评估长期单侧输尿管梗阻逆转后长期结构和功能结局的小鼠模型

Summary

本文提供了详细说明，使研究人员能够使用标准化模型对小鼠进行可逆的单侧输尿管梗阻，该模型允许分析长期输尿管梗阻逆转后的长期结构和功能结果。

Abstract

尿路梗阻 （UTO） 患者的临床管理需要早期干预以逆转梗阻的原因，但尽管如此，长期 UTO 患者患慢性肾病 （CKD） 和复发性急性肾损伤 （AKI） 的风险增加。然而，除了早期逆转梗阻和仿制药治疗以延缓 CKD 进展外，没有其他疗法能显著改善 UTO 逆转后的长期肾脏结局。为了解决这个问题，许多实验室已经开发了可逆 UUO （R-UUO） 模型，但这些模型在技术上具有挑战性，尚未得到广泛采用。此外，虽然 R-UUO 的小鼠模型很有吸引力，因为它们可用于利用小鼠遗传学的力量来研究疾病病理生理学，但这些模型尤其具有挑战性，因为如果阻塞持续 >3 天，所使用的方法通常会导致不可逆的 UUO。此外，由于这些模型的性质，很少有研究评估逆转输尿管梗阻的长期功能结局。为了解决这个问题，我们最近开发了一种延迟对侧肾切除术的 R-UUO 小鼠模型，该模型允许分析逆转长期 UTO 对长期肾脏结构和功能结果的长期影响。这些研究表明，尽管逆转后 3 个月组织学几乎完全恢复，但肾功能永久性降低，尿液浓缩能力出现明显且持续的缺陷，表明肾髓功能缺陷。该模型需要三次主要的生存手术，但会导致肾功能稳健且可重复的长期降低，这可以通过调整阻塞期在不同的小鼠品系中重现。在本文中，我们提供了有关执行这些手术、优化在不同小鼠品系中使用的条件、评估肾功能结果和收获肾组织的详细说明。

Introduction

尿路梗阻 （UTO） 可能是单侧的，通常无症状，在慢性梗阻性尿路病¹ 中晚期出现，也可能急性表现为肾绞痛和/或血尿;急性肾盂肾炎或肾后急性肾损伤 （AKI）²。治疗 UTO 的关键是早期逆转梗阻²。然而，尽管有效逆转并使用仿制药来延缓慢性肾脏病 （CKD） 的进展，但受影响的患者患进行性 CKD 和高血压的风险仍然增加 ^3,4。此外，长期尿液浓缩能力 （UCC） 经常受损⁵，这可能使易感患者易患脱水和复发性 AKI，加速 UTO 后肾功能的进行性下降。

在某种程度上，未能确定改善 UTO 患者长期预后的治疗方法是由于我们依赖使用不可逆的单侧输尿管阻塞 （UUO） 模型来探索 UTO 的病理生物学。然而，这些模型并不能复制患者在诊断后不久发生逆转的临床情况，也不能用于探索可用于改善梗阻逆转后长期修复的机制和治疗方法。已经开发了可逆 UUO （R-UUO） 模型来解决这个问题，但这些模型比不可逆 UUO 模型在技术上更具挑战性，更难被不同的实验室复制，因此，尚未被科学界广泛采用。小鼠模型很有吸引力，因为它们可以用来利用小鼠遗传学的力量来研究疾病病理生理学，但它们的优化特别具有挑战性，因为如果梗阻持续超过 3 天，这些方法通常会导致不可逆的 UUO⁶。已经部署了多种方法来解决这个问题，包括多次手术，每 2 天沿输尿管顺序放置夹子 ^6,7;UUO 后膀胱再植入 8,9,10,11;并使用无损夹子和管子阻塞输尿管 12,13,14。大鼠和小鼠的长期结局研究表明，梗阻逆转后肾功能改善，纤维化减少和/或肾小球损伤，但如果 UUO 持续时间超过 2 天，则只能部分恢复 6,7,8,9,12,14,15,16,17,18,19 .此外，虽然肾髓质 （RM） 直到最近还特别容易受到 UTO^20,21 造成的损伤，但还没有长期的啮齿动物研究研究研究长时间 R-UUO 对 RM 结构和功能的影响。这很重要，因为 UCC 和在不增加血压的情况下排泄盐负荷的能力（所谓的压力利钠反应）取决于维持 RM ^22,23,24 的解剖完整性，因此 UTO 逆转后 RM 的不完全修复可以解释为什么患者在 UTO 逆转后对复发性 AKI 和高血压的易感性增加。然而，评估这一点所需的许多技术需要多轮手术（梗阻 6 天的 5 次大手术 ^6,7），需要难以传授的外科专业知识（例如，手术将输尿管再植到膀胱中 ^8,9,10,11），并且由于梗阻是单侧的，这使得研究人员难以评估梗阻逆转后肾功能的变化。

