此处，我们提供了一种详细的从小鼠眼球中分离视网膜的方法，适用于后续的长期研究 离体 实验。本方案旨在使这一技术要求较高的方法更易于研究人员掌握，以便利用在维持视网膜胶质细胞活性条件下所提供的研究路径 原位 在活体组织中。
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本文内容
摘要
摘要
胶质细胞在青光眼中的作用正成为日益重要的研究课题，但关于这些支持性细胞群体——特别是星形胶质细胞和小胶质细胞——如何影响视网膜神经节细胞存活，仍有许多未知之处。尽管 体内 和 体外 模型均能在一定程度上提供研究视角，但两种方法均存在显著局限性：前者受外周免疫反应的影响，后者则因细胞分离与培养过程引发生理功能的改变。为最大限度减少这些混杂因素，我们开发了一种 离体 视网膜外植体系统，可用于维持星形胶质细胞、小胶质细胞及其他视网膜细胞类型 原位 至少持续3天，从而实现比通常可行的方法更高的通量靶向研究 体内 模型。至关重要的是，该方法适用于在活体动物中难以或无法实现的技术手段，同时仍可兼容对完整神经组织进行的常见下游检测。本文介绍了一种适用于完整视网膜外植体的分离与培养的实验方案，并展示了免疫荧光显微镜的代表性结果，记录了胶质细胞和视网膜神经节细胞在培养过程中所发生的变化 离体 视网膜
引言
对光敏感的视网膜是位于眼球后部的中枢神经系统（CNS）延伸部分，对视觉至关重要，但易受急性损伤和慢性疾病的损害。与其他中枢神经系统区域一样，成年视网膜中的神经元一旦丢失便无法再生，而视网膜神经节细胞（RGCs）在青光眼中尤为容易发生功能障碍和死亡，这些细胞负责汇聚并传递视觉信息至大脑，其损伤将导致不可逆的视力丧失1,2青光眼是全球范围内导致失明的主要原因之一3，然而尽管该病对患者个人造成毁灭性影响，并给社会带来巨大负担，关于其早期阶段的许多机制仍不明确 疾病导致视网膜神经节细胞丢失4胶质细胞在青光眼病理生理学中是一个重要的研究领域，因为这些非神经元支持细胞对视网膜神经节细胞的存活至关重要5 但在疾病状态下会发生表型改变，可能削弱其有益行为6 或甚至促进有害表型的出现7. 尽管胶质细胞这一术语涵盖了中枢神经系统中多种特化的细胞类型8，这些细胞大致可分为两类——与神经元具有共同发育谱系并提供营养、能量和结构支持的细胞9以及起源于髓系、执行特异性免疫监视和应答功能的细胞
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方案
所有涉及动物的实验程序均经施佩恩斯眼科研究所机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准（方案编号 # 2022N000030，批准日期 2025年3月4日）。动物的饲养与操作遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明。
注意：图1 展示了从小鼠摘除眼球中分离活体视网膜的关键步骤。
图1：从小鼠摘除眼球中分离活体视网膜关键步骤的示意图。 关键步骤的相应序号以圆圈标注。请点击此处查看该图的放大版本。
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结果
在宏观尺度上，分离的视网膜在培养1天和3天后基本保持不变，但在后者时间点时组织会变得相对脆弱，因此在固定或其他实验终点前需小心操作。视网膜应保持相对平坦，避免折叠（折叠可能导致氧气和营养物质扩散的局部受阻），并应悬浮于培养基中，位于气液交界面与细胞培养插入物之间。到第3天时，在插入物底部、悬浮组织下方可能出现一条微弱的条纹；通过明场相差显微镜观察提示有中等程度的细胞碎片脱落，可能为变性光感受器的外节段，尤其在24小时至72小时之间更为明显。这并不意外，因为光感受器本身较为脆弱，且依赖于视网膜色素上皮（RPE）基质，而该基质在视网膜分离过程中大部分已丢失。然而，若培养基本身出现浑浊，则应考虑微生物污染的可能性。尽管在初始分离过程中视网膜曾暴露于生物安全柜外环境，但我们未能在任何样本中检测到微生物污染，表明使用无菌缓冲液、在培养基中添加青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL），以及在组织培养环境中严格执行无菌操作，足以在研究的时间范围内避免可检测的污染。
通过免疫荧光进行显微评估
在视网膜中，星形胶质细胞和小胶质细胞（以及神经节.......
