小鼠嗅上皮组织快速解剖与解离以制备单细胞核悬液

摘要

本文提供了一种简化的小鼠嗅上皮解剖与解离方案，用于单核RNA测序。

摘要

小鼠嗅上皮是嗅觉系统的起始入口，包含多种细胞类型，如嗅觉感觉神经元、具有再生能力的前体细胞以及支持细胞。嗅觉感觉神经元可将化学气味分子转化为神经信号，然而这些细胞如何发育与更新、如何与嗅球形成突触连接，以及如何调控其气味受体的机制，仍是当前深入研究的领域。嗅上皮位于鼻腔背侧，附着于称为鼻甲的复杂骨性结构上。这种解剖结构为其提取和解离带来了独特挑战，尤其是在制备具有活性的单细胞悬液时尤为困难。由于单细胞悬液制备流程通常涉及可能影响细胞活性和/或延迟文库构建的预处理步骤（例如木瓜蛋白酶解离、流式细胞分选），因此缩短组织提取时间至关重要。本文介绍了一种快速分离嗅上皮的简化方法，以及一种制备高质量单细胞核悬液的实验方案。

引言

小鼠嗅上皮（OE）是嗅觉系统的关键组成部分，负责检测气味信号并将其转导至中枢神经系统。其最表层含有嗅觉感觉神经元的气味感应纤毛，这些纤毛被一层黏液覆盖，并由支持性的足细胞和微绒毛细胞所包围^1,2。嗅觉感觉神经元为双极神经元，其顶端延伸出纤毛，在黏液层内形成网状结构，而基底端则发出轴突，穿过骨性筛板，汇聚至嗅球内的肾小球结构。这些肾小球是嗅觉感觉神经元与下游神经元之间形成突触的部位。在嗅觉感觉神经元下方，存在称为球状基底细胞的神经前体细胞，它们能够持续补充因直接暴露于空气毒素、病原体和物理损伤等环境伤害而死亡的嗅觉感觉神经元³。球状基底细胞来源于位于最基底部、紧贴鼻甲骨性突起基底膜的一类多能储备细胞——水平基底细胞^4,5。鼻甲结构迂曲复杂，使得嗅上皮难以完整分离和均质化处理。此外，嗅上皮被颅骨结构包围，导致该区域难以接近，传统上需要耗时较长的操作流程才能获取。

既往研究依赖于延长木瓜蛋白酶孵育时间以将嗅上皮从骨组织中释放出来^6,7,8,9,10，这可能会进一步延迟单细胞悬液的后续处理。由于嗅觉感觉神经元（OSN）轴突的剪切会触发细胞凋亡¹¹，因此必须尽量缩短从组织提取到cDNA文库构建的时间。此外，嗅上皮（OE）的结构及其向嗅球的投射使得完整细胞的提取变得复杂，从而影响单细胞RNA测序的成功率。幸运的是，单细胞核RNA测序（snRNA-seq）已成为一种强大的工具，可在保留细胞类型分布的同时对细胞进行分析，尤其适用于单细胞解离困难或不切实际的组织^12,13。

尽管已有大量研究^{6,7,8,10,14,15}对小鼠嗅上皮（OE）进行了单细胞测序，但均未提供一种针对该组织快速、稳定取材而优化的详细解剖方案。由于嗅上皮结构脆弱且被颅骨多个骨性结构包绕，获取组织时尤其需要高效而可靠的解剖方法。此外，现有的解剖指南¹⁶主要侧重于解剖结构的完整性，而非操作速度，可能导致解剖耗时较长。鉴于快速组织处理对于最大限度减少RNA降解、提高所获细胞核质量至关重要^17,18，因此有必要建立一种优化的实验流程，以实现小鼠嗅上皮的快速解剖与匀浆，并制备适用于多种下游应用的单细胞核悬液。

本方案（图1）介绍了一种简化的操作方法，旨在克服上述挑战，实现小鼠嗅上皮（OE）的快速解剖以及组织的有效解离，以分离细胞核。该方法有助于高质量的单细胞核测序¹⁹，为研究嗅觉生物学的分子基础提供了一种可靠的技术手段。

图1：C57BL/6小鼠颅骨相关骨缝和骨骼的解剖结构及嗅上皮的代表性横切面。（A）颅骨骨缝以不同颜色编码。颅骨一侧的骨缝以颜色标记，另一侧保持无标记以供参考（左图）。骨缝名称与对应颜色一致（右图）。（B）颅骨骨骼以不同颜色编码。颅骨一侧的骨骼以颜色标记，另一侧保持无标记以供参考（左图）。骨骼名称与对应颜色一致（右图）。（C）嗅上皮中央区域的横切面（使用本文所述方法解剖获得），一侧鼻甲以颜色编码，另一侧保持无标记以供参考（左图）。可视化的鼻甲名称（右图）。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

