在受伤的斑马鱼幼鱼中建立持续性Pseudomonas aeruginosa感染模型

摘要

目前缺乏 体内 适用于慢性细菌感染药物筛选的模型。在此，我们描述了一种伤口感染的实验方案 铜绿假单胞菌 临床分离株在斑马鱼幼鱼中建立持续性感染。

摘要

Pseudomonas aeruginosa 是一种重要的人类病原菌，尤其在慢性伤口感染和慢性肺部感染中（特别是在囊性纤维化（CF）患者中）具有显著致病性。慢性细菌感染对抗生素治疗具有耐受性，因此迫切需要适用于药物筛选的 体内 慢性感染模型，以开发有效的治疗方案。本文介绍了一种利用来自 CF 患者的临床分离株 P. aeruginosa（该菌株组成型表达绿色荧光蛋白（GFP））在斑马鱼幼鱼中建立持续性伤口感染的实验方案。将尾鳍受伤的胚胎浸入细菌悬液中 1.5 小时，随后进行清洗，并持续监测 3 天内的细菌负荷量。通过计数裂解感染幼鱼后获得的荧光菌落形成单位（CFU），可每日定量检测细菌载量，从而实现 持续性感染的建立 。此外，持续存在的 P. aeruginosa 细菌对抗生素治疗表现出耐受性。这一新型的 体内 持续性 P. aeruginosa 感染模型为评估针对慢性感染的创新疗法的有效性提供了有力工具。

引言

铜绿假单胞菌 是一种革兰氏阴性致病菌，可导致囊性纤维化（CF）患者及伤口部位的慢性定植^1,2. P. aeruginosa 属于ESKAPEE病原体组，被世界卫生组织列为新疗法研发的最高优先级病原体³慢性细菌感染由于适应性耐药性的存在，难以通过抗生素进行有效治疗，这种耐药性与多种因素相关，包括生物膜生活方式、生长速率降低以及代谢活性下降。⁴以及细胞内生命周期⁵. 体内 模型对于更好地理解与治疗至关重要 P. aeruginosa 慢性感染

尽管已有多种体内模型用于评估P. aeruginosa的毒力，但极少模型能够模拟持续性定植并测试治疗手段对慢性感染的效果⁶。研究P. aeruginosa慢性致病机制的动物模型主要依赖将细菌包埋于琼脂珠中并接种至肺部⁷。此外，还建立了小鼠慢性皮肤感染模型⁸。斑马鱼（Danio rerio）具有多种优势（伦理问题较少、成本低、产卵量高），是一种具有吸引力的体内脊椎动物模型，适用于药物筛选，同时得益于胚胎的透明性，可实现对P. aeruginosa及宿主细胞的高分辨率实时观察⁹。

如一篇综述所述，在以往的研究中 P. aeruginosa 实验室菌株（PAO1、PA14 和 PAK）主要应用于斑马鱼感染模型，可引起急性感染⁹我们近期开发了一种基于将尾鳍截断的胚胎浸入感染环境的伤口感染实验方案 P. aeruginosa PAO1菌株，可引起急性感染¹⁰通过浸泡感染已受伤的胚胎，该方法模拟了胚胎的自然感染模式 P. aeruginosa是一种可重复且比显微注射更简便的感染方式。

我们的目标是建立一种持久的方案 P. aeruginosa 斑马鱼感染。为此，我们的策略是使用 P. aeruginosa 临床菌株，在斑马鱼模型中极少被考虑^11,12，结合伤口感染途径。在此，我们描述了一种已建立的实验方案，用于建立基于伤口感染的斑马鱼胚胎持续定植模型 P. aeruginosa CF 临床分离株。这种新型 体内 模型符合我们的预期，并为评估治疗手段在持续定植背景下的有效性提供了新的机会，如本文及配套文章所述。¹³.

方案

本研究中描述的所有斑马鱼实验均在蒙彼利埃大学进行，遵循欧盟关于实验动物管理的“3R”原则——替代（Replacement）、减少（Reduction）和优化（Refinement），并已获得埃罗省卫生与兽医局以及科学用途动物使用伦理委员会（编号：CEEA-LR-B4-172-37）的批准。所有感染实验均在受精后5天内的胚胎上进行。 成年斑马鱼（Danio rerio）的繁殖遵循欧盟《动物保护指令》2010/63/EU所规定的国际指南。蒙彼利埃大学的斑马鱼养殖设施采用标准条件：12小时光照:12小时黑暗循环，使用容量为3.5 L的聚碳酸酯养殖箱（每箱最多饲养22条鱼），连接具有4%盐度/400 µS电导率的循环水系统，水温维持在28 °C。鱼类每日投喂两次商业鱼粮。

1. 溶液的配制

1. 制备用于培养斑马鱼胚胎的1x工作浓度鱼水，可选择添加或不添加亚甲蓝（见表1）。
2. 按照表1所述方法配制20x储存液（0.4%）和1x工作浓度Tricaine麻醉液。为避免反复冻融储存液，建议将20x Tricaine溶液分装为10 mL每份，于-20 °C保存。
3. 用1x磷酸盐缓冲液（PBS；表1）稀释配制2% Triton溶液。

