MALDI-ToF MS方法表征具有不同分散性和端基的合成聚合物

Ashley V. Miles; Amman Nadeem; Mahi Ahmad; Brennan J. Curole; Scott M. Grayson

doi:10.3791/68455

方法文章

MALDI-ToF MS方法表征具有不同分散性和端基的合成聚合物

DOI：

10.3791/68455

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2025年10月3日

Ashley V. Miles¹ , Amman Nadeem¹ , Mahi Ahmad¹ , Brennan J. Curole¹ , Scott M. Grayson¹

¹Department of Chemistry, Tulane University

本文内容

摘要

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该协议提供了样品制备、数据采集和数据分析的详细说明和示例，以使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法表征具有不同分散性和端基的合成聚合物。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）是表征合成聚合物的有效分析工具，可提供精确的分子量测定和结构见解，例如重复单位质量和端基鉴定。该协议详细介绍了聚合物分析的步骤，包括使用适当的基质和阳离子选择进行样品制备、数据采集以及确保准确质量测量的校准方法。它强调了MALDI-ToF MS在分析聚合物（从单分散材料到高度分散材料）方面的多功能性，同时观察到在分离高度分散样品方面的局限性。通过比较理论质量和观察到的质量，包括同位素模式，该方法可以可靠地确认重复单元和末端基团。该协议通过提供有关基质选择、跨分散范围的光谱解释以及具有独特同位素特征或亚稳态离子形成的聚合物表征的代表性数据来支持新用户。故障排除策略包括解决基质干扰和样品在样品制备过程中在没有添加阳离子的情况下电离等问题。总体而言，本指南是使用 MALDI-ToF MS 作为快速可靠的聚合物分析技术的基础。

引言

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基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-ToF MS）是一种用于表征合成聚合物1,2,3,4的高效分析技术。许多聚合物可以通过核磁共振（NMR）来表征重复单元结构。然而，即使对于低分子量聚合物，大多数端基也只是重复单位峰的一小部分，并且随着聚合物分子量的增加，端基信号似乎很难在 NMR⁵ 中量化。然而，MALDI-ToF MS数据证实，即使在更高的分子量下，这些都是终基。这种质谱技术以其软电离能力而闻名，主要产生单电荷聚合物离子，碎^裂极小2。这使得精确的分子量测定和详细的结构分析成为可能，从而提供快速准确的结果，提供有价值的信息，例如重复单位质量、端基鉴定，以及对于低分散性聚合物，测定数-平均分子量（M_n）、重量-平均分子量（M_w）和分散度（Đ）⁶。

MALDI-ToF MS可以分析具有不同分散性的聚合物，但在较高的分散度下存在局限性。对于树枝状聚合物等单分散聚合物，该方法是确认其质量和鉴定端基的理想选择⁷。对于低分散度（1.01-1.09）的聚合物和一些中等分散度的聚合物（Đ = 1.1-1.3），MALDI-ToF MS也可用于测定聚合物重复单位质量、端基质量、Đ、M_n和M_w⁸。然而，对于高度分散的聚合物（Đ = 1.3-10），这变得具有挑战性。对于广泛分散的聚合物，较低的馏分表现出比较高分子量的对应物高得多的强度，导致比尺寸排阻色谱（SEC）等其他表征技术的人为降低分散性。这被描述为“低质量偏差”。从较低的分子量结果中可以确认平均重复单位质量和端基，但无法确定MALDI-ToF MS⁹中高分散性聚合物的真实M_n，M _w和Đ。因此，必须添加 SEC 作为广泛分散聚合物的表征技术，以确定真正的 M_n、M_w 和 Đ。

优化样品制备对于在MALDI-ToF质谱图上获得高质量峰分辨率至关重要^2,10。第一步是根据聚合物极性选择合适的基质。对于非极性聚合物，通常使用反式-2-[3-叔丁基苯基）-2-甲基-2-丙苯基]（DCTB）、半甲氨氧基自由基（GFR）和9-硝基蒽（9-NA）等基质¹¹。极性聚合物更适合α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）、二咽醇、2-（4-羟基苯偶氮杂）苯甲酸（HABA）和2,5-二羟基苯甲酸（DHB）等基质12,13,14。对于该协议，由于DCTB对非极性聚合物的有效性，选择DCTB作为主要基质，CHCA用于极性聚合物。阳离子选择也起着重要作用，因为钠和钾等碱金属可以有效地电离含氧聚合物，而银等过渡金属更适合不饱和碳氢化合物^10,14。

选择基质和分析物后，确定样品溶液混合物的最佳阳离子：分析物：基质比率。将该样品溶液混合物以 1 μL 的量添加到目标板中。阳离子：分析物：基质选择没有一个或多个正确的比例会影响 MALDI-ToF MS 数据采集的灵敏度。对于下面的代表性数据，样品制备已针对最佳分辨率进行了优化 ^2,15。

制备样品溶液并将其添加到 MALDI-ToF MS 靶板中后，将该样品插入 MALDI-ToF MS 仪器中以开始数据采集。在这项研究中，数据仅以正离子模式收集，并使用了更新的MALDI-ToF质谱仪，以Payne等人之前的工作为基础¹⁶。可以调整重要的MALDI-ToF MS参数，如激光功率、激光束直径、检测器增益和脉冲提取延迟时间，以提高采集过程中的分辨率。MALDI-ToF MS 数据采集有两种模式：线性和反射器¹⁷。与线性模式相比，反射模式是实现更高信号分辨率的首选^18,19。在线性模式下，加速离子直接通过飞行管到达检测器。相比之下，反射器模式涉及通过飞行管一次，然后在到达第二个探测器之前通过飞行管第二次反射回离子，这大约是它们的飞行路径的两倍。这种方法能够区分质量相似但速度不同的离子^20,21。激光功率也可以是提高聚合物信噪比或减少碎裂的一个因素²²。消融样品的最低激光功率将提高信噪比，并将减少碎裂的可能性²²。在优化信号分辨率并最大化信噪比后，采集可以为所选聚合物分析物提供高质量的数据。

校准对于 MALDI-ToF MS 中的精确质量数测量至关重要。使用两种主要方法：内部校准和外部校准，这两种方法都依赖于已知质量数覆盖分析物预期范围的校准品⁶。对于代表性数据中分析的聚合物，选择单分散树枝状聚合物校准品进行宽质量范围的校准²³。内部校准，即校准品与阳离子、分析物和基质混合，可提高质量精度，因为校准品和分析物都经历相同的条件，并且任何校准质量偏移对它们的影响相同。然而，这种方法可能导致与所得聚合物信号的峰重叠，使分析复杂化²⁴。相比之下，该协议中使用的外部校准通过将阳离子：校准剂：基质与靶板上的阳离子：分析物：基质分开制备和点样来避免峰重叠。然而，由于样品放置和局部仪器响应的细微差异，例如整个目标的激光强度或电离效率的变化，可能会出现轻微的质量不准确，因此校准品和分析物应彼此靠近²⁴。在代表性数据中，使用外部校准方法观察到的质量差与理论值小于0.100 Da。

最后，对于所有聚合物，可以分析MALDI-ToF MS数据以确定重复单位质量并对聚合物进行端基分析。通过使用软件工具将理论重复单位质量与MALDI-ToF质谱中观察到的重复单位质量进行比较，可以确认重复单位质量。如果它们匹配，则聚合物可能具有预期的重复单元结构（或异构体）。聚合物的MALDI-ToF MS端基分析首先计算分析物的理论质量数。这包括重复单元、端基和从样品制备中选定的阳离子的总质量。对于单分散大分子，计算包括一种分析物的总质量以及所选阳离子的质量。用于绘制化学结构的软件工具可以帮助这些计算。然后将软件的理论质量与MALDI-ToF质谱中观察到的质量进行比较，以验证聚合物是否与预期的分子结构相匹配。然而，如果观察到的重复单位质量与理论值大致匹配，但指定 n-mer 的总质量（包括端基和阳离子）不匹配，则差异可能表明存在意外的端基。为了识别未知的端基，需要审查反应条件以确定可能反应形成观察到的端基的替代分子或试剂。此步骤对于准确表征聚合物的所有结构至关重要。