为了解决这个问题，我们开发了一种 R-UUO 小鼠模型，该模型相对易于执行和教学，比其他技术需要更有限的手术次数（两次手术治疗 5 至 7 天的梗阻），并允许分析肾功能恢复，而无需侵入性和/或昂贵的分裂肾功能研究²⁵.为此，小鼠接受三种主要手术：1） 在左输尿管近端放置非创伤性血管夹;2） 5 至 7 天后移除血管夹，具体取决于小鼠品系;3） 10 天后切除对侧肾以评估肾功能。大约 20% 至 40% 的小鼠在肾切除术后 2-3 天内死亡，表明 UUO 不会在所有小鼠中逆转。对存活小鼠的长期随访表明，尽管在 R-UUO 后 3 个月肾髓质 （RM） 的组织学几乎完全恢复。肾功能下降，通过透皮肾小球滤过率 （tGFR） ²⁶ 测量。此外，通过测量限水后尿渗透压确定的 UCC 显着降低，表明 RM 功能存在永久性缺陷。时程研究表明，虽然 RUUO 后 28 至 56 天 tGFR 有所改善，但在第 56 至 84 天之间稳定下来。相比之下，R-UUO²⁵ 后第 28 天至第 84 天之间 UCC 没有改善。使用分离的 RM 的 scRNA-Seq，通过细胞谱系和免疫组织化学研究验证，我们确定了强烈的再生反应，这些反应在 R-UUO 后恢复了 RM 尺寸，但 RM 中的所有主要细胞区室都显示出细胞数量和基因特征的永久性变化，这可能会影响 R-UUO 后的功能恢复。这包括 R-UUO 后 84 天亨利细胞群 RM 集合管和环的持续促炎反应，类似于 AKI 和 UUO 后修复失败的近端肾小管上皮细胞的炎症和衰老特征^{27、28、29、30}。在复发性肾结石病患者的 RM 集合管中也观察到类似的变化³¹，表明人类和小鼠对 RM 损伤的损伤反应很常见。在本文中，我们详细说明了我们如何进行这些手术，我们如何优化其在不同小鼠品系中的使用条件，我们如何确定输尿管逆转后是否仍然阻塞，我们如何评估关键功能结果，以及我们如何收集肾组织来评估肾髓质结构。

Protocol

这里描述了用于长期研究的四步方案（图 1）。如本手稿末尾所讨论的，如果有兴趣研究长期结果，研究人员可以选择只执行其中的三个（第 1、2 和 4 节）或全部四个。本手稿中的所有小鼠实验均已获得范德比尔特机构动物护理和使用委员会的批准，并遵守动物使用指南。

1. 放置输尿管夹（10 - 15 分钟/小鼠）

注意：依靠小鼠肾脏解剖学知识来定位输尿管，因为如果没有周围的结缔组织，就无法直接看到它。当肾脏暴露时，输尿管沿着肺门组织的下后部延伸（图2）。血管夹的选择很重要。这些可能很昂贵，但可以多次清洁、高压灭菌和重复使用。这些夹具可以重复使用至少 100 次而不会出现问题。

