该方案可在6-8小时内分离获得足够的原代软骨细胞，有助于进一步深入研究软骨生物学及软骨疾病机制。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
关节软骨破坏会导致软骨细胞活性改变，这是多种软骨疾病（包括骨关节炎（OA）和类风湿关节炎（RA））发生的主要致病因素之一。作为软骨中最主要的细胞类型，深入研究软骨细胞的生物学特性对于开发有效的疾病治疗策略至关重要。原代软骨细胞的分离与培养为研究软骨疾病提供了重要的实验材料，有助于揭示软骨损伤与修复的机制。本实验方案详细描述了 体外 从小鼠来源的原代软骨细胞分离与培养方法。通过采用优化的胶原酶II方案，可在8小时内完成新生小鼠膝关节软骨组织的软骨细胞分离。每毫克软骨组织的细胞得率约为1-2 × 10³个细胞，具体数值随组织新鲜程度和初始细胞密度而有所差异；所分离的细胞表现出 >90% 存活率。本方案以小鼠原代软骨细胞为例，展示分离后培养 1、2 和 5 天的细胞形态特征和贴壁状态。逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和蛋白质印迹实验表明，白细胞介素-1β（IL-1β）处理降低了 II 型胶原 α1（Collagen Type II Alpha 1，Col2a1）以及基质金属蛋白酶13（Matrix Metallopeptidase 13，MMP13）水平升高（Mmp13 表达，证实分离的软骨细胞能够响应炎症刺激。与传统方法相比，本方案采用较高的胶原酶浓度，以缩短分离时间对细胞活力的不利影响，同时避免胰蛋白酶处理可能造成的细胞损伤。所获得的原代软骨细胞纯度高、活力良好，适用于软骨损伤相关机制的深入研究，具有重要意义 体外 软骨疾病的基础研究与临床治疗。
引言
关节软骨破坏是多种软骨疾病（如骨关节炎和类风湿关节炎）的主要病因1,2。软骨细胞是软骨中的主要细胞类型，对于维持软骨稳态以及在损伤后促进修复至关重要3。软骨细胞活性的改变不仅影响软骨的结构完整性，还可诱发炎症反应并导致进行性组织退变4。因此，深入研究软骨细胞的生物学特性对于阐明这些疾病的发病机制具有重要意义。
近年来，软骨细胞在炎症反应中的作用受到越来越多的关注。研究表明，白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性细胞因子会显著破坏软骨细胞的代谢过程，导致基质降解酶的表达增加以及基质合成减少5,6,7这些变化最终导致软骨的逐渐退化和关节功能障碍。因此，研究软骨细胞在病理条件下发生的生物学改变对于 体外 建立模型已变得尤为迫切。在传统二维（2D）单层培养的基础上，近年来三维（3D）软骨细胞培养和类器官技术在软骨相关研究中得到 increasingly 广泛的应用。这些优化的体系提供了更接近生理状态的微环境，有助于深入理解软骨细胞在疾病背景下的行为特征8.
