Ookluc：一种用于鉴定阻断传播化合物的Plasmodium berghei菌株

摘要

疟原虫的有性发育发生在蚊子的中肠内。靶向寄生虫的有性阶段是阻断传播的一种有前景的策略。我们开发了Ookluc，这是一种在合子形成后表达纳米荧光素酶的转基因P. berghei，可用于高通量筛选阻断传播的化合物。本文详细介绍了使用Ookluc进行筛选的方法。

摘要

疟疾仍然是全球健康面临的重大挑战；2023年，全球报告了2.63亿例病例和59.7万例死亡。疟原虫的生活史十分复杂，需在关键发育阶段采取针对性干预措施，才能有效控制该疾病。阻断传播（TB）策略旨在通过疫苗和药物靶向蚊媒或疟原虫的有性阶段，从而阻断Plasmodium的传播。TB干预措施可针对人体宿主中的配子体，或蚊子中肠中的其他形态，如配子、合子、动合子和卵囊。

新结核病防治方法的开发面临重大挑战。研究该寄生虫的有性阶段本身具有较大难度，而针对配子体杀灭化合物的高通量筛选（HTS）主要依赖于 P. falciparum 培养物。然而，稳健的 体外 用于评估针对后期性阶段干预措施的工具仍然有限。为加速抗结核药物的发现，本研究团队开发了一种新型高通量筛选（HTS）检测方法，用于检测配子体活化与受精过程 P. berghei，一种小鼠模型 疟原虫 感染。该转基因寄生虫， 卵母细胞，仅在合子形成后表达纳米荧光素酶，并在动合子发育期间达到发光峰值。该基于发光的检测方法可定量读取配子到合子以及合子到动合子的分化过程，其中发光信号的增强与动合子的形成直接相关。本视频文章介绍了利用该系统筛选疟疾传播阻断化合物的方法 卵母细胞.

引言

疟疾是一种古老的疾病，深刻影响了人类历史。仅在2023年，全球85个流行国家就报告了2.63亿例病例，导致59.7万人死亡¹。该病由属于顶复门（Apicomplexa）的疟原虫属（Plasmodium）原虫寄生虫引起。在感染人类的五种疟原虫中—— P. falciparum、P. vivax、P. knowlesi、P. ovale 和 P. malariae—— P. falciparum 和 P. vivax 导致了大多数病例。P. falciparum 与重症疟疾相关，在非洲占主导地位，而 P. vivax 的地理分布最广，在南美洲和亚洲更为普遍²。

疟原虫的生活周期十分复杂，涉及在两个宿主之间经历多个发育阶段，这有助于其在流行地区的传播和持续存在³。该周期中的一个关键步骤是从人类宿主传播至蚊媒，因此成为干预措施的重要靶点。传播始于人体内，此时疟原虫的无性裂殖子分化为雌雄配子体，进入有性发育阶段。当蚊子吸血摄取这些配子体后，环境信号会触发配子体的活化并形成配子，进而在蚊子中肠腔内完成受精。受精形成....

方案

所有动物实验均严格遵循伦理准则，并经圣保罗大学生物医学科学研究所动物使用伦理委员会（CEUA-ICB/USP）批准。动物的饲养和管理均符合该委员会制定的标准。涉及基因修饰的实验 疟原虫 寄生虫，以及它们在 -80 °C，均符合圣保罗大学生物医学科学研究所机构生物安全委员会（CIBio-ICB/USP）制定的规定。本研究共使用三只3至5周龄的雌性BALB/c小鼠，其中两只为感染组，一只为未感染组。

1. 材料与试剂

1. 通过在 RPMI 1640 培养基中添加 0.025 M HEPES、青霉素-链霉素-新霉素（PSN）、50 mg/L 次黄嘌呤和 100 µM 黄尿酸，配制动合子培养基。将 pH 调整至 8.3^8,16。
2. 将荧光素酶检测试剂盒中提供的裂解缓冲液与底物按 50:1 的体积比混合，配制发光检测的工作溶液。
3. 将培养箱温度设定为 21 °C。

2. 感染与寄生血液采集

1. 在第0天，通过腹腔注射（IP）方式，用150 µL冻存的Ookluc菌株感染两只雌性BALB/c小鼠（4-6周龄）。
   注意....

结果

Ookluc 寄生虫的构建使得能够从现有检测方法所不具备的视角评估新的结核病药物候选物，特别是在评估化合物对配子活化、受精以及合子形成的影响方面⁸。图2 和 图3 展示了该方法以高通量方式对一系列化合物在寄生虫有性阶段进行筛选的能力，从而可在单次实验中快速识别出最具前景的候选化合物（图1）。将结果以百分比形式表示有助于数据可视化，并支持决策判断哪些化合物应进入后续研究阶段。利用 Ookluc 系统，已鉴定出五种抑制率超过>95% 的化合物（图3）。对于这些选定的化合物，可进一步测定其 IC₅₀ 值，而 Ookluc 实验方案同样适用于该目的（图5）。

....

讨论

目前用于开发新型结核病化合物的大多数高通量筛选方法主要集中于抑制配子体形成或具有杀配子体活性。迄今为止，仅有两种P. berghei模型被建立，可用于评估配子体功能、配子发生、合子形成以及动合子形态发生⁵。

其中一种模型与Ookluc类似，均利用与ctrp启动子相连的荧光报告基因¹⁷。然而，Ookluc引入了若干关键改进，例如采用灵敏度更高的报告基因nLuc，并且不携带整合的药物抗性标记。在第一种模型中，报告基因插入后该抗性标记仍保留在寄生虫基因组中，而Ookluc的这一特性使其可用于进一步的遗传修饰，包括反向遗传学方法以鉴定新的结核病治疗靶点。

在本实验方案中，我们描述了使用Ookluc寄生虫在高通量模式下鉴定新型传播阻断（TB）化合物的方法。然而，在TB疫苗研究的背景下，也可采用类似的筛选策略。与将感染小鼠的血液与化学化合.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418
GraphPad Prism 版本 10.0.0 for Windows			GraphPad Software，美国马萨诸塞州波士顿
猪肠黏膜来源肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H3393
HEPES (1 M)	赛默飞世尔科技	15630106
次黄嘌呤	Sigma-Aldrich	H9636
小鼠	---	---	3至5周龄雌性BALB/c小鼠
Nano-Glo 荧光素酶检测试剂盒	Promega	N1110
青霉素 − 链霉素 − 新霉素溶液（稳定型）	Sigma-Aldrich	P4083
POLARStar Omega 微孔板读板仪	BMG Labtech	----
RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 补充物	赛默飞世尔科技	61870036
黄尿酸	Sigma-Aldrich	D120804