该协议为合成聚合物的MALDI-ToF MS分析提供了一种分步方法，旨在帮助用户，特别是初学者进行样品制备，仪器方法优化，数据采集和数据分析。代表性数据说明了给定聚合物的基质选择;不同分散度的聚合物的光谱和分析，包括单分散、中度分散和高度分散的样品;聚合物的端基分析，包括具有不同同位素分辨率模式的聚合物（例如卤化物）和容易形成亚稳态离子的聚合物（例如叠氮化物封端）;使用MALDI-ToF MS对聚合物进行数据分析，包括比较观察到的质量数和理论质量数，以确认重复单位质量和总聚合物质量，包括端基和阳离子加合物;以及低质量聚合物和自电离聚合物的基质干扰故障排除示例。

该协议不仅为MALDI-ToF MS聚合物表征提供了基础，还为样品制备、分步仪器方法优化（图1）以及新合成和商业合成聚合物的谱图解释提供了指导。

方案

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注意：使用前查看所有化学品的安全数据表（SDS）。在通风橱中进行所有样品制备和 MALDI-ToF MS 板制备，并佩戴适当的个人防护装备（PPE），包括安全眼镜、实验室外套和手套。

1. 样品制备

基质、阳离子、校准品和分析物储备液的制备
1. 通过将 2 mg 所需阳离子溶解在 1 mL 因与分析物和阳离子相容而选择的溶剂中来制备碱阳离子储备溶液。对于样品 1，将 2 mg 三氟乙酸钠溶解在 1 mL THF 中。
2. 根据分析物的溶解度，将 20 mg 所需基质溶解在 1 mL 相容溶剂中，制备基质储备溶液。示例：对于代表性数据（样品 1），将 20 mg DCTB 溶解在 1 mL 四氢呋喃（THF）中。
3. 按照供应商说明制备校准储备溶液。
4. 通过将 10 mg 分析物溶解在 1 mL 合适的溶剂中来制备分析物溶液。对于样品1，将10 mg分析物溶解在1 mL THF中。
MALDI-ToF MS靶板的制备
1. 清洁 MALDI-ToF MS 靶板。
2. 制备分析物采集样品和校准样品溶液。将阳离子、分析物和基质储备溶液以 1：5：20 μL 的比例加入管 A 和涡旋管中。对于外部校准：将阳离子、校准剂和基质储备溶液以 1：5：20 μL 的比例加入管 B 和涡旋中。
3. 将分析物和校准样品溶液混合物加入 MALDI-ToF MS 目标板中。使用干燥液滴法将0.5μL阳离子：分析物：基质样品溶液混合物（试管A）移液到MALDI-ToF MS靶板上。使用干燥液滴法将 0.5 μL 阳离子：校准剂：基质混合物（试管 B）移液到 MALDI-ToF MS 目标板上与分析物相邻的点上。记录每个点的确切位置（行、字母和列号），以便在数据采集过程中轻松定位样品和校准品。

2. 数据采集

插入 MALDI-ToF MS 靶板并选择采集方法
1. 将 MALDI-ToF MS 靶板插入仪器。以正确的方向将目标板放在支架上，不要将 MALDI-ToF MS 目标板推得太远。
2. 使用仪器控制软件将 MALDI-ToF MS 靶板对接在仪器上。
3. 在仪器控制软件上选择并打开 方法文件 。在分析物的质量范围内选择反射 器阳性（RP）或线性阳性（LP） 方法。
4. 监控仪器控制软件以确认目标板已插入且方法设置完成。
  注意：这些代表性聚合物含有氧;因此，选择正模式（大多数化合物在正模式下完成采集）。对于代表性数据，所有样品的反射器模式都选择了RP方法。
初始数据采集
1. 在仪器控制软件上，找到显示 MALDI-ToF MS 目标板的相机和显示列字母和行号的孔图。单击 含有阳离子：分析物：基质混合物的 MALDI-ToF MS 孔 以选择进行数据采集。
2. 将仪器控制软件上的质量数检测范围调整到500-20000 Da的宽范围，以确保完全捕获分析物的预期质量数。在初始采集后，使用光标将范围调整为分析物预期质量数的大约2倍。
3. 数据采集
  1. 按仪器控制软件上的 “开始” 按钮开始 MALDI-ToF MS 数据采集。
  2. 按 停止或 让 MALDI-ToF MS 采集自动完成。
  3. 单击“ 添加 ”以添加 MALDI-ToF MS 单光谱总光谱缓冲液。
    注意：MALDI-ToF MS 单光谱缓冲液存储单个 MALDI-ToF 质谱，总谱缓冲液累积来自多次采集的数据，从而增加信号强度。
  4. 通过查看相机馈送来重新定位 MALDI-ToF MS 激光器，然后单击 同一选定孔内的任意位置 以将激光器移动到新位置。
  5. 重复 MALDI-ToF MS 采集，将 MALDI-ToF MS 单光谱添加到总缓冲液中。重复步骤 2.2.3.1 至 2.2.3.4，直到 MALDI-ToF MS 结果令人满意。
  6. 评估 MALDI-ToF 质谱的分辨率和基线噪声。如果 MALDI-ToF MS 谱图表现出高分辨率和最小的基线噪声，请继续校准步骤。如果没有，请考虑优化数据采集方法（例如，调整激光功率、探测器增益或脉冲离子提取设置）。
数据采集优化（参见图1)
1. 一次调整 MALDI-ToF MS 激光功率、检测器增益和脉冲离子提取，以提高分辨率和/或降低背景噪声
2. 要复制 MALDI-ToF MS 方法，请将 MALDI-ToF MS LP 或 RP 方法复制并粘贴到新名称下。打开已创建的粘贴的 MALDI-ToF MS 方法文件并重命名该文件。
3. 按照数据采集部分中第 2.2 节中用于初始数据采集的所有步骤获取初始 MALDI-ToF 质谱。放大一组具有最高强度的 MALDI-ToF MS 峰，以评估仪器控制软件上的分辨率和基线噪声。
4. 获取优化
  1. 调整 MALDI-ToF MS 激光功率
    1. 从 ~ 4% 的低 MALDI-ToF MS 激光功率开始，按照步骤 2.2.3.1 和 2.2.3.2 进行初始数据采集以开始和停止数据采集。
    2. 观察并比较MALDI-ToF MS单缓冲液的分辨率和基线噪声以及总缓冲液中的初始光谱。
    3. 以 2%-10% 的增量增加 MALDI-ToF MS 激光功率以增强电离。按照步骤 2.2.3.1 和 2.2.3.2 进行初始数据采集，在每次增量后开始和停止数据采集。
    4. 选择最低的激光功率，以最小的噪声提供高强度峰值。
      注意：当 MALDI-ToF MS 激光功率为 50% 及以上时，样品碎裂的可能性增加。
  2. 优化 MALDI-ToF MS 激光直径
    1. 在检测器选项卡中，调整 MALDI-ToF MS 激光直径以测试中、大和超设置。按照步骤 2.2.3.1 和 2.2.3.2 进行初始数据采集，开始和停止数据采集。
    2. 观察并比较MALDI-ToF MS单缓冲液的分辨率和基线噪声以及总缓冲液中的初始光谱。
    3. 选择 MALDI-ToF MS 激光器直径，该激光器直径可提供最佳分辨率和最小的基线噪声。
      注意：MALDI-ToF MS激光直径控制激光束直径。
  3. 调整 MALDI-ToF MS 检测器增益
    1. 以较小的增量增加或减少 MALDI-ToF MS 检测器增益。按照初始数据采集步骤 2.2.3.1 和 2.2.3.2 开始和停止 MALDI-ToF MS 检测器增益每次增加或减少的数据采集。
    2. 每次调整 MALDI-ToF MS 单缓冲液和总缓冲液中的初始谱图时，在仪器控制软件上观察 MALDI-ToF 质谱信号强度和分辨率。
    3. 保持 MALDI-ToF MS 检测器增益，以提供最佳强度和良好的信号分辨率。
  4. 修改 MALDI-ToF MS 脉冲离子提取
    1. 以 10 ns 的增量调整 MALDI-ToF MS 脉冲离子提取。按照初始数据采集步骤 2.2.3.1 和 2.2.3.2 开始和停止数据采集，以应对检测器增益的每次增加或减少。
    2. 评估脉冲离子提取变化如何提高 MALDI-ToF MS 信号分辨率。
      注意：MALDI-ToF MS脉冲离子提取定义为激光电离之间的时间延迟。通过增加或减少脉冲离子提取，不同能量的离子将在电场中停留的时间更短或更长。当施加电压时，较长的时间可能允许相同质量的分析物和在略有不同的时间烧蚀的带正电的离子完全加速到与相同质量的分析物离子相同的速度。这可用于提高信号²⁵的分辨率和降低背景噪声。
5. 一旦达到最佳分辨率和最高信噪比，请保存优化的 MALDI-ToF MS 方法文件以供当前和将来使用。
MALDI-ToF 质谱校准
1. 通过选择目标板上的 校准样品 并按照第 2.2 节中的所有步骤进行初始数据采集，获取校准 MALDI-ToF 质谱图
  1. 访问校准参考点。导航到仪器控制软件中的校准选项卡。打开与所用校准品相对应的相应质量控制列表。
2. 将 MALDI-ToF 质谱校准峰与质控列表中的参考质量数相匹配。
  1. 在质量控制列表中，选择与MALDI-ToF质谱中 第一个校准峰相对应的质量数 。MALDI-ToF质谱图将自动放大选定的校准峰。
  2. 通过单击 校准信号左侧的设置参考峰。将选择峰值。
  3. 选择 应用将 校准信号设置为质量控制列表中的参考质量。
  4. 对所有附加校准峰重复此过程。从质量控制列表中选择 下一个目标质量 ，对齐相应的校准峰，然后应用参考设置。
校准聚合物分析物样品采集
1. 在仪器控制软件上找到并选择含有阳离子：分析物：基质混合物孔的孔。
2. 在打开优化和校准方法的情况下，按照第 2.2 节中的所有步骤执行数据采集。
3. 添加适当的文件名并保存校准后的分析物MALDI-ToF质谱图以供进一步分析。
使用仪器控制软件取出 MALDI-ToF MS 目标板。清洁 MALDI-ToF MS 靶板