细胞来源的选择至关重要，它决定了体外（in vitro）研究结果是否能够准确地再现关节的病理生理状态。与永生化的软骨细胞系或软骨组织外植体相比，原代软骨细胞保留了关节软骨固有的遗传背景、机械敏感性钙信号通路以及表型稳定性，因而表现出更优越的软骨形成能力及更接近于体内软骨细胞的生物学行为9。已有研究记录了原代软骨细胞与ATDC5细胞系在钙信号来源、关键离子通道及下游信号通路方面存在系统性差异10。因此，在研究关节生理或病理过程时，应优先选用原代软骨细胞。由此可见，优化原代软骨细胞的分离与培养方法，对于准确模拟疾病相关的生物学过程以及探索潜在治疗药物至关重要11,12,13,14,15。然而，现有方法由于消化时间过长，往往会影响细胞活力或破坏表型完整性16,17。
在此，我们描述了一种实验方案 体外 从小鼠软骨组织中分离和培养原代软骨细胞，可快速获得足够数量的细胞。与传统的低酶浓度长时间消化方法相比，本研究优化了酶消化条件和组织预处理步骤，显著将消化时间缩短至6–8小时，同时避免了胰蛋白酶处理可能造成的细胞损伤15,17. 采用此方法，可获得约 1-2 × 103 每毫克小鼠软骨组织可获得软骨细胞。本方案为原代软骨细胞的分离与培养提供了可靠的指导。 体外为软骨疾病研究提供了可靠的模型。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均经西安红会医院伦理委员会批准（编号：202309009），实验操作严格遵循动物实验的替代、减少和优化3R原则。
图1A 展示了试剂与设备准备的示意图。材料表 包含本实验方案中所用试剂和设备的相关信息。
1. 实验小鼠
注意：本研究使用了四只3日龄的野生型C57BL/6J小鼠。
- 将笼具维持在恒定温度 25 °C ± 2 °C 和湿度 50%–60% 的条件下，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗。提供无特定病原体（SPF）级的无菌小鼠饲料（经 60Co 照射）和无菌水 随意摄取.
- 从四只出生3天的小鼠中收集膝关节软骨（约每只小鼠10 mg） 死后 分离原代软骨细胞。
2. 软骨标本的采集与处理
- 小鼠处理与组织解剖
- 在出生后3天内处死新生小鼠。用75%医用酒精擦拭体表进行消毒。
- 使用无菌外科器械分离小鼠膝关节，并将其置于无菌1×PBS中。
- 使用无菌外科器械小心剔除膝关节周围的肌肉、骨骼、滑膜及其他增生性结缔组织，仅保留膝关节的软骨组织。
- 用无菌1×PBS冲洗组织样本3次，弃去液体。
注：图1B 展示了软骨组织获取与预处理的简化示意图。
图1：材料准备与软骨样本处理的简化工作流程。（A）试剂与设备设置的示意图，包括试剂、耗材和主要仪器。（B）从小鼠膝关节中处理软骨组织的分步操作流程。缩写：PBS = 磷酸盐缓冲液。 请点击此处查看该图的放大版本。
3. 原代软骨细胞的分离与培养
- 将分离的软骨组织转移至新的6孔细胞培养板中。使用无菌11号手术刀片将组织切成约0.25 mm3大小的小块。用预冷的无菌1×PBS冲洗一次，弃去液体。
- 加入2 mL预热（37 °C）的消化液，其中含有高浓度胶原酶II（25 mg/mL，溶于无菌DMEM/F12基础培养基），以完全覆盖组织块。
- 将细胞培养板置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育15分钟进行酶消化。孵育结束后，弃去液体。
- 重复步骤3.2和3.3。
注意：高浓度酶消化为初步处理步骤，旨在对组织进行预消化，部分破坏其结构以利于后续更充分的消化，并去除因从组织边缘切割可能产生的基质粘连。 - 加入2 mL预热（37 °C）的消化液，其中含有低浓度胶原酶II（5 mg/mL，溶于无菌DMEM/F12基础培养基），以完全覆盖组织块。
- 将细胞培养板置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育6–8小时进行消化，并观察细胞分离进程。期间可间歇性进行缓慢水平振荡（80–120 rpm）或轻柔吹打，以提高消化效率。
