方法文章

开发一种创新的基于 LED 的照明装置，用于 Rose Bengal 光动力疗法的 体外 应用

DOI：

10.3791/68462

⸱

2025年9月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm, CHU Lille, U1189-ONCO-THAI-Assisted Laser Therapy and Immunotherapy for Oncology, University of Lille, 2CNRS, Inserm, CHU Lille, UMR9020-U1277-CANTHER-Cancer Heterogeneity Plasticity and Resistance to Therapies, University of Lille

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本手稿介绍了一种新颖、创新的 3D 打印照明设备，用于在 体外研究 Rose Bengal 介导的光动力疗法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种新的光动力疗法 （PDT） 设备，用于评估 Rose Bengal （RB） 介导的 PDT 体外疗效。该设备名为 CELL-LED-550/3，由两个 3D 打印部件组成，一个从单个 LED（光源部分）产生 550 nm 绿光，另一个将该光分配到 96 孔细胞培养板（光分配器部分）。光源部分由具有三种不同模式的驱动器控制，使光分配器部分能够向孔的底部外表面提供三种不同的辐照度水平：0.02 mW/cm2、0.23 mW/cm2 或 0.62 mW/cm2。光分配器部分设计用于单独和同时照亮油井。为了证明 CELL-LED-550/3 装置的相关性，评估了其通过 RB 介导的 PDT 诱导 HepG2 肝细胞癌细胞死亡的能力。首先，用增加浓度的孟加拉玫瑰（一种光敏剂）处理HepG2细胞2小时，吸收峰（最高峰）在550 nm左右。然后使用CELL-LED-550 / 3设备在0.3 J / cm 2,0.6 J / cm2和1.2 J / cm2的光剂量下将其设置为最大辐照度水平（分别为8分钟和4秒，16分钟和8秒，以及32分钟和16秒）照亮处理过的细胞。最后，在PDT后24小时使用Cell-Titer Glo测量活力。实验结果表明，使用CELL-LED-550 / 3装置的RB介导的PDT能够诱导HepG2细胞的活力降低，其方式取决于孟加拉玫瑰的浓度和给药剂量的光。基于本文中提出的概念验证，CELL-LED-550/3 设备为 RB 介导的 PDT 研究增加了进一步的工具。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2020 年新增病例超过 905,000 例，死亡人数超过 830,000 例，原发性肝癌是全球第七大常见癌症和癌症相关死亡的第二大原因1。在原发性肝癌中，肝细胞癌（HCC）是最常见的形式，约占病例的90%2。由于未被发现的慢性肝病和监测依从性差，只有 25% 的 HCC 患者在疾病早期被诊断出来3.这些早期诊断患者通常通过肝切除术、肝移植或以治愈为目的的局部消融治疗进行治疗，预后良好，五年生存率超过 70%4,5。对于其他 75% 的患者（中期或晚期诊断的 HCC 患者），尽管包括靶向治疗、免疫治疗和联合方案在内的创新治疗方式带来了生存获益6，但预后仍然很差：这组患者的五年生存率实际上不超过 30%，而转移性患者亚组的五年生存率下降到 2%6.因此，探索替代治疗方案对于改善中期或晚期 HCC 患者的治疗结果和延长生存期至关重要。光动力疗法 （PDT） 是一种在皮肤病学中广泛采用的抗癌疗法7，可能是一种合适的替代候选者。

PDT是一种光化学处理，结合使用光敏剂（PS），适当波长的可见光和分子氧来产生细胞毒性活性氧（ROS）8。PDT的抗癌作用源自三种ROS诱导的机制9：首先，对恶性细胞的直接细胞毒性作用10，然后对肿瘤脉管系统的损害，诱导肿瘤组织缺氧，营养剥夺和消退11，最后通过从受损或垂死的肿瘤细胞中释放危险信号和肿瘤抗原来诱导炎症反应12.三十多年来，PDT 一直是深入研究的主题，旨在评估其治疗各种类型和形式的癌症的潜力 13,14,15,16,17,18。根据这些研究证明的功效 19,20,21，PDT 目前在皮肤病学中用于治疗非黑色素瘤皮肤癌 7。对于其他适应症，近年来临床研究的数量有所增加，这表明将单独使用或与标准治疗联合使用的 PDT 投入临床实践方面付出了巨大努力 22,23,24。

