钙和氯化镁的改良型，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养）进行NLF和BALF的收集。
移液器 日本东京沃森有限公司NA我们使用了200-μ用于鼻腔灌洗的L型移液管。
移液器吸头日本东京沃森有限公司NA我们使用了200-μ用于鼻腔灌洗的L型多适配移液器吸头
聚氧乙烯（20）失水山梨醇单月桂酸酯（Tween 20）日本大阪市，富士胶片和光纯药株式会社167-11515在洗涤缓冲液中加入0.05%的Tween 20，在检测稀释液中加入0.2%的Tween 20。
纯化的山羊抗小鼠IgG（最小交叉反应性）抗体BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥405301我们使用100 μL的溶液包被了96孔透明平底免疫非无菌板 μ每孔总免疫球蛋白 G 10 纳克（10 ng/孔）。
小剪刀，双头日本东京，山椒有限公司91-7005我们使用解剖剪进行解剖。型号：S-4A；总长度：115 mm。
硫酸和光纯药工业株式会社，日本东京192-04755我们加入了50 μ每孔加入 L 的 2 N 硫酸以终止反应。
Surflo 静脉留置针 日本东京 Terumo Corporation SR-FS2032我们使用Surflo静脉导管经气管注入PBS进行支气管肺泡灌洗。导管规格：20G；导管长度：32 mm；导管内径：0.80 mm；导管外径：1.1 mm；内置针：22G。
手术直剪日本东京，山椒有限公司91-7004我们使用解剖剪进行解剖。型号：S-3B；总长度：120 mm。
外科手术板日本东京市，NATSUME 制作所有限公司KN-321-B我们使用一块软木板进行解剖。尺寸为深20 cm、宽15 cm、高3 cm。
Synergy H1 多功能酶标仪 安捷伦科技有限公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉市NA使用Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader在450 nm处测定样品的吸光度。
注射器日本东京泰尔茂株式会社 SS-01T我们使用1 mL注射器从心脏采集血液。
穿线 Niccho Kogyo Co., Ltd. 东京 日本NA我们用缝线将导管固定，以确保操作过程中位置正确。

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