注意：对于新生小鼠组织，约3小时即可观察到细胞释放，6–8小时内可完成全部细胞分离。在6–8小时的胶原酶II消化过程中，应每小时观察一次消化情况，当肉眼不可见明显组织块、显微镜下90%以上的细胞呈游离悬浮状态时，终止消化。在消化过程中，可在光学显微镜下观察到空泡样软骨细胞逐渐从软骨组织团块中脱离。该步骤可重复多次，以减少长时间消化对软骨细胞造成的损伤，并可更换为新鲜的低浓度胶原酶II消化液，以提高细胞得率。 - 将所有消化产物通过100 µm细胞筛过滤至无菌50 mL离心管中。
注意：使用100 µm细胞筛可防止软骨细胞聚集体丢失，提高细胞得率。残留的组织碎片将在后续换液过程中被清除。 - 用无菌1×PBS冲洗细胞培养板，再次通过细胞筛过滤。
- 将上一步所得全部滤液收集至15 mL离心管中，在室温下以300 × g离心5分钟（关闭刹车），离心后弃去上清液。
- 加入2 mL无菌1×PBS，用移液器轻轻吹吸重悬沉淀。转移至无菌15 mL离心管中，在室温下以300 × g离心5分钟（关闭刹车），离心后弃去上清液。
- 用2 mL freshly prepared sterile DMEM/F12完全培养基（含15%胎牛血清[FBS]和1%青霉素-链霉素[P/S]）重悬步骤4.10所得沉淀。使用血细胞计数板对收获的细胞悬液进行计数，随后以2–2.5 × 105 cells/cm2的密度将细胞接种至无菌10 cm培养皿中，并用完全培养基补足至终体积10 mL。
注意：软骨细胞接种密度应为2–2.5 × 105 cells/cm2，过低或中等密度接种可能导致关节软骨细胞表型向成纤维细胞样转变。可选MTT法或台盼蓝排斥染色法评估分离所得原代细胞的增殖活性与存活率（可选步骤）。 - 置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中培养。
- 当在光学显微镜下观察到细胞完全贴壁后，更换为新鲜的DMEM/F12完全培养基（含10% FBS，1% P/S）。
- 每2天更换一次培养基。持续培养至细胞融合度达到70%，即可进行后续实验。
注意：可根据细胞状态将培养基中血清浓度提高至15%。图2展示了软骨组织消化、原代细胞分离与培养的简化示意图。
图2：软骨组织消化、原代细胞分离与培养的简化流程。 软骨组织经剪碎后，先使用高浓度胶原酶II消化液连续消化15分钟，重复一次，随后用低浓度胶原酶II消化液消化6–8小时以分离细胞。消化后的组织经滤网过滤，收集滤液并进行离心。细胞沉淀用1×PBS洗涤，接种于DMEM/F12培养基中培养，待细胞融合度达到70%时，即可用于后续实验。 请点击此处查看该图的放大版本。
4. 原代软骨细胞的功能验证
- 炎症条件下软骨细胞的代谢及其变化。
- 使用 10 ng/mL IL-1β 处理细胞 24 小时，以模拟炎症条件。
- 进行 RT-qPCR 和蛋白质印迹实验时，提取总 RNA 或总蛋白，以检测软骨细胞细胞外基质的代谢指标，如 COL2A1、MMP13。
注：图3 展示了原代软骨细胞功能验证及其后续实验流程的示意图。抗体信息见材料表。蛋白质印迹和 RT-qPCR 的详细实验步骤见表1、表2、表3、表4和表5。所有方法均遵循标准实验方案11,18。
图3：原代软骨细胞功能验证实验的示意图。 通过 IL-1β 处理诱导炎症状态；采用 RT-qPCR 和 Western blotting 评估对软骨相关表型的影响。缩写：IL-1β = 白细胞介素-1β；RT-qPCR = 反转录定量聚合酶链式反应。 请点击此处查看该图的放大版本。
| Western印迹实验流程条件 | |
| 步骤 | 条件 / 试剂 |
| SDS-PAGE胶制备 | 8 % (w/v) Tris-HCl分离胶 |
| 浓缩电泳 | 80 V，30–40分钟 |
| 分离电泳 | 120 V，1–1.5小时 |
| 转膜 | 半干转，15 V，30–60分钟 |
| 封闭 | 快速封闭缓冲液，室温孵育2小时 |
表1：蛋白质印迹实验流程条件。 蛋白质印迹实验条件的汇总，包括SDS-PAGE组成、电泳参数、转膜设置和封闭步骤。
| 逆转录反应体系 | |
| 组分 | 体积 (μL) |