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图 1：仪器方法优化的决策树。 本指南旨在帮助初学者系统地优化仪器方法参数。从默认或初始设置开始，然后根据观察到的改进增加或减少，一次调整一个参数。接下来，继续朝着增强（1）峰强度、（2）基线质量（低噪声）和（3）提供窄峰和同位素分辨率的方向前进。这种方法有助于确定可靠和高质量光谱的最佳条件。如果聚合物样品在反射器模式下没有电离或产生可用光谱，请切换到线性模式并使用相同的决策树来优化参数。请注意，线性模式通常会导致更宽的峰和有限的或没有同位素分辨率，但它对于更高质量的聚合物或在反射器模式下可能失去电离的聚合物可能有效。请点击此处查看此图的大图。

3. 数据分析与解读

打开 MALDI-ToF MS 数据分析软件并加载 MALDI-ToF MS 分析物样品谱图。
为分析物样品选择正确的 MALDI-ToF MS 处理方法。在这里，所有样品都具有同位素分辨率，并且选择了MALDI-ToF MS处理方法，为所有峰选择了第一个峰。
注意：MALDI-ToF MS 处理参数可针对合成聚合物样品进行定制。例如，MALDI-ToF MS仪器技术人员在技术培训课程中开发了一种聚合物的MALDI-ToF MS处理方法。Payne等人为特定应用创建了MALDI-ToF MS平均质量处理方法¹⁶。请联系 MALDI-ToF MS 制造商的聚合物技术团队，了解有关编辑 MALDI-ToF MS 处理方法的信息和建议。
使用 MALDI-ToF MS 分析软件查找峰。
比较理论和实验聚合物质量
1. 记录理论聚合物质量。在化学绘图软件中绘制预期的大分子结构，包括阳离子。在化学制图软件中打开分析窗口，记录理论质量。
  1. 单分散大分子：通过同时选择结构和阳离子来记录大分子的确切质量和分子量。
  2. 低、中和高分散聚合物：对于重复单位质量，仅选择聚合物主链以记录重复单位质量。对于指定 n-mer 的总质量数，将重复单位数设置为 MALDI-ToF MS 分析软件中显示的 MALDI-ToF MS 谱图范围内的质量数。选择整个聚合物结构，包括阳离子和端基，以记录指定 n-mer 的质量。
2. 将记录的理论质量数与 MALDI-ToF MS 光谱中观察到的质量数进行比较
  1. 对于单分散大分子的总质量计算，请按照以下步骤作。
    1. 放大 MALDI-ToF MS 光谱中强度最高的峰，确保视图包含至少低于和高于理论质量数 2 倍的质量范围。
    2. 将理论质量与MALDI-ToF质谱中观察到的质量数进行比较。如果差异小于 0.100 Da，则预期的单分散大分子质量可能是准确的。
    3. 检查MALDI-ToF MS谱图中是否有其他峰，这些峰可能表明存在意外结构。
    4. 如果检测到差异，请评估潜在的结构变化。查看反应方案并计算替代结构的质量以进行比较。
  2. 要重复计算低、中和高分散聚合物的单位质量，请按照以下步骤作。
    1. 选择并放大 MALDI-ToF MS 光谱中由重复单位质量数分隔的两个峰，这些峰表现出最高强度。
    2. 对于每对相邻峰，从较低质量峰中减去较高质量峰的观察质量，以计算重复单位质量。对下一组峰重复此过程，以确认重复单位质量的一致性。
    3. 将计算出的重复单位质量与理论重复单位质量进行比较。如果观测值和理论值匹配并表现出一致的质量差异，则聚合物重复单位质量可能是正确的。
  3. 对于指定 n-mer 的低、中和高分散聚合物的总质量，请按照以下步骤作。
    1. 放大MALDI-ToF质谱上与理论总质量相对应的峰，以及上下一个重复单位的峰。
    2. 将理论质量与MALDI-ToF质谱中观察到的质量数进行比较。如果差异小于 0.100 Da，则预期的端基可能是准确的。
    3. 检查MALDI-ToF质谱图，以查找可能提示意外结构的其他峰。
    4. 如果发现差异，请评估替代端组或结构变化。查看反应方案并计算潜在替代端基团或环状结构的质量。

结果

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样品1：单分散Tris[G1]（OH）₆
在1：1甲醇：氯仿中与Pd/C和H₂气体反应，在外围由1,1,1-三（羟甲基）丙烷核心和三个苄基保护的双（羟甲基）丙酸（Tris[G1]Bnz₃）组成的单分散树枝状聚合物的第1代，以去除苄基，并得到具有6个羟基的树枝状聚合物，形成Tris[G1]（OH）₆（图2A）。

以NaTFA为阳离子剂，CHCA为基质，分析Tris[G1]（OH）₆。使用CHCA是因为它对极性化合物非常有效，并与Tris[G1]（OH）₆ 的羟基相互作用，在靶板上提供均匀的层。MALDI-ToF MS样品制备首先制备NaTFA（THF中为1 mg/mL）、分析物（THF中为5 mg/mL）和CHCA（THF中为5 mg/mL）的储备溶液。制备这些溶液后，将1 μL Na⁺ 阳离子溶液、5 μL分析物溶液和20 μL基质溶液混合在微量离心管中并涡旋（阳离子：分析物：基质的比例为1：25：100，共26 mL）。接下来，从微量离心管中取出 1 μL 该混合物，并在 MALDI-ToF MS 靶板上干燥。该样品在反射器模式下进行分析，并通过比较理论值和观察值在MALDI-ToF MS光谱中确认峰（图2B，红色）。

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图2：（A） 样品1对Tris[G1]（OH）₆进行修饰的反应方案。通过Pd/C和H₂ 反应去除苄基，形成Tris[G1]（OH）₆。 MALDI-ToF MS用于确定反应的完成情况。 （B） 样品1的MALDI-ToF质谱图，Tris[G1]（OH）₆ 和空白基质谱叠加，包括基质和盐（[CHCA + Na]⁺）。Tris[G1]（OH）₆的完整MALDI-ToF MS谱图和放大显示[Tris[G1]（OH）₆+ Na⁺]⁺ 的观测质量值为505.239 Da，与理论质量数505.226 Da的差异为+0.013 Da。通过将空白的MALDI-ToF MS基质谱图（黑色）与Tris[G1]（OH）₆ MALDI-ToF MS谱图（红色）进行比较，可以忽略除505.26 Da以外的所有峰。请点击此处查看此图的大图。

观察到Tris[G1]（OH）₆的Na⁺加合物。[Tris[G1]（OH）₆+ Na]⁺ 的理论质量值由 Tris[G1]（OH）₆的单同位素峰的质量（482.2362 Da）加上钠阳离子的质量（22.9892 Da）组成，总质量为 505.226 Da。[Tris[G1]（OH）₆+ Na]⁺ 的观测质量值为 505.239 Da，与理论值相匹配，差异为 +0.013 Da。

