该方案可在6-8小时内分离获得足够的原代软骨细胞，有助于进一步深入研究软骨生物学及软骨疾病机制。
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该方案可在6-8小时内分离获得足够的原代软骨细胞，有助于进一步深入研究软骨生物学及软骨疾病机制。
关节软骨破坏会导致软骨细胞活性改变，这是多种软骨疾病（包括骨关节炎（OA）和类风湿关节炎（RA））发生的主要致病因素之一。作为软骨中最主要的细胞类型，深入研究软骨细胞的生物学特性对于开发有效的疾病治疗策略至关重要。原代软骨细胞的分离与培养为研究软骨疾病提供了重要的实验材料，有助于揭示软骨损伤与修复的机制。本实验方案详细描述了 体外 从小鼠来源的原代软骨细胞分离与培养方法。通过采用优化的胶原酶II方案，可在8小时内完成新生小鼠膝关节软骨组织的软骨细胞分离。每毫克软骨组织的细胞得率约为1-2 × 10³个细胞，具体数值随组织新鲜程度和初始细胞密度而有所差异；所分离的细胞表现出 >90% 存活率。本方案以小鼠原代软骨细胞为例，展示分离后培养 1、2 和 5 天的细胞形态特征和贴壁状态。逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和蛋白质印迹实验表明，白细胞介素-1β（IL-1β）处理降低了 II 型胶原 α1（Collagen Type II Alpha 1，Col2a1）以及基质金属蛋白酶13（Matrix Metallopeptidase 13，MMP13）水平升高（Mmp13 表达，证实分离的软骨细胞能够响应炎症刺激。与传统方法相比，本方案采用较高的胶原酶浓度，以缩短分离时间对细胞活力的不利影响，同时避免胰蛋白酶处理可能造成的细胞损伤。所获得的原代软骨细胞纯度高、活力良好，适用于软骨损伤相关机制的深入研究，具有重要意义 体外 软骨疾病的基础研究与临床治疗。
关节软骨破坏是多种软骨疾病（如骨关节炎和类风湿关节炎）的主要病因1,2。软骨细胞是软骨中的主要细胞类型，对于维持软骨稳态以及在损伤后促进修复至关重要3。软骨细胞活性的改变不仅影响软骨的结构完整性，还可诱发炎症反应并导致进行性组织退变4。因此，深入研究软骨细胞的生物学特性对于阐明这些疾病的发病机制具有重要意义。
近年来，软骨细胞在炎症反应中的作用受到越来越多的关注。研究表明，白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性细胞因子会显著破坏软骨细胞的代谢过程，导致基质降解酶的表达增加以及基质合成减少5,6,7这些变化最终导致软骨的逐渐退化和关节功能障碍。因此，研究软骨细胞在病理条件下发生的生物学改变对于 体外 建立模型已变得尤为迫切。在传统二维（2D）单层培养的基础上，近年来三维（3D）软骨细胞培养和类器官技术在软骨相关研究中得到 increasingly 广泛的应用。这些优化的体系提供了更接近生理状态的微环境，有助于深入理解软骨细胞在疾病背景下....
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所有动物实验均经西安红会医院伦理委员会批准（编号：202309009），实验操作严格遵循动物实验的替代、减少和优化3R原则。
图1A 展示了试剂与设备准备的示意图。材料表 包含本实验方案中所用试剂和设备的相关信息。
1. 实验小鼠
注意：本研究使用了四只3日龄的野生型C57BL/6J小鼠。
2. 软骨标本的采集与处理
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如所述 图1, 图2，以及 图3，我们执行了该方案，并成功地从小鼠膝关节中分离出原代软骨细胞。从约10 mg新生小鼠软骨组织中，获得了约1 × 104 细胞与 >90% 存活率。在第一天 体外 培养初期，原代小鼠软骨细胞呈圆形，多数细胞悬浮，尚未完全贴附于培养皿底部。第2天，部分细胞开始贴壁，并逐渐适应体外培养环境。第5天，在DMEM/F12培养基中，细胞生长旺盛，几乎所有细胞均已贴壁，并呈现正常增殖状态（图 4A大约每3天，细胞完成一个增殖周期，细胞形态呈典型的多边形，表现出较高的活力和增殖速率。
COL2A1 是软骨基质中的主要胶原成分，在维持软骨结构与功能方面发挥关键作用19,
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分离与培养原代软骨细胞对于阐明软骨疾病病理生理机制至关重要22在原代软骨细胞培养中，优化胶原酶浓度和消化时间至关重要，因其需在降解细胞外基质的同时，尽量减少对细胞的潜在损伤17. 本文中，我们描述了一种从小鼠软骨组织中分离原代软骨细胞的可靠且可重复的方法。采用该方法，可获得约1-2 × 103 每1毫克小鼠软骨组织可获得软骨细胞。该方法能够快速分离出足够数量的原代软骨细胞，具有高度可重复性和实用性。分离得到的软骨细胞保持其典型的形态和功能特性 体外从而促进对软骨细胞基因表达变化的研究以及与软骨代谢相关的功能检测。此外，这些细胞还可用于高级应用，例如三维软骨培养实验。8.
已有多种原代软骨细胞分离方案被报道并应用于研究，但每种方法均存在明显缺陷。通常，采用低浓度酶（例如1 mg/mL胶原酶II）在37 °C条件下消化软骨组织14–16小时。尽管该方法可获得较高的细胞得率，但长时间的酶处理可能导致细胞活力.......
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作者声明不存在利益冲突。
本工作由国家自然科学基金（编号：82370909）资助。图1、图2和图3使用Figdraw绘制。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1× PBS粉末（2 L） | Servicebio | G0002-2L | |
| 100 mm细胞培养皿 | Servicebio | CCD-100 | |
| 100 μm细胞筛 | Sangon Biotech | F613463-0001 | |
| 15 mL锥形离心管（无菌，无酶） | Servicebio | EP-1501-J | |
| 50 mL锥形离心管（无菌，无酶） | Servicebio | EP-5001-J | |
| 6孔细胞培养板 | Servicebio | CCP-6H | |
| 抗COL2A1兔多克隆抗体 | Immunoway | YT1022 | 一抗；WB：1/500 |
| 抗GAPDH鼠单克隆抗体 | Proteintech | 60004-1-IG | 一抗；WB：1/2000 |
| 抗MMP13兔多克隆抗体 | Immunoway | YT2796 | 一抗；WB：1/1000 |
| 无菌超净工作台 | Thermo Fisher | 51029704 | |
| 细胞培养孵育箱 | Thermo Fisher | 51033782 | |
| 胶原酶II | Solarbio | C8150 | |
| 定制引物（Gapdh, Col2a1, Mmp13） | Sangon Biotech | 使用Primer BLAST设计 | |
| DMEM/F12培养基 | Hyclone | SH30023.01 | |
| 胎牛血清 | ExCell | FCS500 | |
| HRP标记山羊抗小鼠多克隆抗体 | Immunoway | RS0001 | 二抗；WB：1/10000 |
| HRP标记山羊抗兔多克隆抗体 | Immunoway | RS0002 | 二抗；WB：1/10000 |
| 倒置相差显微镜 | OLYMPUS | CKX53 | |
| 微量移液器 | Thermo Fisher | ||
| 小型台式离心机 | SUNNE | SN-TDL-6 | |
| 11号手术刀片 | Servicebio | QXJZ-11 | |
| 青霉素-链霉素溶液（100X） | Beyotime | C0222 | |
| 小动物解剖器械套装 | Servicebio | QXTZ01 |
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