细胞治疗通过使用祖细胞修复受损组织并改善肺功能，为肺纤维化提供了一种有前景的干预手段。由于影像学在追踪细胞整合过程中发挥关键作用，本文描述了一种磁性粒子成像引导的 体内 在小鼠模型中追踪肺纤维化细胞治疗
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
影像引导 体内 利用磁性粒子成像技术追踪移植的远端肺上皮前体细胞治疗肺纤维化
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
肺纤维化（PF）是一种进行性慢性肺部疾病，其特征是肺泡上皮反复受损，导致细胞外基质过度沉积，进而引起组织增厚、瘢痕形成以及气体交换功能受损，最终导致呼吸功能障碍。在美国，每年约报告5万例新发病例，患者面临气胸、肺动脉高压、呼吸衰竭等严重并发症，并且肺癌风险增加。目前的治疗手段疗效有限，主要目的在于延缓疾病进展。细胞治疗作为一种有前景的干预策略，具有再生受损肺组织、调节炎症反应以及改善肺功能的潜力。然而，这些疗法的有效性在很大程度上取决于能否对移植细胞在宿主肺组织内的分布、存活及整合情况进行有效监测。
磁性粒子成像（Magnetic Particle Imaging, MPI）是一种新型的、非侵入性的临床前成像技术，利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）作为示踪剂。MPI具有高灵敏度、高特异性和无背景信号的优点，可实现对体内标记细胞的实时、定量追踪。in vivo。在本研究中，我们探讨了MPI在监测人远端肺上皮祖细胞移植到免疫缺陷小鼠肺部过程中的应用。通过不同浓度的SPION对细胞进行标记以优化信号强度，并通过免疫染色和铁含量定量加以验证。经气管灌注后，采集二维MPI扫描图像以追踪移植细胞的空间分布。为期两周的纵向成像实现了对细胞在肺组织中整合与滞留情况的可视化。成功灌注的小鼠在左右肺均检测到MPI信号，且信号随时间逐渐减弱（约减少65%）。随后处死小鼠以进行组织学验证。本研究展示了MPI在肺纤维化细胞治疗中用于非侵入性、纵向细胞追踪的实用性，并重点围绕实验过程中所采用的精细技术展开。
引言
细胞治疗1,2具有再生潜力，可促进组织修复、减轻炎症，并改善白血病和淋巴瘤3,4（造血干细胞）、骨关节炎5,6（间充质干细胞）、1型糖尿病7（胰岛细胞移植）、脊髓损伤8,9、神经退行性疾病10,11,12（神经干细胞）以及肺纤维化13,14,15,16（肺祖细胞）等慢性疾病的治疗效果。尽管这些疗法展现出显著潜力，但仍面临免疫排斥和长期疗效等挑战17....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有涉及动物受试者的实验程序均已获得密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，涉及人类受试者的实验程序均已获得Corewell Health机构审查委员会（IRB）编号2017-198的批准。所有患者在参与研究前均签署了书面知情同意书。
从接受肺移植的特发性肺纤维化（IPF）患者中获取的人肺离体样本由Corewell Health提供。在移植手术前，所有患者均符合特发性肺纤维化（IPF）的诊断标准，表现为低氧血症、呼吸困难和肺容积减少43。对肺叶远端组织进行的病理学分析证实存在纤维化。
8周龄的雄性NOD/SCID小鼠购入后，先适应环境1周，然后饲养至12周龄再进行实验操作。
1. 人呼吸道上皮细胞的分离与扩增
- 将取出的肺组织样本置于冰上，以在解剖过程中保持细胞完整性。辨认样本中存在的支气管或大气道；小气道位于肺组织样本的远端部分，距离大气道最远。使用灭菌器械切除肺组织样本的远端部分，并将其分割成较小片段，以利于组织消化。用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗样本，去除多余的血液和液体，随后将含有小气道的肺组织样本置于含有蛋白酶的缓冲液中进行消化 Streptomyces griseus，1×青霉素/链霉素，DNase I，以及1....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本项预试验共使用六只小鼠。其中仅有一只小鼠在研究结束前死亡，发生于第10天。不同标记浓度下的二维磁粒子成像（MPI）信号强度被评估为细胞数量的函数（图1A）。观察结果显示，信号强度与氧化铁示踪剂的浓度呈正比。因此，250 µg/mL 的浓度被视为最佳标记浓度，并用于后续研究。体外细胞标记还通过免疫染色及随后的荧光显微镜观察得以确认（图1B）。需要注意的是，细胞标记效率也可通过流式细胞术进行评估，但这需要额外的步骤，即将荧光染料与纳米颗粒偶联。尽管本研究未采用该方法，但它仍是一种有价值的策略，可在今后的研究中加以应用。
图1C展示了由10,000至60,000个细胞产生的二维磁粒子成像（MPI）信号强度。在移植研究中，选择50,000个细胞作为最佳细胞数量。图像显示细胞质中存在氧化铁示踪剂（红色），细胞核经DAPI染色呈蓝色。这些标记后的细胞通过气管内灌注移植到博来霉素（BLM）损伤的NO.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