存在多种用于 PDT25 的光敏剂。其中，孟加拉玫瑰（RB）已被证明可以作为针对喉部肿瘤细胞26、黑色素瘤细胞27、乳腺癌细胞28和前列腺癌组织29的有效光动力剂。本文介绍的工作基于评估RB介导的PDT是否对HCC细胞也有效的需要。

这样的评估确实需要事先开发一种基于绿色 LED 的设备，专用于 96 孔细胞培养板的 550 nm 照明。该设备30实现了分为两部分的设计：光源部分从单个LED产生550nm绿光，而光分配器部分通过使用光纤束将该光单独分配到96孔并远离LED。这种由两部分组成的设计首先可以防止电池免受由于 LED 内部产生的不受控制的热量而可能产生的有害热效应，其次，能够照亮细胞培养箱内的细胞，同时将光源部分及其电子元件（包括 LED）保持在室外。这些创新特性使所谓的 CELL-LED-550/3 设备比已发表的基于 LED 的系统具有主要优势，这些系统专为多孔板照明而设计 31,32,33,34,35。

在本文中，首先详细介绍了 CELL-LED-550/3 器件。然后，作为概念验证，细胞活力研究证明了在2D HCC细胞培养模型（HepG2）中使用CELL-LED-550 / 3进行RB介导的PDT的功效30。因此，除了价格低廉且便于携带之外，CELL-LED-550/3 设备也是 RB 介导的 PDT 实验的特别相关的工具。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1、设备构造

注意：CELL-LED-550/3 设备的两个部分是单独制造的，并且仅作为最后一步，它们才入在一起。

  1. 光源部分的构造
    1. 将大小合适的风扇散热器组件连接到安装有 550 nm 3 W LED 的印刷电路板 （PCB） 的背面。
    2. 用透明的PMMA（聚甲基丙烯酸甲酯）准直透镜覆盖LED，以便首先使光束均匀化，其次将光束角从120°减小到10°。这种减少可以增加输送到光分配器部分的光量。
    3. 通过三模调光将 LED 连接到电流驱动器，从而提供不同的辐照度水平。
    4. 在 3D 打印中分别构建外壳、外壳正面和外壳盖（ 图 1 中的红框）。
    5. 将驱动器和配备镜头和风扇散热器组件的 LED 安装在外壳中的专用位置（ 图 1 中的蓝色框）。
    6. 将电源插孔和翘板开关安装在外壳封盖的专用位置（ 图 1 中的蓝色框）。
    7. 通过翘板开关将驱动器和风扇散热器组件连接到电源插孔。
    8. 组装外壳、外壳封盖和外壳正面。
    9. 检查 LED 是否与外壳正面的圆柱形开口的轴线对齐。
      注意： 外壳正面的圆柱形开口用于光源部分（母连接器）与光分配器部分（公连接器）的光学连接。

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图1： 光源部分的三维正面（A）、背面（B）和分解（C）视图。改编自 Lefebvre， A. et al.30。 请点击此处查看此图的大图。