| 5× Transcriptor 逆转录酶反应缓冲液 | 4 |
| 脱氧核苷酸混合物（每种 10 mM） | 2 |
| Protector RNase 抑制剂（40 U/μL） | 0.5 |
| Transcriptor 逆转录酶（20 U/μL） | 0.5 |
| 无核酸酶水 | 加至 20 |
| 总体积 | 20 |
表2：逆转录反应体系。 用于cDNA合成的逆转录反应组成。
| 小鼠原代软骨细胞RT-qPCR引物信息 | ||||
| 基因名称 | 序列(5’ 3’) | 退火温度 (°C) | ||
| mGapdh | 正向引物 | TGGCCTTCCGTGTTCCTAC | 60 | |
| 反向引物 | GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA | |||
| mCol2a1 | 正向引物 | TGACCTCAACTACATGGTCTACA | 60 | |
| 反向引物 | CTTCCCATTCTCGGCCTTG | |||
| mMmp13 | 正向引物 | CTTCTTCTTGTTGAGCTGGACTC | 60 | |
| 反向引物 | CTGTGGAGGTCACTGTAGACT | |||
表3：小鼠原代软骨细胞RT-qPCR引物信息。用于定量小鼠原代软骨细胞中Gapdh、Col2a1和Mmp13转录本的引物序列及退火温度（60 °C）。
| RT-qPCR 反应体系 | |
| 组分 | 体积 (μL) |
| 2 × SYBR Green qPCR Master Mix | 10 |
| 稀释后的 cDNA 模板 | 8 |
| 正向引物 (10 μM) | 1 |
| 反向引物 (10 μM) | 1 |
| 总体积 | 20 |
表4：RT-qPCR反应体系。 使用SYBR Green预混液、模板和引物配制的RT-qPCR反应体系（20 µL）。
| RT-qPCR 循环程序 | ||
| 步骤 | 温度 (°C) | 时间 |
| 初始变性（×1） | 95 | 10 min |
| 变性（×40） | 95 | 5 s |
| 退火/延伸（×40） | 60 | 15 s |
| 延伸（×40） | 72 | 30 s |
| 熔解曲线（×1） | 95 55 95 | 60 s 30 s 30 s |
表5：RT-qPCR扩增程序。在95 °C变性5秒，60 °C退火/延伸15秒，进行40个循环，并进行最终的熔解曲线分析。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
如所述 图1, 图2，以及 图3，我们执行了该方案，并成功地从小鼠膝关节中分离出原代软骨细胞。从约10 mg新生小鼠软骨组织中，获得了约1 × 104 细胞与 >90% 存活率。在第一天 体外 培养初期，原代小鼠软骨细胞呈圆形，多数细胞悬浮，尚未完全贴附于培养皿底部。第2天，部分细胞开始贴壁，并逐渐适应体外培养环境。第5天，在DMEM/F12培养基中，细胞生长旺盛，几乎所有细胞均已贴壁，并呈现正常增殖状态（图 4A大约每3天，细胞完成一个增殖周期，细胞形态呈典型的多边形，表现出较高的活力和增殖速率。
COL2A1 是软骨基质中的主要胶原成分，在维持软骨结构与功能方面发挥关键作用19,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
分离与培养原代软骨细胞对于阐明软骨疾病病理生理机制至关重要22在原代软骨细胞培养中，优化胶原酶浓度和消化时间至关重要，因其需在降解细胞外基质的同时，尽量减少对细胞的潜在损伤17. 本文中，我们描述了一种从小鼠软骨组织中分离原代软骨细胞的可靠且可重复的方法。采用该方法，可获得约1-2 × 103 每1毫克小鼠软骨组织可获得软骨细胞。该方法能够快速分离出足够数量的原代软骨细胞，具有高度可重复性和实用性。分离得到的软骨细胞保持其典型的形态和功能特性 体外从而促进对软骨细胞基因表达变化的研究以及与软骨代谢相关的功能检测。此外，这些细胞还可用于高级应用，例如三维软骨培养实验。8.