气管内滴注是一种将物质直接递送至小鼠肺部的精确技术。该操作过程中多个关键步骤需格外注意。首先，应确保麻醉深度适当，以防止动物不适或移动，并将小鼠仰卧固定，颈部伸展，以使气道与气管开口对齐，便于清晰暴露。使用舌压板有助于保持气道开放。导管插入时应谨慎操作，滴注物质（如干细胞、药物、纳米颗粒）时应缓慢进行，以避免反流或误吸。滴注后，需确保小鼠完全恢复，并在放回笼子前密切监测其是否出现痛苦或呼吸系统并发症。在成像过程中，其他值得注意的步骤包括将小鼠在MPI扫描仪中正确放置，使其与成像区域对齐，并优化磁场强度和扫描模式等参数，以实现高分辨率追踪。
此外，在滴注操作与MPI成像之间，应让小鼠从麻醉状态完全恢复，以避免因长时间镇静导致的呼吸窘迫。对于MPI成像过程，干细胞的充分标记至关重要。应仔细优化纳米颗粒浓度，在维持强MPI信号的同时避免细胞毒性。在MPI图像采集过程中，应针对肺部成像优化扫描参数，如磁场强度、频率和梯度。此外，强烈建议将CT或MRI等其他成像模式与MPI结合使用，以提供MPI本身所缺乏的解剖学背景信息。与CT的共配准可实现MPI信号在肺组织复杂结构（尤其是纤维化区域）中的.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究的部分资助来自授予 X.P.L. 的 R01HL153165-01A1 项目基金以及授予 P.W. 的 R21AI159928-01 项目基金。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.7 mL 微量离心管 | DOT Scientific | RN1700-GMT | 用于细胞收集和制备 BLM 稀释液 |
| 抗葡聚糖抗体 | STEMCELL Technologies | 60026 | 一抗 |
| BD Luer-Lok 注射器 | Becton, Dickinson | 309628 | 气管内灌注过程中用于空气注射 |
| Cytospin 3 | Thermo Shandon | 74010121GB | |
| DNase I | Millipore-Sigma | 10104159001 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS -/-） | Gibco | 14190250 | |
| 胎牛血清 | ThermoFisher Scientific | A5670701 | |
| 庆大霉素 | Gibco | 15750060 | |
| 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 568 | ThermoFisher Scientific | A-11004 | 二抗 |
| 山羊血清 | Millipore-Sigma | G9023 | |
| 异氟烷 | Covetrus | 11695067772 | 气体麻醉剂 |
| 异氟烷挥发器 | SOMNI Scientific | VS6002 | 麻醉设备 |
| Momentum | Magnetic Insight Inc | 临床前磁性粒子成像（MPI）扫描仪 | |
| 小鼠插管套件 | OHAN | Ohan-201 | 包含所有必需配件的完整插管套件 |
| NOD/SCID 小鼠 | Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:001303 | 免疫缺陷型小鼠模型 |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| PneumaCult-Ex Plus 培养基 | STEMCELL Technologies | 5040 | |
| 含 DAPI 的 ProLong Diamond 抗荧 quench 封片剂 | Invitrogen | P36962 | 免疫染色切片的封片介质 |
| 灰色链霉菌蛋白酶 | Millipore-Sigma | P5147 | |
| 手术器械包 | 用于固定小鼠舌头的钝头镊子 | ||
| 含 Tween20 的 Tris 缓冲盐水（TBST） | ThermoFisher Scientific | 28360 | |
| TrypLE Express 酶 | ThermoFisher Scientific | 12604021 | |
| VivoTrax Plus | Magnetic Insight | MIVTP01 | 用于体外细胞标记及后续 MPI 检测的氧化铁示踪剂 |
参考文献
- Biehl, J. K., Russell, B. Introduction to Stem Cell Therapy. J Cardiovasc Nurs. 24 (2), 98-103 (2009).
- Herberts, C. A., Kwa, M. S. G., Hermsen, H. P. H. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9 (1), 29(2011).
- Bair, S. M., Brandstadter, J. D., Ayers, E. C., St....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