  1. 光分配器部分的构造
    1. 在 3D 打印中分别构建外壳底部封口、外壳和顶部封口（它们共同形成一个空心盒子）（ 图 2 中的红色框）。
    2. 用白色 3D 打印构建 96 孔垫片（ 图 2 中的红框），使其完全适合 1.2.1 中提到的空心盒。白色旨在最大限度地提高光反射，从而优化光分布。
      注意：96孔间隔器中存在的圆形开口的直径和中心间距应等于用于生物测定的96孔板孔的直径和中心间距。
    3. 在空心盒的顶部封口上钻 96 个小孔，使它们与 96 孔垫片中 96 个圆形开口的中心对齐，当后者放置在顶部封口上时。
    4. 将直径为 0.5 毫米的塑料光纤从下到上插入顶部封口的 96 个小孔中的每一个孔中。
    5. 在顶部封口的底部涂上聚酯树脂，将 96 根光纤粘合到顶部封口上。
    6. 树脂干燥后，抛光光纤的远端，直到它们调整到顶部闭合的顶部。
    7. 将步骤 1.2.1 中提到的空心盒内的光纤聚集成一个由护套保护的单束，护套从盒子中延伸约两米。
      注意： 盒子的高度应足以防止光纤弯曲和可能导致的光衰减。
    8. 组装空心盒，使光纤束穿过外壳的专用开口。
    9. 将光纤的近端设置成3D打印的公连接器，从而可以连接到光源部分（母连接器）。
      注意： 此连接器不需要胶水以防止该胶水可能导致的轻度衰减。
    10. 将 96 孔垫片放在空心盒上。
    11. 通过在透明PMMA板（底面）和防刮聚酯薄膜片（顶面）之间插入描图纸来创建屏幕，以便将输送到每个光纤远端的窄光束扩散到与用于生物测定的96孔板的孔径一样大的光束中。
    12. 在 3D 打印中构建屏幕框架（ 图 2 中的红框），使其中心开口与用于生物测定的 96 孔板的尺寸完全吻合，从而使孔与 96 孔间隔器的圆形开口完美对齐。
    13. 将筛网固定在带有筛框的 96 孔垫片的顶部。

figure-protocol-2
图 2： 光分配器部分的三维视图。改编自 Lefebvre， A. et al.30。 请点击此处查看此图的大图。

  1. 光源部分与光分配器部分的组合
    1. 将配光器部分的公头连接器插入光源部分的母头连接器。
      注意：一旦公连接器插入母连接器，光源部分传递的光束应覆盖比光分配器部分的受光元件的表面积大一点，从而保证向 96 根光纤提供光。