已有多种原代软骨细胞分离方案被报道并应用于研究，但每种方法均存在明显缺陷。通常，采用低浓度酶（例如1 mg/mL胶原酶II）在37 °C条件下消化软骨组织14–16小时。尽管该方法可获得较高的细胞得率，但长时间的酶处理可能导致细胞活力...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作由国家自然科学基金（编号：82370909）资助。图1、图2和图3使用Figdraw绘制。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1× PBS粉末（2 L） | Servicebio | G0002-2L | |
| 100 mm细胞培养皿 | Servicebio | CCD-100 | |
| 100 μm细胞筛 | Sangon Biotech | F613463-0001 | |
| 15 mL锥形离心管（无菌，无酶） | Servicebio | EP-1501-J | |
| 50 mL锥形离心管（无菌，无酶） | Servicebio | EP-5001-J | |
| 6孔细胞培养板 | Servicebio | CCP-6H | |
| 抗COL2A1兔多克隆抗体 | Immunoway | YT1022 | 一抗；WB：1/500 |
| 抗GAPDH鼠单克隆抗体 | Proteintech | 60004-1-IG | 一抗；WB：1/2000 |
| 抗MMP13兔多克隆抗体 | Immunoway | YT2796 | 一抗；WB：1/1000 |
| 无菌超净工作台 | Thermo Fisher | 51029704 | |
| 细胞培养孵育箱 | Thermo Fisher | 51033782 | |
| 胶原酶II | Solarbio | C8150 | |
| 定制引物（Gapdh, Col2a1, Mmp13） | Sangon Biotech | 使用Primer BLAST设计 | |
| DMEM/F12培养基 | Hyclone | SH30023.01 | |
| 胎牛血清 | ExCell | FCS500 | |
| HRP标记山羊抗小鼠多克隆抗体 | Immunoway | RS0001 | 二抗；WB：1/10000 |
| HRP标记山羊抗兔多克隆抗体 | Immunoway | RS0002 | 二抗；WB：1/10000 |
| 倒置相差显微镜 | OLYMPUS | CKX53 | |
| 微量移液器 | Thermo Fisher | ||
| 小型台式离心机 | SUNNE | SN-TDL-6 | |
| 11号手术刀片 | Servicebio | QXJZ-11 | |
| 青霉素-链霉素溶液（100X） | Beyotime | C0222 | |
| 小动物解剖器械套装 | Servicebio | QXTZ01 |
参考文献
- Makris, E. A., Gomoll, A. H., Malizos, K. N., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Repair and tissue engineering techniques for articular cartilage. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 21-34 (2015).
- Bierma-Zeinstra, S., Van Middelkoop, M., Runhaar, J., Schiphof, D. Nonpharmacological and nonsurgical approaches in OA. Best Pract Res Clin Rheumatol. 34 (2), 101564(2020).
- Urlic, I., Ivkovic, A. Cell sources for cartilage repair-biological and clinical perspective. Cells. 10 (9), 2496(2021).
- Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Nat Med. 26 (10), 1583-1592 (2020).
- Zhao, K., Ruan, J., Nie, L., Ye, X., Li, J. Effects of synovial macrophages in osteoarthritis. Front Immunol. 14, 1164137(2023).
- Wang, B. W., et al. Aucubin protects chondrocytes against IL-1β-induced apoptosis in vitro and inhibits osteoarthritis in a mouse model. Drug Des Devel Ther. 13, 3529-3538 (2019).
- Kuswanto, W., Baker, M. C. Repurposing drugs for the treatment of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 32 (8), 886-895 (2024).
- Heywood, H. K., Thorpe, S. D., Jeropoulos, R. M., Caton, P. W., Lee, D. A. Modulation of sirtuins during monolayer chondrocyte culture influences cartilage regeneration upon transfer to a 3d culture environment. Front Bioeng Biotechnol. 10, 971932(2022).
- Piñeiro-Ramil, M., et al. Generation of human immortalized chondrocytes from osteoarthritic and healthy cartilage : A new tool for cartilage pathophysiology studies. Bone Joint Res. 12 (1), 46-57 (2023).