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讨论
器官型培养32 视网膜外植体等方法在保留大部分组织结构和细胞相互作用的同时，兼具细胞培养实验灵活性高和周转时间短的优势 原位 上下文 体内 研究，使其成为探究细胞类型间复杂相互作用的有力途径。本实验方案旨在为那些在眼部研究方面已有丰富经验、能够熟练操作固定视网膜但尚未掌握新鲜视网膜处理的研究人员提供入门指导。因此，我们重点在于降低分离与操作过程中相关的技术难度和变异，因为根据我们的经验，这些因素是获得稳定、可靠样本的主要障碍。然而，眼球是一个结构复杂的器官，其组成结构和组织在功能上差异显著，在材料特性上同样存在巨大差异；而小鼠眼球体积较小，进一步加大了无损伤提取视网膜的难度。因此，在分离过程中必须具备一定程度的灵活性，以避免对视网膜造成过度的结构或代谢损伤，并可靠地获取高质量的组织样本。针对识别和最小化这些并发症的建议，已在结果部分的相关内容中予以说明（“机械性损伤的识别与处理”和“代谢性损伤”）。
尽管我们及其他研究团队此前主要在青光眼的背景下描述了组织外植体的应用——这既反映了我们课题组的研究重.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
M.A.M. 获得了美国国立卫生研究院/国立眼科研究所（NIH/NEI）R01EY035312 项目、青光眼研究基金会“治愈催化剂奖”（Glaucoma Research Foundation Catalyst for a Cure Award）、Melza M. 和 Frank Theodore Barr 基金会、Robert M. Sinskey 医学博士基金会、Ruettgers 家族慈善基金会以及 B.L. Manger 基金会的支持。P.F.C. 获得了美国国立卫生研究院/国立眼科研究所（NIH/NEI）2T32EY007145 项目的支持。本研究还得到了美国国立卫生研究院视觉科学研究核心资助 P30 EY003176 的支持。 图 1 使用 BioRender 生成。作者谨此感谢 Nasir Uddin 博士对 稿件提出的 意见，以及 Qiurong Zhu 博士在 协助与支持方面所做的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #11 手术刀片 | Bard-Parker | 3,71,311 | |
| 1 mL 移液器（“Pipetman P1000”） | Gilson | F144059M | |
| 100 mm 培养皿 | Falcon | 351029 | |
| 16% 多聚甲醛 | Ted Pella Inc | 18,505 | 稀释至 4% 用于固定 |
| 24 孔板 | Falcon | 353047 | 用于固定、封闭和抗体孵育 |
| 35 mm 培养皿 | Falcon | 351008 | |
| 6 孔板及插件套装 | Greiner bio-one | 657641 | |
| Alexa Fluor 488-驴抗兔 IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-545-152 | 1:800 稀释 |
| Alexa Fluor 594 驴抗大鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附 | Invitrogen | A-21209 | 1:800 稀释 |
| Alexa Fluor 594-F(ab')2 驴抗小鼠 IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-586-150 | 1:800 稀释 |
| Alexa Fluor 647-驴抗豚鼠 IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 706-605-148 | 1:800 稀释 |
| Alexa Fluor 647-F(ab')2 驴抗鸡 IgY (IgG) (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 703-606-155 | 1:800 稀释 |
| 弯头镊子（“5/45”） | FST / Dumont | 11251-35 | |
| 抗 Brn3a 抗体（小鼠） | Chemicon | MAB1585 | 1:200 稀释 |
| 抗 CD206 抗体（大鼠） | Biorad | MCA2235 | 1:200 稀释 |
| 抗 GFAP 抗体（鸡） | Abcam | ab4674 | 1:1000 稀释 |
| 抗 Iba1 抗体（兔） | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 019-19741 | 1:500 稀释 |
| 抗 Tmem119 抗体（豚鼠） | Synaptic Systems | 400 004 | 1:500 稀释 |
| B-27，50x | Gibco (Thermofisher) | 17504044 | |
| 钝头弯镊（“Extra Fine Graefe”） | FST | 11152-10 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9647 | 封闭和抗体孵育时使用 1% w/v |
| 滤器套装（0.2 µm aPES 膜，150 mL 瓶顶滤器） | fisherscientific | FB12566508 | |
| 细毛刷，3/0 号 | princeton art & brush co. | 06435-1030 | |
| GlutaMax | Gibco (Thermofisher) | 35050061 | |
| 实验室擦拭纸（Kim wipes） | KIMTECH | 34155 | |
| N-2，100x | Gibco (Thermofisher) | 17502048 | |
| Neurobasal-A 培养基，无酚红 | Gibco (Thermofisher) | 12349015 | |
| 正常驴血清 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 017-000-121 | 封闭和抗体孵育时使用 10% |
| 青霉素-链霉素 | Gibco (Thermofisher) | 15140122 | |
| 移液器吸头，1000 µL | TipOne | 1126-7810 | |
| 弹簧剪刀（“Cohan-Vannas”） | FST | 15000-11 | |
| 无菌水（“无 DNase、RNase”） | Invitrogen | 10977-015 | |
| 经无菌过滤的 PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 直头镊子（“mini”） | FST / Dumont | 11200-14 | |
| 移液管，5.8 mL | fisherscientific | 13-711-9AMMD | |
| 吐温 X-100 | Thermo Scientific Chemicals | A16046.AP | 封闭和抗体孵育时使用 0.5% |
参考文献
- Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
- Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M.
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