为确保完全去除所有三个苄基基团，进一步分析了505-769 Da之间的MALDI-ToF MS谱图。该质量范围允许检测未检测到的任何外围组。[Tris[G1]Bnz₂（OH）₂+ Na]⁺存在一个峰，表明在681.289 Da（[Tris[G1]Bnz₃+ Na]⁺ 769.3194 Da - 88.0313 Da）处去除了一个苄基，在593.257 Da峰处（[Tris[G1]Bnz₃+ Na]⁺ 769.3194 Da -176.0626 Da）[Tris[G1]Bnz₁（OH）₄+ Na]⁺ ，表明从Tris[G1]Bnz₃ 中去除了两个苄基（图3）。这些峰和 Tris[G1]Bnz₃ 不存在;因此，反应完成，合成了Tris[G1]（OH）₆。

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图 3：Tris[G1]Bnz₃、Tris[G1]Bnz₂（OH）₂、Tris[G1]Bnz₁（OH）₄ 和样品 1 Tris[G1]（OH）₆的结构和理论质量。黑点表示产品。去除一个和两个苄基的结构和理论质量，以及完全羟基化的Tris[G1]（OH）₆ 请点击此处查看此图的大图。

在低于 900 的低分子量区域，存在多个与 Tris[G1]（OH）₆单分散质量不对齐的峰。大多数基质在1000以下存在轻微的噪声问题，因此包括空白的MALDI-ToF MS光谱以确认Tris[G1]（OH）₆是纯的。基质空白样品包括基质（CHCA）和阳离子（Na⁺）储备溶液。使用来自Tris[G1]OH₆ 的相同阳离子：基质浓度比（1：100 mg/mL）用于分析样品混合物。接下来，将 1 μL 混合物加入样品板中并干燥以进行分析。

完成初步数据采集、校准采集和数据采集，采集空白MALDI-ToF MS基质谱图。在 图2B （黑色）中，将MALDI-ToF MS空白基质（黑色）和样品Tris[G1]（OH）₆谱图（红色）叠加在柔性分析中，以比较和确认哪些峰与产物无关。在空白的MALDI-ToF MS基质谱图和Tris[G1]（OH）₆中鉴定出的任何峰都可以忽略不计，因此，唯一的峰是505.226 Da，对应于样品2。例如，Tris[G1]（OH）₆MALDI-ToF MS谱图中的445.016 Da和656.141 Da峰（图2B 红色）也位于空白的MALDI-ToF MS基质谱图（图2B 黑色）中，分别为445.017 Da和656.144 Da，差异分别为+0.001 Da和+0.003 Da。这些峰将不包括在分析中，因为它们与空白基质和Tris[G1]（OH）₆MALDI-ToF MS谱图匹配且具有相似的差异。因此，Tris[G1]（OH）₆的质量通过 MALDI-ToF MS 确认，但需要进行其他分析，例如 SEC 和 NMR 来确认样品的纯度。

样品 2：具有氯化物和质子端基的聚（2,2-二甲基丙酸酯）
3-氯-2,2-二甲基丙酸以碳酸钾为碱聚合（图4A）。用MALDI-ToF MS电离一端为氯化物、另一端为质子（M_n= 980 Da）的聚（2,2-二甲基丙酸酯）（PDMP）样品，以确定反应过程中形成的聚合物结构并分析不同的端基。MALDI-ToF MS样品制备首先制备NaTFA（THF中为2 mg/mL）、分析物（THF中为5-7 mg/mL）和DCTB（THF中为20 mg/mL）的储备溶液。制备这些溶液后，将5 μL Na⁺ 阳离子溶液、5 μL分析物溶液和10 μL基质溶液混合在微量离心管中并涡旋（阳离子：分析物：基质的比例为10：25：200，共20 mL）。接下来，从微量离心管中取出 1 μL 该混合物，并在 MALDI-ToF MS 靶板上干燥。对于基质，选择 DCTB，因为它与许多其他聚酯一起使用，但是，已经尝试了其他基质，例如 CHCA、HABA、GFR 和 DHB。CHCA、HABA和GFR对样品进行了良好的电离，但DHB被证明是不成功的。与三氟乙酸钾（KTFA）、三氟乙酸铯（CsTFA）、三氟乙酸锂（LiTFA）和三氟乙酸银（AgTFA）相比，NaTFA 离子效果更好，因为它与酯基团的氧相互作用更好。

MALDI-ToF MS谱图（图4B）证实，样品3的氯端基PDMP的分子量分布在600 Da至1600 Da的范围内。这意味着样品的分散度较低，因此使用MALDI-Tof MS分析软件，M_n、M_w和Đ值分别为980 Da、1070 Da和1.09。单同位素峰在反射器模式下得到充分分离，从而能够使用精确质量鉴定。

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图4：样品2的反应方案和MALDI-ToF MS质谱图。（A）. 使用3-氯-2,2-二甲基丙酸合成PDMP的反应方案。 （B） 样品2的MALDI-ToF MS质谱图。该完整的MALDI-ToF MS谱图显示了PDMP样品的总体分布，其中氯化物端基团（M_n= 980 Da）被Na⁺电离。请点击此处查看此图的大图。

为了确认聚合物重复的单位质量，计算了两个相邻峰之间的质量差。聚合物的重复单元具有观察到的平均分子量为100.056 Da，通过取600 Da至1300 Da范围内的八个峰（主要分布）的平均质量来证实这一点，仅比PDMP的理论重复单元（100.052 Da）低+0.004 Da，此外，其端基质量对应于一个氢（在前端）和一个氯化物（在背面）相对应结束）。

MALDI-ToF MS谱图显示了三种不同的分布，每种分布都对应于具有不同端基的聚合物。通过计算这些端基团的理论质量数并将其与MALDI-ToF MS光谱中观察到的质量数进行比较，可以识别和确认这些末端基团。为了进一步识别末端组，选择了单个n-mer进行分析（图5）。

PDMP的主要分布显示聚合物具有一种氢气（前端）和一种氯化物（后端，蓝色）。PDMP 的 8 聚体（图 5）的理论质量值由重复单元的质量（100.0524 Da x 8）加上 Cl 端基的质量（+ 34.9689 Da）和氢端基的质量（+ 1.0078 Da）加上钠阳离子的质量（+ 22.9892 Da）组成，从而产生 8 聚体总质量为 859.385 Da。8-mer [H-PDMP_8-Cl + Na]⁺ 的观测质量值为 859.426 Da，与理论值仅相差 +0.041 Da。

下一个分布（橙色）显示聚合物用后端的钠和氯化物取代了前端的质子。去质子化PDMP的8聚体的理论质量值由重复单元的质量（100.0524 Da x 8）加上Cl端基团的质量（+ 34.9689 Da）和两个钠基团的质量（+（22.9892 Da x 2））组成，从而产生8聚体总质量为881.367 Da。8-mer [Na-PDMP_8-Cl + Na]⁺ 的观测质量值为 881.413 Da，与理论值仅相差 +0.046 Da。

最后，PDMP的第三次分布（绿色）证实了环状低聚物质的存在。8 mer 环状 PDMP 的理论质量值由重复单元的质量（100.0524 Da × 8）加上一个钠基团的质量（+ 22.9892 Da）组成，产生 8 mer 的总质量为 823.409 Da。环状8聚体[PDMP8 + Na]+的观测质量值为823.448 Da，与理论值仅相差+0.039 Da。

聚合物上是否存在卤素可以通过 MALDI-ToF MS 来识别。线性聚合物上的端基有一个 Cl，由 [M⁺] 和 [M+2]⁺ 峰的比例约为 3：1 表示。表1显示了观察到的[M⁺]和[M+2]⁺峰之间的差异。第二个峰在761.3 Da [M+2]⁺处的理论丰度和观测丰度百分比分别为42.3%和42.2%（第一个峰为100%），这证实了聚合物端基上存在一个Cl基团。发现环状物质比线性钠化合物低 36 Da，比二钠化合物低 58 Da。此外，这种环状化合物不具有一氯物质所具有的 3：1 比例。这种氯化物可以通过 S_N2 攻击去除，羧酸盐位于另一端，从而导致环闭合。

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图 5：样品 2 的单个重复序列的 MALDI-ToF MS 质谱图。 该MALDI-ToF MS谱图显示主要峰为PDMP，氢和氯端基（M_n= 980 Da）用Na⁺电离。请点击此处查看此图的大图。