本研究中的所有动物实验均经贝勒医学院动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并严格遵循其规定执行。实验使用雌性C57BL/6J（JAX:000664）小鼠。试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 嗅觉上皮解剖

1. 使用任何首选方法对小鼠进行深度麻醉（遵循机构批准的方案）。通过用力捏压脚趾确认麻醉达到手术水平，随后进行至少10 mL冰冷的1×PBS经心脏灌注。去除皮肤以暴露颅骨（图2A）。
   注意：将头部从身体上分离为可选步骤。若决定去除头部，建议在断头前先去除颅骨周围的皮肤及其他软组织。
2. 使用一对精细且尖端锋利的剪刀，在颧弓与鳞状骨交界处双侧进行剪切：将剪刀一端插入眼眶后部，另一端置于听道附近，沿图2B中绿色线条所示位置剪断颧弓。
3. 沿额骨最前缘从一侧眼眶至另一侧眼眶做一浅表切口。仅切开额骨背侧表面（深度约1–2 mm），注意避免损伤构成眼眶的任何深层结构或骨骼（图2B中蓝色线条）。
   注意：为实现两眼眶之间的浅层切口，应将剪刀垂直于颅骨表面，并仅使用其尖端进行切割。
4. 从枕骨大孔沿颅骨中线切开，经过矢状缝和额间缝，直至与步骤1.3中在额骨上所做的眶间切口相连（图2B中红色线条）。
5. 将一对镊子插入沿颅骨中线所做切口中，牢固地将一侧颅盖向外侧牵拉。此操作将同时移除构成眼眶的骨骼（额骨、上颌骨和泪骨），从而暴露嗅甲的外侧部分（图2D）。
   注意：自此步骤起，需格外小心，避免无意中损伤嗅上皮（OE）。
6. 用手握住鼻骨和门齿，用镊子将对侧颅盖折除。当骨片被撕离时，脑组织（包括嗅球）将随之被移除（图2E）。此步骤完成后，唯一可见的骨性结构应为颅底及围绕嗅上皮（OE）的骨骼（图2F）。
7. 使用骨剪或咬骨钳，去除残余的额骨和前上颌骨（切齿骨），直至门齿基底部（图2G）。
8. 使用骨剪沿额鼻缝剪切，使鼻骨与筛板分离，操作时需极度谨慎，避免损伤下方暴露的嗅上皮（OE）或导致筛板骨折。
9. 用镊子将鼻骨从筛板上轻轻抬起，以暴露嗅上皮（OE）（图2H）。若残余的前上颌骨遮挡背侧嗅上皮（OE），应在继续操作前将其清除（图2I中黑色圆圈所示）。
10. 使用尖头镊子轻轻夹住鼻中隔背侧与筛板连接处，向后方牵拉（图2J、K）。稍加牵引后，主嗅上皮将完整地整体分离（图2L）。
11. 立即进行嗅上皮（OE）的解离处理，或将组织速冻保存以备后续分析。

图 2：快速分离嗅上皮组织的技术。（A）去除周围软组织后的小鼠头部。（B）颅骨开窗切口的彩色编码指引。（C）完成颅骨开窗切口后的外观。（D）移除颅骨的一侧半球以及邻近嗅上皮组织的眼眶部分。（E）移除对侧颅骨部分及脑组织。（F）去除脑组织和颅骨后的头部。（G）沿额上颌缝切开后，移除最前部的额骨和后部的前上颌骨。（H）移除鼻骨。（I）黑色圆圈标示出可选择性去除的残余前上颌骨区域。（J）放置镊子以完整取出嗅上皮组织。（K）向后牵拉以释放嗅上皮组织。（L）嗅上皮组织完全游离。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 嗅觉上皮解离与单细胞核分离