2. 生物测定

  1. 细胞培养过程
    1. 在补充有10%热灭活牛血清和1%链霉素和青霉素的RPMI 1640培养基中培养肝癌细胞系HepG2。
    2. 将含有HepG2细胞的培养瓶保存在37°C的5%CO2 细胞培养箱中。
    3. 每3天更换一次培养基，方法是从烧瓶中吸出培养基，并用先前加热至37°C的RPMI 1640培养基替换。
    4. 使用显微镜检查培养瓶中细胞的汇合度，直到它们达到 80%-90% 的汇合度。
  2. 播种过程
    1. 从培养箱中取出细胞，并将它们放在预先清洁的微生物安全站下。
    2. 从培养瓶中取出培养基。
    3. 用磷酸盐缓冲溶液洗涤培养瓶。
    4. 将 3 mL 胰蛋白酶（0.25%，0.53 mM）应用于细胞，并将培养瓶放入 37°C 的培养箱中 5 分钟以分离细胞。
    5. 5分钟后，用7mL培养基从培养瓶中回收胰蛋白酶，并在15mL管中回收培养基+胰蛋白酶+细胞的整个溶液。
    6. 使用细胞计数器对细胞进行计数。为此，取 20 μL 含有细胞的溶液并将其放入管中。加入 20 μL 台盼蓝溶液，将细胞 + 台盼蓝溶液放在计数载玻片上，然后插入细胞计数器。
    7. 细胞计数后，在培养基中稀释以获得 150,000 个细胞/mL 溶液，并将细胞接种在具有透明平底的白色 96 孔板中，速率为 1.5x104 个细胞/孔。白色旨在最大限度地提高井内的光反射和分布。
      注意：每孔的细胞数量必须根据所使用的细胞系进行调整。可能需要事先进行密度测试才能找到要接种的正确数量的细胞。
    8. 为每个活力读数时间准备两个板。一个盘子将被照亮，一个盘子将保持黑暗。
    9. 处理前将板孵育24小时，以允许细胞附着。
  3. 玫瑰孟加拉治疗
    1. 通过在 10% 盐水溶液中复溶 Rose Bengal 粉末来制备 Rose Bengal 的储备溶液。该溶液必须在细胞处理前制备，以避免由于其稳定性而对 Rose Bengal 进行任何降解。
    2. 通过在细胞培养基中稀释先前制备的 Rose Bengal 储备溶液，以增加浓度（0 μM、5 μM、10 μM、25 μM、50 μM、75 μM、100 μM）制备 Rose Bengal 溶液。
    3. 制备溶液后，从含有细胞的板中取出培养基，并加入100μl孟加拉玫瑰处理溶液。
    4. 将细胞与 Rose Bengal 处理孵育 2 小时，以允许 Rose Bengal 内化。
      注意：Rose Bengal 溶液的孵育时间可能因所使用的细胞系而异。可能需要通过荧光测量微调孟加拉玫瑰掺入的动力学，以便为所研究的每个细胞系找到合适的孵育时间。
    5. 2小时后，除去Rose Bengal溶液，用PBS洗涤细胞两次，并加入100μL/孔的无Rose Bengal培养基。
      注意：对于更高浓度的孟加拉玫瑰，可能需要用PBS进行额外的洗涤。可以进行目视检查以确保细胞已正确清洗。一旦充分冲洗，PBS不应由于细胞外存在玫瑰孟加拉而呈现粉红色。
    6. 用铝箔覆盖微孔板，以保护它们免受光线照射。照亮一半的板以进行PDT测定（参见步骤2.4）。未发光的板将为 PDT 结果（黑暗条件）提供控制数据。他们还将提供有关非光活化孟加拉玫瑰对细胞活力影响的数据。其他微孔板将用于在设备中暴露于光线（PDT 条件）。
  4. CELL-LED-550/3 设备的作程序
    1. 将配光器上的公连接器连接到光源的母连接器。然后将光源插入电源插座。
    2. 从培养箱中取出两个微孔板（PDT + 黑暗条件），取出用于 PDT 条件的铝，然后将该板放在光分配器上。
    3. 将驱动器的调光器设置为最大水平，以最大限度地提高 LED 提供的功率，并在 96 个孔上获得 0.62 mW/cm2 的平均辐照度。
      注意：驱动器的调光器应设置为最适合生物测定的值（在三种可用测定中）。无论驱动器的调光器设置如何，低传递辐照度都不需要使用安全眼镜。
    4. 照亮板，直到达到细胞上所需的光剂量。为了获得所需的光剂量，可以调整两个参数，时间和辐照度，参考以下等式：
      光剂量 （J / cm2 ） = 辐照度 （W / cm2） × 时间 （s）（等式 1）。
      辐照度可以通过调整驱动器调光器来调制，分别获得 0.02 mW/cm2、0.23 mW/cm2 或 0.62 mW/cm2。根据所选的辐照度，可以使用公式 1 来计算达到目标光剂量所需的照明时间。
    5. 达到所需的光剂量后，关闭设备。将 PDT 微孔板更换为铝，并将其与控制板一起放回培养箱，直到进行活力测试。
    6. 可选：如有必要，使用上述相同程序照亮其他板。
  5. 细胞活力测定
    1. PDT测定后，将发光板在培养箱中放置24小时，然后通过测量其活力来测量PDT对发光细胞的影响。孵育时间可以改变，以研究PDT对细胞的或多或少的长期影响。对于每个PDT后孵育时间，应将未发光的板（黑暗条件）孵育同一时期。
    2. 孵育期后，取一个发光板和一个不发光板，并在每个孔中加入细胞活力测定试剂盒中的100μL试剂，以根据线粒体代谢和细胞产生的ATP来测量细胞活力。
    3. 在细胞活力测量之前，将多板在黑暗中孵育10分钟。
    4. 孵育10分钟后，使用多模态阅读器读取每个孔中发出的发光。发射的发光与添加细胞活力测定溶液时活细胞产生的ATP成正比。
    5. 将未处理（NT）条件的发光值视为100%的活力，并将处理条件的发光值归一化为NT条件，以获得每种处理诱导的活力百分比。
    6. 对每个PDT治疗后读数时间（例如，治疗后24小时，48小时和72小时）重复相同的细胞活力读数方案。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