表1：来自MALDI-ToF MS的具有氢和氯端基团（M_n= 980 Da）的线性PDMP的[M⁺]和[M+2]⁺峰（[M⁺] = 100%）的观察到和理论峰丰度百分比和峰同位素强度之间的比较。线性聚合物上的端基有一个Cl，[M⁺]和[M+2]⁺峰的比例约为3：1。请按此下载此表。

样品 3：具有季铵和质子端基团的聚（2,2-二甲基丙酸酯）。
3-溴-2,2-二甲基丙酸以三乙胺（TEA）为碱聚合，然而，确定TEA正在取代末端基团的Br（图6A）。使用一侧为季铵、另一端为质子（M_n= 1410 Da）的 PDMP 样品将同位素分布与具有 Cl 端基的同位素分布进行比较。MALDI-ToF MS样品制备首先制备KTFA（THF中为2 mg/mL）、分析物（THF中为5-7 mg/mL）和DCTB（THF中为20 mg/mL）的储备溶液。制备这些溶液后，将5 μL K⁺ 阳离子溶液、5 μL分析物溶液和10 μL基质溶液混合在微量离心管中并涡旋（阳离子：分析物：基质的比例为10：25：200，共20 mL）。接下来，从微量离心管中取出 1 μL 该混合物，并在 MALDI-ToF MS 靶板上干燥。对于基质，选择 DCTB，因为它与许多其他聚酯一起使用。加入钾阳离子以确认样品是否自电离。

聚合物的端基上含有季氮（带正电荷），可以自电离。MALDI-ToF MS谱图证实了这一点，因为无论样品制备中是否使用K⁺ 或Na⁺ ，质荷比（m/z）都没有变化。此外，MALDI-ToF MS光谱证实末端基团上存在带正电荷的季铵，因为Br是一个良好的离去基团。

MALDI-ToF MS谱图证实，PDMP的分子量分布在600 Da至2200 Da的范围内（图6B）。这意味着样品的分散度较低，因此使用 MALDI-Tof MS 分析软件的 M_n、M_w 和 Đ 值分别为 1410 Da、1540 Da 和 1.08。

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图 6：样品 3 的反应方案和 MALDI-ToF MS 质谱图。（A） 样品3的反应方案。以三乙胺为碱的3-溴2,2-二甲基丙酸合成PDMP的反应方案。 （B） 该完整的MALDI-ToF MS谱图显示了具有季铵端基团（M_n= 1410 Da）的线性PDMP的总体分布。请点击此处查看此图的大图。

为了确认聚合物是否具有相同的重复单元（单体），计算了两个相邻峰之间的差异。聚合物的重复单元观察到的平均分子量为 100.0535 Da。通过查看 12 个峰（主要分布）的平均值（范围从 900 Da 到 2300 Da）证实了这一点，仅比理论重复单位（100.0524 Da）高出 +0.0011 Da。

MALDI-ToF MS谱图显示出两种不同的分布。其中一种分布显示聚合物以羧酸和带正电荷的季铵为端基（黑色），而另一种分布（紫色）显示羧酸中质子的损失和钾离子的添加。为了进一步鉴定末端组，选择单个n-mer进行分析（图7）。

具有季铵末端基团的 12 聚体 PDMP 的理论质量值由重复单元的质量（100.0524 x 12）加上季铵末端基团的质量（+ 101.1199）和氢末端基团的质量（+ 1.0078）组成，从而产生 12 聚体总质量为 1302.757 Da。12 mer [H-PDMP_12-TEA]⁺的观测质量值为 1302.730 Da，仅比理论值低 -0.027 Da。

一侧为季铵端基团的 12 聚体 PDMP 的理论质量值，质子被另一个钾离子取代，由重复单元的质量（100.0524 × 12）加上季铵端基团的质量（+ 101.1199）和钾端基团的质量（+ 38.9637）组成，产生 12 聚体总质量为 1340.713 Da。12-mer [K-PDMP_12-TEA]⁺ 的观测质量值为 1340.700 Da，仅比理论值低 -0.013 Da。

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图 7：样品 3 的单个重复序列的 MALDI-ToF MS 质谱图。 该MALDI-ToF MS谱图显示了具有季铵端基团（M_n= 1410 Da）的线性PDMP的主要分布。请点击此处查看此图的大图。

样品 4：线性聚（黄铜磺酸乙二醇酯）
MALDI-ToF MS表征的下一个聚合物样品是线性聚（黄铜磺酸乙二醇酯）（l-PEB）。这是由大环单体乙烯铜磺酸盐合成的，该环具有包含两个酯基团的十七元环（图8A）。为了了解聚合物结构内的官能团和结构变化，探索了四种不同的表征技术：MALDI-ToF MS、¹H-NMR、SEC 和傅里叶变换红外光谱（FTIR）。¹H-NMR、SEC和FTIR证实了环二酯的去除和α-炴基-ω-羟基-PEB的形成。然而，这些技术没有检测到任何类型的副产物形成。另一方面，l-PEB的MALDI-ToF MS谱图（图8B）表现出三种不同的质量分布，表明形成了三种不同的PEB：分别为α-羟基-ω-羟基-PEB（1）、α-炔啉-ω-炔傧-PEB（2）和α-炔傕基-ω-羟基-PEB（3）（图8B）。

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图 8：含 Na⁺ 的 l-PEB 的 MALDI-TOF 光谱。（A）线性聚（黄铜磺酸乙二醇酯）结构。（1）α-羟基-ω-羟基-PEB （2）α-炔丙基-ω-炔丙基-PEB （3）α-炔基-ω-羟基-PEB。（B）鉴定出3种分布，包括α-羟基-ω-羟基-PEB（1）、α-炔丙基-ω-炔丙基-PEB（2）和α-炔丙基-ω-羟基-PEB（3）。请点击此处查看此图的大图。

使用DCTB作为非极性聚合物的基质，在MALDI-ToF MS上分析 l-PEB样品。MALDI-ToF MS样品制备首先制备NaTFA（THF中为1 mg/mL）、分析物（THF中为5 mg/mL）和DCTB（THF中为20 mg/mL）的储备溶液。制备这些溶液后，将1 μL Na⁺ 阳离子溶液、5 μL分析物溶液和20 μL （4）基质溶液混合在微量离心管中并涡旋（阳离子：分析物：基质的比例为1：25：400，共26 mL）。接下来，从微量离心管中取出 1 μL 该混合物，并在 MALDI-ToF MS 靶板上干燥。观察到的每种分布的分子量与[M + Na]⁺ 离子的精确分子量的偏差在0.03 Da以内。

6-mer α-羟基-ω-羟基-PEB （1）的理论质量值由重复单元的质量（270.1831 Da x 6）加上 2-羟乙氧基端基的质量（+ 61.0290 Da）组成，加上氢端基的质量（+ 1.008 Da），加上钠阳离子（+ 22.9892 Da），总共产生 1706.124 Da。6-mer α-羟基-ω-羟基-PEB （1）的观测质量值为 1706.133 Da，仅比理论值高出 +0.009 Da。

5-mer α-炔丙基-ω-炔丙基-PEB （2）的理论质量值由重复单元的质量（270.1831 Da x 5）加上十字硅酸乙烷的质量减去 OCH₂CH₂O （+ 210.1620 Da）组成，加上两个炔丙基醚端基的质量（+ 55.0184 Da x 2），加上钠阳离子（+ 22.9892 Da），总共产生 1694.103 Da。5-mer的α-炭基-ω-炍傘基-PEB （2）的观测质量值为1694.127 Da，仅比理论值高出+0.024 Da。

6-mer α-炔丙基-ω-羟基-PEB （3）的理论质量值由重复单元的质量（270.1831 Da x 6）加上炔基醚端基的质量（+ 55.0184 Da）组成，加上氢端基的质量（+ 1.008 Da），加上钠阳离子（+ 22.9892 Da），总共产生 1700.113 Da。6-mer α-炔基-ω-羟基-PEB （3）的观测质量值为 1700.139 Da，仅比理论值高出 +0.026。

样品5：叠氮化直链聚（黄铜磺酸乙二醇酯）
此外，I-PEB（样品6）通过其醇端基的酯化作用与6-叠氮己酸进行官能化（图9），产生叠氮化的l-PEB（样品7）。还使用样品制备技术作为母体聚合物（样品6）在MALDI-ToF MS（图10）上分析了获得的产物。观察到的每种分布的分子量与[M + Na]⁺离子的精确分子量的偏差在0.04 Da以内。酯化后，具有两个羟基端基团（1）的 l-PEB 的 [M + Na]⁺ 离子显示出质量变化，因为它们从（1）转化为 α-叠氮基-ω-叠氮基-PEB （4）。此外，将具有一个羟基端基和一个炔丙基端基（3）的 l-PEB 转化为 α-炔基-ω-叠氮基-PEB （5）。然而，（2）由于其两个炔烃端基团而保持未反应。