1. 每个样本准备一个C管和两个15 mL圆锥形离心管，并置于冰上。
2. 通过向预配制的核提取缓冲液中加入RNase抑制剂（终浓度为0.2 U/µL），制备裂解缓冲液。
3. 向每个15 mL圆锥形离心管中加入4 mL的1% BSA溶液，短暂涡旋混匀后弃去多余液体。此步骤可使BSA包被离心管内壁，以最大限度减少细胞核对管壁的黏附。
4. 对于一份完整的OE样本，向每个C管中加入2 mL预冷的裂解缓冲液。
5. 将OE样本加入C管中。使用#2镊子夹住样本，置于对应的C管上方，用精细剪刀将其剪成小块。
6. 将装有样本的C管倒置放置于自动组织解离仪的模块上。解离仪屏幕上对应模块的方格将从Free变为Selected。
7. 按下文件夹图标进入Miltenyi 文件夹。使用箭头键滚动至4C_nuclei_1 程序（解离仪中预载的程序）。按下OK 将程序应用至各模块，然后按下“开始”以启动运行。运行结束后立即从解离仪中取出C管。
   注意：若条件允许，在解离过程中应始终保持C管处于冰上。运行结束后必须立即取出样本并继续后续操作，以避免细胞核过度裂解。
8. 使用移液器吸取C管中的匀浆液，经70 µm滤网过滤至第一个已包被BSA的圆锥形离心管中。注意避免吸取沉积在C管底部的骨碎片。
9. 用1 mL预冷的1×PBS冲洗滤网，确保完全过滤。
10. 将过滤后的悬液在4 °C下以500 × g离心5分钟（使用摆桶式离心机）。
11. 小心吸除并弃去上清液，注意不要扰动沉淀。用1 mL预冷的1×PBS轻轻吹打，彻底重悬细胞核沉淀。
12. 将重悬的细胞核悬液经30 µm滤网过滤至第二个已包被BSA的圆锥形离心管中。细胞核浓度可使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行定量。
13. 为保持样本完整性并防止降解，请立即进行后续选定的实验流程（无论是否进行FACS）（图3）。
    ​注意：强烈建议用户在正式实验前对本方案进行多次预实验，以确保操作流畅并按时完成。

图3：嗅觉上皮解离与单核分离流程图。解剖后，通过机械和化学方法对嗅觉上皮进行解离。裂解物经70 µm滤网过滤，用1x PBS冲洗，并在500 × g 条件下离心5分钟。沉淀物用1x PBS重悬后，再经30 µm滤网过滤。所得的细胞核悬液可用于多种下游测序应用。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

为了为解剖和分析提供解剖学背景，对C57BL/6小鼠颅骨的骨缝和骨骼以及嗅上皮（OE）的中央区域进行了可视化并以不同颜色标注（图1）。每张图像的一侧标注了相关的骨缝、骨骼和鼻甲结构，另一侧则保持无标记，以供对照参考。OE横切面的制备遵循既定的实验方案²⁰，鼻甲的鉴定则基于先前的解剖学特征描述²¹。

尽管在细胞核分离后流式细胞术并非必需，但本文生成了成像流式细胞术的代表性数据，以展示本论文所述方法所获得细胞核的质量。图中显示了用于鉴定单个细胞核的设门策略（图 4A）以及高质量细胞核（低偏心率，高圆度）的数量（图4B）。大多数单事件为细胞核（53.69%），且所成像的细胞核大多质量较高（53.89%具有高圆度）。强烈建议用户练习本实验方案，并评估其分离细胞核样品的质量 通过 成像流式细胞术或血细胞...

讨论

本文所述方法可在心脏内灌注1× PBS后，稳定地完整取出嗅上皮组织。与先前方法相比，该方法在操作速度上有显著提升¹⁶，尤其重要的是，嗅觉神经元在轴突切断后即开始发生退化²，而轴突损伤在脑组织取出过程中不可避免。

仔细去除额骨、前上颌骨和鼻骨对于稳定获取完整的嗅上皮组织（OE）至关重要。此外，在使用镊子取出OE的最后步骤中，有时可能会有部分鼻中隔残留附着。由于鼻中隔含有大量呼吸上皮细胞²²，建议将其与OE分离，以尽量减少后续分析中非嗅觉细胞类型的混入。此外，尽管本操作流程与组织匀浆方案一并呈现，但也可根据需要进行修改，用于多种免疫组织化学或成像应用：在初始使用1×PBS经心脏灌注后，再以10 mL含4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS进行经心脏灌注固定，该固定方法已被广泛采用²³。

与解剖方案类似，解离步骤经过优化以确保操作的一致性和高效性。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	Celltreat	229411
骨组织剪	Fine Science Tools	16102-11
Bonn 微型虹膜剪	Miltex	18-1392
牛血清白蛋白溶液	Sigma-Aldrich	A1595
Dumont #3 镊子	Fine Science Tools	11231-30
雌性C57BL/6J小鼠	杰克逊实验室	JAX:000664
gentleMACS C 管	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo 组织解离仪	Miltenyi Biotec	130-096-427
MACS SmartStrainers 30 μm	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS SmartStrainers 70 μm	Miltenyi Biotec	130-098-462
微型弗里德曼-皮尔逊咬骨钳	Fine Science Tools	16220-14
细胞核提取缓冲液	Miltenyi Biotec	130-128-024
磷酸盐缓冲液（PBS），1×，不含钙和镁，pH 7.4 ± 0.1	康宁	21-040-CV
Protector RNase抑制剂	默克生命科学	3335402001
Sorvall Legend XTR 冷冻离心机	赛默飞世尔科技	50119927-5