如 图 3 所示，CELL-LED-550/3 设备能够从下方均匀地照亮具有 550 nm 绿光的 96 孔板。

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图 3： 当室内灯打开 （A） 或关闭 （B） 时，CELL-LED-550/3 设备在 96 孔板的说明性照明期间的图片。改编自 Lefebvre， A. et al.30。 请点击此处查看此图的大图。

通过使用一束光纤，每个孔都单独照明，远离单个 LED（最多两米）（图 4）。

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图 4： 光纤束能够对远离单个 LED 的 96 孔板的孔进行单独照明。 请点击此处查看此图的大图。

为了确定 CELL-LED-550/3 装置的疗效，评估了其在 HepG2 肝癌细胞系上诱导 RB 介导的 PDT 的能力。在照明前用增加浓度的孟加拉玫瑰处理细胞，范围为0-100μM，持续2小时。使用这种浓度范围旨在确定孟加拉玫瑰的有效剂量 （EC50），当暴露于绿光时会杀死 HepG2 细胞。还研究了 CELL-LED-550/3 设备传递的光剂量对诱导 HepG2 细胞死亡的影响。为此，将细胞以0.62 mW/cm2的强度暴露在光下8 min 9 s，16 min 18 s或32 min 36 s，以获得0.30 J / cm 2,0.60 J / cm2和1.22 J / cm2的光剂量。

首先，观察到，在没有孟加拉玫瑰的情况下，单独的照明（光照条件， 图5）对HepG2细胞的活力没有影响，无论接受的光剂量如何。还观察到，在没有光的情况下（RB 条件， 图 5），单独使用孟加拉玫瑰不会在任何测试条件下诱导细胞活力的任何变化。相比之下，结果表明，使用 CELL-LED-550/3 的 RB 介导的 PDT 能够杀死 HepG2 细胞。此外，观察到疗效增加与光剂量的增加相关，光剂量为0.30 J/cm2的最大有效浓度（EC50）为34.3 μM，0.60 J/cm2的剂量为26.6 μM，1.2 J/cm2的剂量为6.8 μM。

这些结果证实了这种新型PDT装置对RB介导的PDT的有效性（图5）。

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图5：该装置与HepG2细胞系活力相关的功效。HepG2 处理后 24 小时的活力百分比。NT，未经处理;RB，仅光敏剂（0 μM、5 μM、10 μM、25 μM、50 μM、75 μM 和 100 μM）;光照度为 0.30 J/cm2、0.60 J/cm2 和 1.22 J/cm2;PDT，用 RB 处理进行照明。结果以三个独立实验的平均值±SEM表示，以NT的百分比表示。进行双因素方差分析检验，p ≤ 0.01 （**）;p ≤ 0.0001 （****） 被认为具有统计学意义，p ≥ 0.05 被认为不显着 （NS）。改编自 Lefebvre， A. et al.30。请点击此处查看此图的大图。 

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了开发专用于 体外 RB 介导的 PDT 的创新照明设备的协议，以及为 CELL-LED-550/3 设备实施概念验证的协议，从而开发了30。

CELL-LED-550/3由两部分组成，每部分都有特定的功能。第一部分（称为光源部分）的目的是从单个 LED 中产生直径大于第二部分光纤束直径的均匀绿色光束。后者称为光分配器部分，旨在通过光纤束将光源部分提供的光单独分配到 96 孔板的孔中，并远离 LED。在距离 LED 最远 2.5 m 的距离内，电池可以根据需要进行照明，而不会因 LED 内产生的不受控制的热量而产生任何有害的热效应风险。