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图9：通过6-叠氮己酸反应方案使线性聚（黄铜磺酸乙烯酯）与醇端基酯化。 α-羟基-ω-羟基-PEB （1）转化为 α-叠氮基-ω-叠氮基-PEB （4），α-炔基-ω-羟基-PEB 转化为 α-炔基-ω-叠氮基-PEB （5）。α-炔丙基-ω-炔基-PEB （2）由于炔烃端基不发生酯化反应而保持未反应。请点击此处查看此图的大图。

α-炔丙基-ω-叠氮基-PEB （5）的 6 聚体的理论质量值由重复单元的质量（270.1831 Da × 6）加上炔基醚端基的质量（+ 55.0184 Da）组成，加上叠氮己酸酯端基的质量（+ 140.0824 Da），加上阳离子钠（+ 22.9892 Da），总共产生 1839.188 Da。6-mer α-炔基-ω-叠氮基-PEB （5）的观测质量值为 1839.184 Da，仅比理论值低 -0.004 Da。此外，（5）亚稳态离子（5-N₂）峰的存在是叠氮化物官能化的另一个迹象，因为只有当分子中存在叠氮化物时才会形成亚稳态离子。

亚稳态峰（5-N₂ + Na⁺）的6聚体的理论质量值为1815.126 Da，这是通过使用亚稳态峰和α-叠氮基-ω-羟基-PEG峰质量差图的方程确定的（图11）。亚稳态峰6聚体的观测质量值为1815.089 Da，仅比理论值低-0.031 Da。该图表明，在1000至2000 Da的质量范围内，亚稳峰的理论质量值比（5）低24-24.1 Da。

6-mer 的 α-叠氮基-ω-叠氮基-PEB （4）的理论质量值由重复单元的质量（270.1831 Da × 6）加上 6-叠氮己酸酯端基的质量（+ 140.0824 Da）组成，加上 2-氧乙基-6-叠氮己酸酯端基的质量（+ 200.1035 Da），加上阳离子钠（+ 22.9892 Da），总共产生 1994.273 Da。α-叠氮基-ω-叠氮基-PEB （4）的 6 聚体的观测质量值为 1994.296 Da，比理论值高出 +0.023 Da。

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图 10：含 Na⁺ 的叠氮化 l-PEB 的 MALDI-ToF 光谱。 其中包括α-炔傧基-ω-炔基-PEB （2）、α-叠氮基-ω-叠氮基-PEB （4）和α-炔基-ω-叠氮基-PEB （5）的三种分布。请点击此处查看此图的大图。

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图 11：α-叠氮基-ω-羟基-PEG 及其亚稳态化合物相对于 α-叠氮基-ω-羟基-PEG 质量（平均质量 1700 Da）的质量差异的图形说明。 该图源自 α-叠氮基-ω-羟基-PEG 的 MALDI-ToF 光谱。请点击此处查看此图的大图。

样品 6：广泛分散的梳状聚合物
最终反应方案是梳状聚合物，具有具有聚（乙二醇）侧链的硫醚重复单元^9。由400 M_n 甲醚-PEG-炔基和1,6-己二硫醇（CP MeO-PEG-400 HDT; 图12A）使用NaTFA进行分析。选择钠作为反离子，因为醚和硫醚更容易与钠、锂和钾电离，而不是铯等高碱土金属电离。这些样品使用非极性基质 DCTB 运行，尽管其他基质（CHCA 和 DT）也进行了测试，但结果很差。MALDI-ToF MS样品制备首先制备NaTFA（THF中为1 mg/mL）、分析物（THF中为5 mg/mL）和DCTB（THF中为20 mg/mL）的储备溶液。制备这些溶液后，将1 mL阳离子溶液、5 mL分析物溶液和20 mL基质溶液混合在微量离心管中并涡旋（阳离子：分析物：基质的比例为1：25：400，共26 mL）。接下来，从微量离心管中取出 1 mL 该混合物，并在 MALDI-ToF MS 靶板上干燥。由于NaTFA作为反离子添加到样品中，因此MALDI-ToF MS质谱显示出已知样品的预期Na⁺ 加合物。此外，还观察到这些峰值上方大约增加了 16 Da、32 Da 和 48 Da，并将在本文中稍后讨论。

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图12：样品6的反应方案和样品6的MALDI-ToF质谱图（A） 具有多个HDT间隔区和400 M_n PEG侧链的二硫醇-璦基梳状聚合物的化学结构和反应条件。（B）样品6的MALDI-ToF质谱，CP MeO-PEG-400 HDT。主要重复单位 = 550.30 Da，次要重复单位 = 44.02 Da请点击此处查看此图的大图。

MALDI-ToF MS证实了广泛的分布（SEC分散度= 2.88; 图12B）CP MeO-PEG-400 HDT。单同位素峰（仅包括最丰富的元素同位素，即 ¹²C、 ¹H、 ¹⁶O 和 ³²S）得到充分分离，从而能够使用精确质量鉴定。所有理论质量计算均使用每种元素的单同位素质量确定。由于样品的分散度较宽（SEC 为2.88），MALDI-ToF质谱无法用于计算M_n、M_w或 Đ。MALDI-ToF MS在表征狭分散聚合物（Đ < 1.3）方面表现出色，但在对广泛分散的聚合物进行全面表征方面可能遇到困难。在描述具有宽分散性的聚合物时，只有质谱的低分子量端才能用MALDI-ToF MS很好地分离和可见，不包括任何较高分子量的物质。这种现象称为低质量偏差。由于这种情况，仅通过MALDI-ToF MS无法对梳状聚合物进行全面表征。因此，SEC与MALDI-ToF MS结合使用，以获得准确的M_n，M _w和Đ值。

为了确认梳状聚合物的存在，对标准线性或环状聚合物采取了类似的方法。梳状聚合物的每个重复单元都含有狭窄分布的 M_n = 400 个 PEG 侧链，因此探索了梳状聚合物重复单元以确定每个侧链中是否存在预期产物。此外，反应溶液中还残留了少量聚合的起始物质（300-700 Da），该材料也进行了表征。

在完整的MALDI-ToF MS谱图中，可以看到6至15聚体MeO-PEG-OH 的分子量较低和较高。最初，在MeO-PEG-炔基起始材料的MALDI-ToF MS谱图中，这些MeO-PEG-OH 是不可见的（图13;顶部谱图）。这些峰的出现是由于 MeO-PEG-炔基与 MeO-PEG-OH 的相对浓度。随着梳状聚合物反应的进行，MeO-PEG-炔丙基被掺入产物中。因此，炔烃起始材料与MeO-PEG-OH的比例开始降低，这在MALDI-ToF MS谱图中显示MeO-PEG-OH 未官能化（图13;底部谱图）。

至于产品质量分布，所有后续计算均使用精确质量值。起始材料[MeO-（PEG₁₀）-CH₂CCH + Na]⁺ 的一个重复单位的理论质量值为44.0262 Da。该重复单位质量乘以重复单位数，每条侧链为 10 （44.0262 Da x 10）加上 α-甲氧基端基的质量（+ 31.0183 Da）和 ω-炔基端基的质量（+ 39.0235 Da）加上钠阳离子的质量（+ 22.9892 Da）产生总 10 聚体质量为 533.2932 Da。10 mer PEG + Na⁺ 的观测质量数值为 533.239 Da，比理论值低 -0.054 Da（图 13）。在完整的MALDI-ToF MS谱图中，该系列的6至9聚体为下方，11至15聚体为上方。低分子量谱中较小的偏移峰序列对应于未官能化的MeO-PEG-OH 起始材料，其中11聚体的理论质量值由重复单元的质量（44.0262 Da x 11）加上α-甲氧基端基的质量（+ 31.0184 Da）和ω-氢端基的质量（+ 1.008 Da）和钠阳离子的质量（+ 22.9892 Da）组成，总共产生11聚体质量为 539.304。11-mer + Na⁺ 的观测质量值为 539.252 Da，仅比理论值低 -0.052 Da。

