用于研究小鼠视网膜中神经胶质细胞相互作用的 离体 外植体模型

Summary

在这里，我们提供了一种从小鼠眼中分离视网膜以进行扩展 离体 实验的详细方法。该协议强调使希望利用通过将视网膜胶质细胞保持在活组织中原 位 提供的研究途径的研究人员可以使用这种技术要求高的方法。

Abstract

神经胶质细胞在青光眼中的作用是一个日益突出的研究课题，但关于这些支持细胞（即星形胶质细胞和小胶质细胞）的种群如何影响视网膜神经节细胞的存活，仍有许多未知数。虽然 体内 和体外模型提供了一定程度 的 洞察力，但这两种方法都有很大的局限性，例如前者外周免疫反应的影响，以及后者情况下细胞分离和培养诱导的生理功能变化。为了最大限度地减少这些混杂因素，我们开发了一种 离体 视网膜外植体系统，其中星形胶质细胞、小胶质细胞和其他视网膜细胞类型可以在 原位 维持至少 3 天，从而能够以比 体内模型通常 可行的更高的通量进行靶向研究。至关重要的是，这种方法非常适合在活体动物中具有挑战性或不可行的方法，但与完整神经组织的常见下游检测仍然兼容。在这里，我们提出了一种适用于分离和培养完整视网膜外植体的方案，以及免疫荧光显微镜的代表性结果，记录了 离体 视网膜中神经胶质细胞和视网膜神经节细胞所发生的变化。

Introduction

光敏视网膜是位于眼睛后部的中枢神经系统 （CNS） 的延伸，对视力至关重要，但容易受到急性损伤和慢性疾病的影响。与其他 CNS 区域一样，成人视网膜中的神经元在丢失时不会被替换，聚集视觉信息并将其传递到大脑的视网膜神经节细胞 （RGC） 在青光眼中特别容易受到功能障碍和死亡的影响，从而导致不可逆的视力丧失 ^1,2。青光眼是全世界导致失明的主要原因³，然而，尽管青光眼对受影响的个体造成了毁灭性的影响，并给社会带来了总体成本，但关于该疾病的早期阶段如何导致 RGC 损失，仍有许多未知数⁴。神经胶质细胞的作用是青光眼病理生理学的一个主要研究领域，因为这些非神经元支持细胞对 RGC 存活⁵ 至关重要，但在疾病中经历表型变化，这可能会减少有益行为⁶ ，甚至推动有害表型⁷ 的采用。尽管神经胶质细胞一词包括整个 CNS 中的一系列特殊细胞类型⁸，但这些细胞类型大致可分为两类 - 与神经元共享发育谱系并提供营养、能量和结构支持的细胞⁹....

Protocol

所有涉及动物的程序均已获得 Schepens 眼科研究所机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准（协议 # 2022N000030,2025 年 3 月 4 日批准）。根据视觉和眼科学研究协会 （ARVO） 关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明处理动物。

注意： 图 1 显示了从去核小鼠眼中分离活视网膜的关键步骤。

图 1：从去核小鼠眼中分离活体视网膜的关键步骤的图示表示。 关键步骤的相应步骤编号以圆圈形式提供。 请单击此处查看此图的较大版本。

1. 准备工作

1. 对 1....

Results

在宏观尺度上，外植的视网膜在 1 天和 3 天的时间点上基本保持不变，尽管到后者它们变得相对脆弱，需要在固定或其他实验终点之前小心处理。视网膜应相对平坦，无折叠（这可能导致氧气和营养物质扩散的局部中断），并且应悬浮在气液界面和细胞培养插入物之间的培养基中。到第 3 天，悬浮组织下方的插入物底部可能会形成一条微弱的条纹;用明场相差显微镜检查表明细胞碎片有适量脱落，可能是退化光感受器的外段，特别是在 24 小时和 72 小时时间点之间。考虑到光感受器的脆弱性以及它们对 RPE 底物的依赖，这在视网膜隔离过程中大部分丢失，这并不奇怪。但是，如果培养基本身看起来浑浊，则应调查微生物污染的可能性。尽管在初始分离过程中在生物安全柜外处理了视网膜，但我们无法检测到任何样品中的微生物污染，这表明使用无菌缓冲液、在培养基中加入青霉素 （100 U/mL） 和链霉素 （100 μg/mL） 以及在组织培养环境中小心无菌技术足以避免在研究时间范围内可检测的污染。

通过免疫荧光进行显微镜评估
在视网膜中，星形胶质细胞和小胶质细胞（以及神经节细胞）通常将其细胞体平行于.......