与专为 96 孔板照明31、32、33、34、35、36 设计的其他基于 LED 的系统相比，此功能提供了 CELL-LED-550/3 的第一个显着优势。事实上，所有其他系统都涉及将 LED 定位在电池下方仅几厘米（通常低于 5 厘米），这不足以消除与 LED 相关的电池有害热效应的风险。为了限制这种风险，大多数其他系统（不幸的是，有些没有）包括一个 LED 冷却系统 32,34,35，有时非常（太）靠近电池，然后可能会受到由此产生的热波动的适得其反的影响。与大多数其他现有的基于LED的系统31,32,33,35,36相比，CELL-LED-550/3装置分为两部分的设计提供了另一个显著优势：这允许照亮细胞培养箱内的细胞，而不会对设备造成任何风险。不包括电子元件的光分配器部分确实可以放置在培养箱内，而光源部分（包括对潮湿环境敏感的电子元件）则放在室外，以防止腐蚀或故障的风险。一些现有的基于 LED 的系统，包括电子元件，可以在培养箱内进行照明，但这种使用首先是设计人员/制造商不推荐的，其次，使用后需要“充分”干燥33,34。在方案期间照亮培养箱内的细胞，从而将细胞维持在相同的生理条件（温度、湿度和 CO2 浓度）的能力对于避免 PDT 后细胞活力评估中的潜在偏差至关重要，特别是对于需要长时间照明时间的方案。还应该强调的是，CELL-LED-550/3 设备包括一个 LED，可单独同时照亮所有 96 个孔。这种原创和创新功能不适用于上述任何其他基于 LED 的系统31、32、33、34、35、36。这些系统中的大多数包括 96 个 LED，每个孔下方放置一个 LED，因此提供 96 个单独的光束 31,33,34,36，而其余系统提供位于距离孔板几厘米处的 6 至 25 个 LED，覆盖全部或部分孔 31,32,35 的全局光束.根据文献，以前从未提出过从单个 LED 生成 96 个单独的光束，就像 CELL-LED-550/3 通过使用光纤束所做的那样。

光源部分包括一个根据两个主要标准选择的 550 nm 3 W LED。首先，LED的发射光谱（以及其中心波长）应与RB光敏剂的吸收光谱重叠。这种重叠，与所选 LED（中心波长：554.4 nm;FWHM：106.4 纳米;两者都按照Lefebvre等人30中描述的方法进行估计）（图6），对于RB光激活至关重要，从而对于RB介导的PDT的诱导至关重要。其次，LED的光功率应低于5W。这种功率限制是由光源部分中包含的准直透镜的允许功率和分布光部分中包含的光纤束的允许功率施加的。

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图6： 蔷薇孟加拉在水中的吸收光谱。根据左轴绘制了蔷薇在水中的最大归一化吸收光谱，并根据右轴绘制了CELL-LED-550/3的平均光谱辐照度。平均光谱辐照度的轮廓与制造商网站上提供的 LED 的轮廓一致。 请点击此处查看此图的大图。

器件两部分之间的光耦合是一个关键因素。这种耦合一方面旨在将 3 W LED 发出的最大光收集到窄光束中，另一方面将该光束注入光纤束中。关于第一个目标，专为PCB（印刷电路板）安装的LED设计的短焦距非球面准直透镜，可以将120度的LED光束集中到空间分布均匀的10度窄光束中。此外，由此产生的光束投射出方形 LED 芯片的图像，与初始光束获得的图像相比，该图像表现出更高的清晰度并减少了光学像差。关于将这种窄光束注入光纤束，需要解决四个要点。首先，将96 0.5 mm直径的PMMA（聚甲基丙烯酸甲酯）光纤（数值孔径：0.2）的近端聚集在一起，形成一个自制的连接器，使它们形成一个边长5 mm的方形光感受表面（图7）。与光束对 LED 芯片的方形投影一致的方形形状比通常的圆形连接器更受欢迎，以限制光损失。其次，自制连接器的设计既不需要胶水，又使用晶莹剔透的树脂进行 3D 打印，以限制光吸收，从而防止材料过热/碳化。第三，使用抛光轮抛光连接器的光表面和最终表面，以便最大的光线通过它们。第四，也是最后，理论上确定透镜与方形受光表面之间的距离，然后在光学台上进行调整，使方形 LED 投影最均匀的中心部分比受光表面重叠一点。