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图 13：样品 8（下）的起开始物质（上）和低分子量物质的 MALDI-ToF 质谱（从 530-615 Da 放大），CP MeO-PEG-400 HDT。 炔烃起始材料与MeO-PEG-OH（顶部光谱和红色）的比例开始下降，这表明CP MeO-PEG-400 HDT MALDI-ToF质谱（底部光谱）中未官能化的MeO-PEG-OH（底部光谱和蓝色）。请点击此处查看此图的大图。

至于环梳聚合物，它们具有不同聚合程度的质量可以乘以所需 n-mer 的各个部分。2 聚体 [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ 的理论质量值由每条 PEG 链的重复单元的质量组成，其中每条链大约有 8 个，（44.0262 Da x 16）加上每条 PEG 链的末端甲基末端基团的质量（+ 15.0235 Da x 2）加上曾经是炔基、现在与硫醇反应的碳质量（+ 41.0391 Dax 2）加上与炔烃反应的HDT质量（+ 148.0380 Da x 2）和钠阳离子的质量（+ 22.9892 Da），产生总2聚体质量为1167.599 Da。2 mer [CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺ 的观察质量数值为 1167.626 Da，比理论值高出 +0.027 Da（图 14）。虽然观察到了较低分子量的环状结构，但无法观察到两端硫醇或两端双键的线性化合物。

这些含硫醚的聚合物也可以发生氧化，将硫醚转化为亚砜⁹。这解释了根据氧化程度添加多种氧（+ 15.9949 Da x n）;这与 K+ 加合物不同，K+ 加合物与 Na⁺ 加合物相差 +15.9739 Da。对于2聚体[CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺的单次氧化^，理论质量值为1183.594 Da，而观测质量值为1183.620 Da，仅比理论值增加了+0.026 Da。对于2聚体[CP-MeO-PEG₁₆ HDT + Na]⁺的双重氧化，理论质量值为1199.590 Da，而观测质量值为1199.613 Da，仅比理论值增加了+0.023 Da。最后，对于2聚体[CP-MeO-PEG16 HDT+Na]⁺的三氧化，理论质量值为1215.585 Da，而观测质量值为1215.617 Da，仅比理论值增加了+0.032 Da。

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图14：样品8的MALDI-ToF质谱图，CP MeO-PEG-400 HDT。 从 1165-1254 Da 放大显示环状 2 聚体梳状聚合物产物，具有不同数量的 PEG 重复单元和不同程度的硫醚氧化。请点击此处查看此图的大图。

氧化可以通过进行反离子研究来进一步确认。这需要使用不同的电离阳离子，例如 K⁺，并比较 MALDI-ToF MS 光谱中峰的偏移。使用 KTFA 而不是 NaTFA 在 MALDI-ToF MS 上运行 CP MeO-PEG-400 HDT 样品（图 15）。由于 Na⁺ 和 K⁺ 之间的质量差，这将峰的所有质量向上移动 +15.9739 Da。对于K⁺ 加合物的分析，MALDI-ToF MS谱图中不存在未氧化聚合物（1183.574 Da_Theo）。对于2聚体[CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ 的单次氧化，理论质量值为1199.569 Da，而观测质量值为1199.567 Da（仅为-0.002 Da），对于2聚体[CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ 的双重氧化，理论质量值为1215.564 Da，而观测质量值为1215.572 Da，差异仅为+0.008 Da，对于2聚体[CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ 的三重氧化，理论质量值为1231.558 Da，而观测质量值为1231.563 Da（仅+0.005 Da），对于新形成的2聚体[CP-MeO-PEG₁₆ HDT + K]⁺ 的四氧化，理论质量值为1247.553 Da，而观测质量值为1247.551 Da（仅为-0.002 Da）。应该注意的是，聚合物在运行Na⁺ 和K⁺ 加合物之间进一步氧化，导致未氧化产物的损失并形成CP MeO-PEG-400 HDT的四氧化。还可以注意到，虽然聚合物确实与 Na⁺ 和 K⁺ 加合物一起飞行，但 Na⁺ 加合物的信噪比明显更高，这突出了使用 Na⁺ 进行主要表征的选项。

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图15：样品8的MALDI-ToF质谱图，CP MeO-PEG-400 HDT。 从 1195-1254 Da 放大显示环状 2 聚体梳状聚合物产品，具有不同数量的 PEG 重复单元和不同程度的硫醚氧化。请点击此处查看此图的大图。

讨论

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MALDI-ToF MS是一种用于表征合成聚合物的高效技术，由于其软电离机制，可提供精确的测量和最小的碎裂。在这种方法中，基质从激光吸收能量并将其转移到分析物²⁶。这种能量导致聚合物汽化，通过与阳离子化剂的相互作用电离，并解吸到真空中。电离分析物通过飞行管，在那里根据其质荷比（m / z）^26,27进行检测。该方法适用于测定单分散分子的质量，对于中度分散（Đ = 1.1-1.3）和高度分散的聚合物同样有效，其中可以确定重复单位质量和端基。对于中度分散的聚合物，MALDI-ToF MS还提供分散度（Ð）、数平均分子量（M_n）和重量平均分子量（M_w）。

但是，应注意该技术的几个局限性。MALDI-ToF MS在分析具有高分散度（Đ > 1.3）的聚合物时表现出低质量偏差，这意味着分布中质量较低的聚合物在光谱中占主导地位，而质量较高的物质是低强度峰或不存在^28,29。此外，对于高于 10,000 Da 的聚合物，分辨率会显着下降，而超过 15,000 Da 的聚合物可以更好地在线性模式下分析。然而，与反射器模式相比，线性模式会牺牲同位素峰值分辨率。此外，MALDI-ToF MS 依赖于聚合物有效电离的能力。具有共轭体系或杂原子的聚合物比聚乙烯或聚丙烯等饱和碳氢化合物更容易电离，而聚乙烯或聚丙烯通常需要化学修饰才能电离^30,31。

样品制备是获得成功结果的关键步骤。最重要的方面之一是为聚合物分析物^11,32选择合适的基质。例如，DCTB 和 GFR 等基质适用于非极性聚合物，而 DHB 和 CHCA 可以比较极性聚合物，以确定哪种基质提供最高分辨率的峰。此外，选择合适的溶剂来溶解基质和分析物可确保适当的共结晶，从而增强激光烧蚀并提高所得 MALDI-ToF MS 光谱^33,34,35 的分辨率。同样，选择合适的阳离子化剂对于最大限度地提高电离效率和产生清晰、可区分的峰至关重要。

一旦选择了基质和阳离子化剂，就可以优化基质：分析物：阳离子的比例。首先制备所选阳离子（THF 中为 1 mg/mL）、分析物（THF 中为 5 mg/mL）和基质（THF 中为 20 mg/mL）的储备溶液。建议起始体积比为 1：5：20 μL（阳离子：分析物：基质），对应于总体积为 26 μL 中约 1：25：400 mg/mL 的浓度比。如果这种初始混合物不能产生良好的分辨率光谱，则可以使用基于网格的方法进行系统优化（表2）^10,16。在此设置中，分析物体积是固定的，而基质体积在色谱柱上递增乘以 4，阳离子体积在行中乘以 4。该网格允许用户确定电离和分辨率的最佳比率。如果其中一个外部网格条件提供了改进的性能，则可以以该比率为中心生成一个新网格，继续 4 次调整的倍数以进一步细化。一个好的起点是评估光谱是否包含高强度峰、低基线噪声和分辨率良好的同位素分辨率。这个过程可能非常耗时，特别是对于可能需要在 3 x 3 制备网格中测试多种基质和阳离子的新型或复杂聚合物。

表2：可以创建和测试实验比率的系统网格。 阳离子、分析物和基质的比例分别为 1：5：20 μL 来启动（1：25：400 mg/mL）阳离子：分析物：基质，总共 26 mL。分析物体积固定为 5 μL （25 mg/mL）。基质和阳离子比率分别在列和行中递增乘以 4。请按此下载此表。

将样品应用于MALDI-ToF MS靶板后，使用干燥液滴法，将MALDI-ToF MS板加载到MALDI-ToF MS仪器中。MALDI-ToF MS数据采集参数，如激光功率、激光束直径、检测器增益和脉冲离子提取，可以进行微调，以实现更高的分辨率和更清晰的峰分离。可以系统地改变这些值，以确定峰强度、降低基线噪声并提高峰分辨率（图 1）。

仪器参数和样品制备比例的优化并不遵循严格的线性工作流程。操作员可以从首选的样品制备方法开始，并以线性模式筛选以评估聚合物是否电离，或者他们可以首先微调仪器方法（例如，激光功率，脉冲提取），然后再使用3 x 3制备网格修改样品混合比例。工作流程的灵活性通常是必要的，尤其是在分析新的、未知的或表征不佳的材料时。