Discussion

器官型培养³² 方法（如视网膜外植体）利用了细胞培养的实验灵活性和快速周转时间，同时保留了体内研究的大部分原位背景，使其成为研究细胞类型之间复杂相互作用的有效途径。我们将该协议作为研究人员的切入点，这些研究人员可能在眼睛方面有丰富的经验，并且对作固定的视网膜但不熟悉新的视网膜感到满意;因此，我们专注于减少与分离和处理相关的技术挑战和变化，我们的经验表明，这是可靠生成一致样品的主要障碍。然而，眼睛是一个复杂的器官，由结构和组织组成，这些结构和组织在材料特性上的变化几乎与它们在功能上的变化一样大，而小鼠眼睛的紧凑性质进一步加剧了在不损伤的情况下提取视网膜的挑战。因此，需要一定程度的灵活性，以避免在分离过程中对视网膜造成过多的结构或代谢损伤，并可靠地获得高质量的组织。识别和减少这些并发症的建议在结果部分的相关区域（“识别和排除机械损伤”和“代谢损伤”）中提供。

尽管我们和其他人主要在青光眼的背景下描述了外植体的使用——这既反映了我们小组的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 手术刀刀片	Bard-Parker	3,71,311
1 mL 移液管（"Pipetman P1000"）	Gilson	F144059M
100 mm 培养皿	Falcon	351029
16% 多聚甲醛 Ted	Pella Inc	18,505	稀释至 4% 用于固定
24 孔板	Falcon	353047	用于固定、封闭和抗体孵育
35 mm 培养皿	Falcon	351008
6 孔板和插入试剂盒	Greiner bio-one	657641
Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG （H+L）	Jackson ImmunoResearch Laboratories， Inc.	711-545-152	1：800 稀释度
Alexa Fluor 594 驴抗大鼠 IgG （H+L） 高度交叉吸附的	Invitrogen	A-21209	1：800 稀释度
Alexa Fluor 594-F（ab'）2 驴抗小鼠 IgG （H+L）	杰克逊免疫研究实验室公司	715-586-150	1：800 稀释
Alexa Fluor 647-驴抗豚鼠 IgG （H+L）	Jackson ImmunoResearch Laboratories， Inc.	706-605-148	1：800 稀释
Alexa Fluor 647-F（ab'）2 驴抗鸡 IgY （IgG） （H+L）	杰克逊免疫研究实验室公司	703-606-155	1：800 稀释
角镊子 （'5/45'）	FST / Dumont	11251-35
抗 Brn3a 抗体（小鼠）	Chemicon	MAB1585	1：200 稀释
抗 CD206 抗体（大鼠）	Biorad	MCA2235	1：200 稀释
抗 GFAP 抗体（鸡）	Abcam	ab4674	1：1000 稀释
抗 Iba1抗体（兔）	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	1：500 稀释
抗 Tmem119 抗体（豚鼠）	Synaptic Systems	400 004	1：500 稀释
B-27,50x	Gibco （Thermofisher）	17504044
钝弧形镊子 （'Extra Fine Graefe）FST		11152-10
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647	使用 1% w/v 进行封闭和抗体孵育
过滤试剂盒（0.2 & micro;m aPES 膜，150 mL 瓶顶过滤器）	Fisherscientific	FB12566508
细刷，尺寸 3/0	Princeton Art & Brush Co.	06435-1030
GlutaMax	Gibco （Thermofisher）	35050061
实验室湿巾 （Kim 湿巾）	KIMTECH	34155
N-2,100x	Gibco （Thermofisher）	17502048
Neurobasal-A 培养基，减去酚红	Gibco （Thermofisher）	12349015
正常驴血清	Jackson ImmunoResearch Laboratories， Inc.	017-000-121	以 10% 用于封闭和抗体孵育青
霉素-链霉素	Gibco （Thermofisher）	15140122
液器吸头，1000 和微量;L	TipOne	1126-7810
弹簧剪刀（"Cohan-Vannas"）	FST	15000-11
无菌水（"不含 Dnase，Rnase"）	Invitrogen	10977-015
无菌过滤 PBS	Gibco	10010-023
直镊子（"迷你"）	FST / Dumont	11200-14
转移移液器，5.8 mL	fisherscientific	13-711-9AMMD
Triton X-100	Thermo Scientific Chemicals	A16046。AP	在 0.5% 下用于封闭和抗体孵育