通过这种耦合，10度窄光束的功率为1.25 W，而96根光纤束传输的总功率为0.12 W（使用了适用于LED光的光电二极管传感器（OPHIR）。

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图 7： 通过将 96 根光纤聚集到自制连接器中获得的方形光接收表面。 请点击此处查看此图的大图。

CELL-LED-550/3 在孔的底部外表面提供 0.62 mW/cm2 （标准偏差：0.09 mW/cm2）（图 8）的平均辐照度。根据Lefebvre和al.30中详细描述的方法，估计并证明该平均值考虑了上述耦合效率，并证明随着时间的推移是稳定的（变异系数低于0.6%）。由于辐照度如此低（低于上述专门为 96 孔板照明设计的其他基于 LED 的系统提供的辐照度），单独的照明已被证明对 HepG2 细胞活力没有影响，而 RB 介导的 PDT 已达到非常高的效率。对于需要更高辐照度以确保效率的PDT协议，可以使用多个LED，因此可以实现多个光源部件，前提是注入每根光纤的光功率不超过几十毫瓦的允许功率。

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图8： 直方图表示输送到板的96个孔的辐照度分布。 请点击此处查看此图的大图。

仅用另一个合适的 LED 替换光源部分的 LED 可以获得另一个 CELL-LED 设备。如果 LED 在可见光范围内（根据光纤束的规格）发出低于 5 W 的光功率（由于上述原因），则应被视为合适。由于存在大量此类 LED，因此可以开发各种各样的 CELL-LED 设备，从而可以在 体外评估许多 PDT 方案。给定PDT协议，在所有合适的LED中，显然应该首选与所考虑的光敏剂的吸收光谱提供最佳重叠的LED。在更换 LED 的情况下，应特别注意风扇散热器组件。事实上，该组件的尺寸应适当，以防止 LED 和驱动器过热和随后的退化。此外，任何 LED 变化都需要新的光学和热表征。

与现有设备相比，通过简单地替代单个 LED 来光激活大多数光敏剂的可能性，以及照亮培养箱内细胞的可能性，都为该设备提供了真正的附加值。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明没有利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者要感谢法国里尔中央医院和INSERM对我们研究的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
550 NM 3 W LED 安装在印刷电路板上 欧司朗OSTAR KP CSLPM1。F1
75 cm2 培养细胞瓶萨斯泰特3911002
100 根塑料光纤束（直径 0.5 毫米）ARCENCIEL LED纤维05EGM辉光端 PMMA 0.5 直径 - Lng 200 米    http://arcenciel-led.fr/accueil/193-fibre-optique-end-glow-05mm-prix-au-m.html
细胞计数器赛默飞世尔AMQAF2000可选，您可以在微镜下计数
细胞培养箱PHCI（杜彻尔）MCO-170AICUVD-PE
细胞滴度 Glo普罗梅加G7571
透明 PMMA 准直透镜Glecc 商店14mm 镜头 10°Aliexpress - 支持 14 毫米的 DEL 准直透镜
Colorfab 黑色彩色晶圆 SKU 020014FDA 食品接触合规性
Colorfab Ngen 白色彩色晶圆 SKU 020013FDA 食品接触合规性
具有三模调光功能的电流驱动器（CDM 驱动器）CDM 驱动程序BD39型2200毫安
环氧树脂 Clé视角水晶钻石水晶钻石 150 毫升
风扇散热器组件博伊德
HepG2 细胞ATCCHB-8065型
多模态读写器 （CLARIOstar Plus）BMG 实验室科技430-2927
磷酸盐缓冲液赛默飞世尔20012-068
PMMA（聚甲基丙烯酸甲酯）光纤（数值孔径：0.2）广州美基照明有限公司
电源插孔RSpro907-5680
RMPI 1640赛默飞世尔21875-091
翘板开关 RSpro419-744
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参考文献

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