2. 制备稳定表达GFP的荧光  P. aeruginosa 接种物

注意：所有涉及P. aeruginosa的操作均须在生物安全柜中采取BSL-2级防护措施。P. aeruginosa菌株应经过基因改造，以持续表达荧光报告蛋白，例如GFP（本文采用此方法，详见文献¹³）。强烈建议使用染色体整合的荧光报告基因菌株，以避免质粒携带的荧光报告基因因质粒丢失而失效。

1. 在感染前2天，从-80 °C保存的菌种中挑取表达GFP的基因改造型P. aeruginosa单菌落，接种于LB琼脂平板（表1），在37 °C下过夜培养。
2. 使用荧光显微镜（放大倍数6倍）检查菌落荧光，挑选一个GFP⁺P. aeruginosa单菌落接种至1 mL LB液体培养基（表1）中，于37 °C振荡培养（180 rpm）过夜。
3. 在感染当天，将上述过夜培养的P. aeruginosa菌液按1:20比例转接至5 mL新鲜LB液体培养基中，于37 °C振荡培养（180 rpm），直至菌液OD₆₀₀达到0.8，约需2–3小时。
4. 将细菌培养物在室温（RT）下以3584 × g离心10分钟，弃去上清液，将菌体沉淀重悬于4 mL不含亚甲蓝的鱼用水中。
5. 用鱼用水调整菌液体积，使终浓度为7 × 10⁷ 至 1 × 10⁸ CFU/mL。此浓度对应OD₆₀₀约为0.15（需根据不同菌株进行调整）。
6. 为定量接种物，对细菌悬液进行系列稀释，取10^-4稀释度的菌液20 µL涂布于LB琼脂平板，于37 °C过夜培养。
7. 在荧光显微镜下计数GFP⁺菌落，以确定接种物的CFU数。

3. 斑马鱼胚胎的收集与制备

1. 在细菌浸染实验前3天，设置斑马鱼繁殖配对。将一尾繁殖期雄鱼和一尾雌鱼放入交配缸中。
2. 次日早晨，使用细网筛收集受精后的卵，并将收集的卵置于含有亚甲蓝的鱼水中培养皿中。
3. 为避免污染，向培养皿中加入1滴漂白剂。5分钟后，更换含亚甲蓝的鱼水以去除漂白剂。
4. 弃去胚胎发育异常（未受精卵类似于单细胞期卵）或死亡（呈白色）的卵。
5. 感染当天早晨（2 dpf），在体视显微镜（放大倍数11倍）下用两把极细的镊子去除胚胎的绒毛膜。使用镊子撕开绒毛膜，注意不要夹伤胚胎，以便释放胚胎。
6. 将去膜后的胚胎放入含有亚甲蓝的鱼水的培养皿中，于28 °C培养至感染开始。

4. 胚胎损伤

1. 在细胞培养皿（35 mm × 10 mm）中，用不含亚甲蓝并含有0.02%三卡因的鱼水对斑马鱼胚胎进行麻醉，损伤前约5分钟开始。胚胎不再活动，且对刺激无反应。
2. 将25G针头放置在两根筷子顶端，以方便操作针头。
3. 在体视显微镜下剔除发育异常或已死亡的胚胎。通过旋转培养皿，将所有胚胎聚集于中央。
4. 使用两根针头将胚胎逐个竖直固定（头朝下—尾朝上），将左侧针头置于尾部以保持尾部伸直。用右侧针头在脊索边缘处切断尾鳍，一次性完成切割。从切割完成到浸入细菌溶液的时间不得超过10分钟。

5. 感染受伤的胚胎

1. 在 II 级生物安全柜中，涡旋混匀后将浓度约为 1 × 10⁷ CFU/mL 的 P. aeruginosa 溶液加入 6 孔板中。
2. 使用一次性巴斯德玻璃移液管收集受伤的胚胎，并在微生物安全操作台内将其加入细菌溶液中。将培养板在 28 °C 条件下孵育 1.5 小时。
   注意：若需要大量感染的幼虫，可将幼虫分组处理，每组约 50 条，依次进行造伤、浸入感染，然后重复处理下一批。
3. 感染后，在微生物安全操作台内按以下步骤清洗胚胎。
   1. 用玻璃移液管将胚胎转移至 10 mL 不含亚甲蓝的鱼水中进行第一次清洗，尽量减少液体带入量，在室温下清洗 30 分钟。
   2. 再次使用玻璃移液管将感染后的胚胎转移至 4 mL 不含亚甲蓝的鱼水中，进行数分钟的第二次清洗。
   3. 将 24 个感染的胚胎分别转移至多孔板中，每孔加入 1 mL 不含亚甲蓝的鱼水。
4. 将培养板放入塑料盒中，置于 28 °C 培养箱内孵育。通过湿润环境（例如使用湿纸巾）保持盒内湿度，以减少蒸发。