优化完成后，可以重复使用样品制备方案，尽管操作员间或日间仍可能出现轻微的差异。对每次采集运行进行校准可以最大限度地减少变化，并且在遵循一致的方案时，峰质量差异通常保持在 0.1 Da 以下。因此，如果仪器方法和样品制备保持不变，则可以实现跨用户和跨天的重现性。如果问题仍然存在，表 3 中提供了包含用户可能遇到的常见问题和解决方案的表格。

表3：基于实践经验的常见问题和故障排除策略。 该表有助于解决样品制备、数据采集和数据分析过程中遇到的问题。有关特定于仪器的故障排除，请查阅 MALDI-ToF MS 制造商手册或咨询合格的技术人员。请按此下载此表。

校准是确保质量测量准确性的关键步骤。可以使用外部和内部校准，但所使用的校准品必须在聚合物分析物的质量范围内，这一点至关重要。正确的校准可确保正确测定分析物的质量。

在打开MALDI-ToF MS质谱图的情况下进行数据分析，并可以选择峰拾取以进行进一步分析。通过将观察到的质量与使用化学绘图软件计算的理论值进行比较，可以确认单分散大分子以及特定 n-mer 的低、中和高分散聚合物的质量。这些比较有助于验证单分散大分子的总质量，或者在特定 n-mer 的低、中和高分散聚合物的情况下，识别端基并确认重复单位质量。

总之，优化基质、阳离子化条件和实验比例对于获得高分辨率MALDI-ToF MS数据至关重要。校准可确保准确的质量测量。使用峰拾取和理论质量比较进行数据分析可以对聚合物进行全面表征，包括端基和重复单位质量的识别。该技术可用于单分散大分子，以及低分散、中度分散和高度分散的合成聚合物。未来的方向包括通过无溶剂样品制备方法和串联质谱（MS/MS）36,37,38扩大复杂聚合物结构的表征，如聚合物薄膜共混物、环状聚合物和超支化聚合物。仪器组合，例如使用尺寸排阻色谱（SEC）对样品进行分馏，然后使用MALDI-ToF MS进行结构分析，可用于鉴定低质量数结构，确定分数分散性，并表征高度分散聚合物样品中的端基39,40,41。此外，新的数据分析方法，包括手动输入或软件辅助生成肯德里克质量缺陷图，允许将质谱转换为二维图，从而有助于^{识别样品中的}多个端基^2,42。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者对本研究中使用的树枝状校准品有经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 ACS-石油研究基金 66398-ND7、博耶教授职位和杜兰大学的支持。我们还通过 NSF MRI 2319960收到了更新的 MALDI-ToF MS。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐	TCI化学品	D1601	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/D1601
1,1,1-三（羟甲基）丙烷	米利波尔西格玛	148083	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/148083?srsltid=AfmBOoqaMzcy1xravp1h2QE 0myfY5gjuEBfOIv2o882Wb _xcB4Ol4CMW
1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]dec-5-烯	米利波尔西格玛	345571	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/345571?srsltid=AfmBOooLQXIhWaMnO63nE xu-Y5MJoJID6RJiby0NXyu DHOxXYjle_kMT
1,6-己二硫醇 98% （HDT）	大江星	H0334	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/H0334
2-（4-羟基苯嘧啶）苯甲酸）（HABA）	米利波尔西格玛	H5126	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/h5126
2,2-双（羟甲基）丙酸	米利波尔西格玛	106615	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/106615?srsltid=AfmBOopCRoa1N_UiDK 56NKhDKdlAN8feUrMxVYhul Muz2en6NYEGIh4b
2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮99%（DMPA）	西格玛-奥尔德里奇	196118	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/196118?srsltid=AfmBOoqVTif6KNwIr6A -bIgnXbkrvWKIUNH6qOsc RseQLNVKi0DMWPb-
2,5-二羟基苯甲酸（DHB）	米利波尔西格玛	149357	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/149357
4-（二甲氨基）吡啶	米利波尔西格玛	522821	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/522821?focus=products&page=1&perpage= 30&sort=relevance&术语=522821 &类型=产品
6-溴己酸	米利波尔西格玛	150452	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/search/6-bromohexanoic-acid?focus=products&page=1 &perpage=30&sort=relevance&术语= 6-溴己酸%20酸&类型=产品
苯甲醛二甲基缩醛	米利波尔西格玛	226076	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/226076?srsltid= AfmBOorbjP7zD9MO3g5Xk LL3rNZ02PhfkXoRfe3EjRK7 TrqJ-kEOrTCN
苯甲酸	米利波尔西格玛	242381	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/242381?srsltid=AfmBOook_iIcMnwuB3e _j-KetQyyHJ6Qq86jSK8 ZVxC3BorQgkO8Xg5I
布鲁克 UltraFlextreme	布鲁克道尔顿		https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/maldi-tof/ultraflextreme.html
氯仿	费雪科学	AA32614K7	https://www.fishersci.com/shop/products/chloroform-acs-99-8-thermo-scientific/AA32614K7 ？searchHijack=true&searchTerm= 氯仿-acs-99-8-thermo-scientific &searchType=快速&matchedCatNo =AA32614M6
地咻醇，血压，98.5-101% （DT）	费雪科学	18-602-270	https://www.fishersci.com/shop/products/dithranol-bp-98-5-101-spectrum-chemical/18602270
乙烯萳酸盐	米利波尔西格玛	W354309	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/w354309?utm_source=google&utm_medium= CPC&utm_campaign=8692675663&utm _content=86098110623&gad_source= 1&gclid=CjwKCAiApY-7BhBjEiwAQMr rEdJTcKN5TEFkP1uHvRlVign3lwg2cj5 _spBUCrfi6exZ3Ur5sJkARxoCfWsQ AvD_BwE
Galvinoxyl，自由基	米利波尔西格玛	G307型	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/g307?srsltid= AfmBOopoWGDMXtLk5Erf0rVyl 7j442uyg8rIWkfBjhHZ2z0dDktH3y8-
甲醇	费雪科学	A456	https://www.fishersci.com/shop/products/methanol-optima-lc-ms-grade-thermo-scientific/A4564
钯金，10% 碳，487 型，干	费雪科学	AAA1201206	https://www.fishersci.com/shop/products/palladium-10-carbon-type-487-dry-thermo-scientific-1/AAA1201206#?keyword=palladium%20on%20carbon
聚乙烯乙二醇）单甲醚350&NBSP;Mn （MeO-PEG-OH 360）	费雪科学	AA4156022	https://www.fishersci.com/shop/products/polyethylene-glycol-monomethylether-350-thermo-scientific/AA4156022
三氟乙酸钾（KTFA）	米利波尔西格玛	281883	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/281883
炔丙醇	费雪科学	A10295.0F	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A10295.0F?SID=srch-hj-A10295.0F
丙炔基溴化物 97%（80% w/w 在甲苯中用 MgO 稳定）	费雪科学	AAL1059514	https://www.fishersci.com/shop/products/propargyl-bromide-97-80-w-w-toluene-stab-magnesium-oxide-thermo-scientific/AAL1059514#?keyword=Propargyl%20bromide%2097%%20（80%%20w/w%20in%20甲苯%20稳定%20with%20MgO）
叠氮化钠	米利波尔西格玛	S2002	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/s2002
氢化钠60%分散在矿物油中	米利波尔西格玛	452912	https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/452912?srsltid= AfmBOooZhbCm_qtgKU99922Y91zI qEOWONlEGxjZn0mdSJF2L5hW1uVn
三氟乙酸钠（NaTFA）	奥克伍德	MFCD00013217	https://www.oakwoodchemical.com/ProductsList.aspx?CategoryID=-2&txt 搜索=1549&外部超链接=1
SpheriCal 纯低频套件（250 - 7,500 Da）	聚合物工厂	PFS-104型	https://www.polymerfactory.com/product-page/spherical-low-range-kit-500-7-500-da
四氢呋喃（THF）	费雪科学	T427型	https://www.fishersci.com/shop/products/tetrahydrofuran-optima-fisher-chemical-3/T4274#?keyword=tetrahydrofuran%20optima
反式-2-[3-（4-叔-丁基苯基）-2-甲基-2-丙烯基]丙二腈（DCTB）	大江星	B3635型	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/B3635
&α;-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）	大江星	C1768	https://www.tcichemicals.com/US/en/p/C1768

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