- Li, W., Zhou, Y., Han, L., Wang, L., Lucas Lu, X. Calcium signaling of primary chondrocytes and atdc5 chondrogenic cells under osmotic stress and mechanical stimulation. J Biomech. 145, 111388(2022).
- Zhao, Y., et al. Protein folding dependence on selenoprotein m contributes to steady cartilage extracellular matrix repressing ferroptosis via PERK/ATF4/CHAC1 axis. Osteoarthritis Cartilage. 33 (2), 261-275 (2025).
- Zhang, H., et al. Mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development through downregulating FBXW7. Ann Rheum Dis. 81 (5), 676-686 (2022).
- Tang, H., et al. The IRF1/GBP5 axis promotes osteoarthritis progression by activating chondrocyte pyroptosis. J Orthop Translat. 44, 47-59 (2024).
- Bittner, N., et al. Primary osteoarthritis chondrocyte map of chromatin conformation reveals novel candidate effector genes. Ann Rheum Dis. 83 (8), 1048-1059 (2024).
- Ramser, A., Greene, E., Rath, N., Dridi, S. Primary growth plate chondrocyte isolation, culture, and characterization from the modern broiler. Poult Sci. 102 (1), 102254(2023).
- Mao, J., et al. Insufficiency of collagenases in establishment of primary chondrocyte culture from cartilage of elderly patients receiving total joint replacement. Cell Tissue Bank. 24 (4), 759-768 (2023).
- Lau, T. T., Peck, Y., Huang, W., Wang, D. A. Optimization of chondrocyte isolation and phenotype characterization for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 21 (2), 105-111 (2015).
- Pagani, S., et al. Rna extraction from cartilage: Issues, methods, tips. Int J Mol Sci. 24 (3), 2120(2023).
- Goldring, M. B., Otero, M., Tsuchimochi, K., Ijiri, K., Li, Y. Defining the roles of inflammatory and anabolic cytokines in cartilage metabolism. Ann Rheum Dis. 67 (Suppl 3), 75-82 (2008).
- Wang, G., et al. TGFbeta attenuates cartilage extracellular matrix degradation via enhancing FBXO6-mediated MMP14 ubiquitination. Ann Rheum Dis. 79 (8), 1111-1120 (2020).
- Pang, Y., Zhao, L., Ji, X., Guo, K., Yin, X. Analyses of transcriptomics upon IL-1β-stimulated mouse chondrocytes and the protective effect of catalpol through the NOD2/NB-κb/MAPK signaling pathway. Molecules. 28 (4), 1606(2023).
- Naranda, J., Gradisnik, L., Gorenjak, M., Vogrin, M., Maver, U. Isolation and characterization of human articular chondrocytes from surgical waste after total knee arthroplasty (TKA). PeerJ. 5, e3079(2017).
- Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sci. 89 (19-20), 741-747 (2011).
- Lawrence, J. E. G., et al. Single-cell transcriptomics identifies chondrocyte differentiation dynamics in vivo and in vitro. Dev Cell. , (2025).
- Huang, C., et al. Single-cell transcriptomic analysis of chondrocytes in cartilage and pathogenesis of osteoarthritis. Genes Dis. 12 (2), 101241(2025).
- Wu, C. L., et al. Single cell transcriptomic analysis of human pluripotent stem cell chondrogenesis. Nat Commun. 12 (1), 362(2021).
- Zhang, H., Huang, J., Alahdal, M. Exosomes loaded with chondrogenic stimuli agents combined with 3d bioprinting hydrogel in the treatment of osteoarthritis and cartilage degeneration. Biomed Pharmacother. 168, 115715(2023).
- Mahapatra, C., Jin, G. Z., Kim, H. W. Alginate-hyaluronic acid-collagen composite hydrogel favorable for the culture of chondrocytes and their phenotype maintenance. Tissue Eng Regen Med. 13 (5), 538-546 (2016).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。