6. 感染胚胎的存活情况

1. 进行胚胎存活率研究时，在感染后18小时、24小时和48小时（hpi）使用体视显微镜检查胚胎活力。当胚胎心脏停止跳动且血液循环停止时，判定为死亡。
2. 使用Kaplan-Meier阶梯图（GraphPad Prism 8.3.0）表示死亡率/存活率，并采用log-rank检验或其他适当的统计学方法进行数据分析。

7. 检测感染胚胎中的细菌载量（图1）

1. 在四个不同时间点对感染的胚胎进行菌落形成单位（CFU）测定：感染后1.5小时（即感染后立即测定），以及每次清洗后的24、48和72小时，每个时间点使用5个胚胎。所有操作均需在微生物安全操作台内进行。
2. 为每只感染的幼虫准备含有95 µL 1×PBS的1.5 mL微量离心管。幼虫体积约为5 µL。
3. 将幼虫转移至含4 mL不含亚甲蓝的鱼水的6孔板中，进行清洗以去除浮游细菌。
4. 将每个胚胎放入含有PBS的微量离心管中，尽量少带入液体。仅需将含有幼虫的玻璃移液管轻轻接触PBS液面，使幼虫沉入微量离心管中而不带入多余液体。
5. 使用研杵在微量离心管壁上逐个研磨胚胎，研杵应始终保持在管内。当观察不到完整胚胎时，即达到研磨终点。
6. 提起研杵，加入100 µL PBS-2% Triton（最终浓度为1%），以冲洗研杵上残留的细菌。涡旋混匀后静置10分钟。每次处理的胚胎数量不得超过5个。
7. 对每个胚胎的未稀释裂解液，分别在LB琼脂平板上点样3次，每次10 µL。使用多通道移液器在96孔板中对裂解液进行系列稀释，直至达到10^-3稀释度。在LB琼脂平板上，分别对10^-1、10^-2和10^-3稀释液各点样3次，每次10 µL，紧邻未稀释样品点样，随后将平板在37 °C下过夜培养。
8. 在显微镜下计数各稀释度的荧光菌落，并计算每个感染胚胎的菌落形成单位（CFU）数量。

图1：评估细菌在斑马鱼胚胎中致病性与持续性的实验时间线。 缩写：CFU = 菌落形成单位，hpi = 感染后小时数。该图使用 BioRender.com 制作。本图已根据文献¹³进行修改。请点击此处查看此图的放大版本。

8. 针对持续性感染的治疗测试（图2）

1. 针对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株，配制浓度为最低抑菌浓度（MIC）40倍的抗生素溶液。实验前需确认所选抗生素浓度对斑马鱼胚胎无毒性。
2. 按照步骤7.1和7.2操作。在24孔板中每孔加入含抗生素的1 mL鱼水，并设置不含抗生素的对照组。
3. 将清洗步骤中每个处理组的五个胚胎转移至24孔板中，尽量减少携带的液体量。
4. 在室温下用抗生素孵育30分钟。然后返回步骤7.3，以定量检测处理后的细菌载量。

图2：用于评估抗生素治疗对感染胚胎疗效的实验流程。 缩写：ATB 30' = 抗生素处理30分钟，CFU = 菌落形成单位，hpi = 感染后小时数。该图由BioRender.com绘制。本图已根据文献¹³进行修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

结果

斑马鱼胚胎是监测持续性感染的合适模型 P. aeruginosa CF 分离株
我们采用浸没损伤胚胎模式进行评估 体内 三种囊性纤维化分离株（A6520、B6513 和 C6490）的毒力⁹我们还评估了一株特征明确的晚期囊性纤维化分离株RP73的行为，该菌株以在小鼠气道中长期定植而闻名。^14,15. 与参考菌株PAO1相比，所有四株CF分离株的毒力均显著减弱（图3A 和 图3B).

为了区分细菌的清除与持续存在，我们对每个胚胎在3天内（最长至72 hpi）的细菌载量进行了定量分析。为了便于计数P. aeruginosa细菌，我们采用了携带染...

讨论

建立细菌慢性感染模型 体内 对于理解发病机制和评估治疗效果至关重要。在此，我们建立了一种适用于药物筛选的斑马鱼持久性伤口感染模型 P. aeruginosa填补了当前方法学在该方面的空白 体内 适用于针对慢性细菌感染进行药物筛选的模型。值得注意的是，该模型模拟了慢性感染的一个重要特征，即适应性抗生素耐药性，从而可用于筛选优化的化合物或抗生素。这一持续性感染模型 P. aeruginosa 斑马鱼感染研究基于一种原始方法：（i）分析 P. aeruginosa 来自囊性纤维化患者分离的菌株，包括一株据报道可在小鼠中引发慢性肺炎的分离株¹⁴，（ii）感染后长时间段（3天）的分析，包括细菌载量计数，以及（iii）伤口感染模型。

我们描述了一种可重复且相对简单的方法，通过伤口愈合及细菌在水中的浸染，在斑马鱼胚胎中建立铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）持续感染模型。与哺乳动物模型相比，斑马鱼中的所有所述操作均遵循3R原则及欧盟动物...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甲基磺酸三卡因	Sigma	E50521
活塞压片	Eppendorf, Dutscher	33522
海水盐	Instant Ocean, Aquarium systems	218035
曲通	Euromedex	2000-B