1. 手术前将所有手术器械在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。如果对多只小鼠进行手术，请在使用之间清除器械中的血液和碎屑，并使用热珠灭菌器消毒 10-15 秒。让仪器冷却后再使用。
2. 称量鼠标。
3. 通过腹膜内注射，使用5-10 mg / kg甲苯噻嗪和90-120 mg / kg氯胺酮麻醉小鼠（参见 材料表）。这通常需要 3-5 分钟才能生效。
4. 如果使用不同的麻醉剂，例如异氟醚，则进行术前镇痛，因为与甲苯噻嗪不同，它没有镇痛作用。
5. 从臀部到胸腔和侧面剃掉手术部位，留出足够的边界以防止毛发污染切口部位。在准备区域进行，而不是在进行手术的地方进行。
6. 用无菌手术单覆盖加热的手术区域。它将有助于防止杂散的毛发进入手术区域，并提供一个放置无菌器械的区域。
7. 将眼科润滑软膏涂抹在眼睛上。
8. 使用浸泡了 betadine 的纱布进行无菌准备：从部位中心向周边擦洗 3 到 4 次，每次用酒精棉签擦拭一次。切开前从手术区域中取出所有 betadine。
9. 使用剪刀和镊子在中线上穿过皮肤和皮下层做一个 1.5 厘米的纵向背切口。
10. 在肾脏上方的左侧腹肌和筋膜上做一个小切口，然后将左肾向外。
11. 仔细解剖输尿管应位于位置的下极脂肪和一些结缔组织。如果没有周围的结缔组织，就不可能直接看到输尿管。然后，将输尿管及其周围的结缔组织与包含肾静脉和动脉的肾蒂分开，因此肾蒂不包括在输尿管夹中（图2）。
12. 使用夹钳将其打开并将其放在骨盆正下方的输尿管上。使用血管夹上的标记，确保它们以相同的压力放置在每只小鼠的输尿管上（图 3）。不要使用，然后取下夹子以重新定位，因为这会损坏输尿管。
13. 放置夹子后，使用浸有盐水的无菌棉签轻轻地将带有夹子的肾脏推回腹膜后间隙。
14. 使用可吸收缝合线闭合肌肉层。
15. 使用蒙皮剪辑闭合蒙皮层。
16. 如药物部分所述，施用丁丙诺啡 3.25 mg/kg 镇痛剂，并皮下施用 0.5 mL 无菌生理盐水以给小鼠补水。
17. 将鼠标留在加热的硬垫手术区域上，或在笼子的一半下方用加热的等温垫将其转移到它们的家笼中，直到鼠标醒来。
18. 将鼠标放回动物房间。
19. 密切监测小鼠并给予额外剂量的丁丙诺啡以缓解疼痛或不适 48 至 72 小时。表明小鼠需要额外镇痛的疼痛和痛苦的临床体征包括抑郁或其他行为改变、异常外观或姿势，例如竖毛、驼背姿势、缺乏梳理和进食或不动。

2. 移除输尿管夹（10 - 15 分钟/小鼠）

1. 按照夹具放置程序步骤 1.1-1.10 使用原始皮肤和肌肉切口开始移除夹具。在清洁手术区域之前取下伤口夹。通常不需要再次剃须，因为头发还没有重新长出。
2. 由于形成的组织粘连，使用镊子小心地将夹子定位在腹膜后间隙，而无需先将肾脏外出。使用夹钳轻轻打开夹子，同时使用镊子从夹头周围向下拉组织以取下夹子。
3. 现在，将肾脏外取出，以便可以看到肾盂以确定梗阻。肾盂应肿胀，提示肾积水。
4. 检查肾脏后，使用浸有盐水的无菌棉签轻轻地将肾脏推回腹膜后间隙。
5. 按照上述步骤 1.13-1.18 进行作。

3. 对侧肾切除术（10 - 15 分钟/只小鼠）

1. 如果有毛发生长，请剃掉该区域。
2. 使用 1-5% 异氟醚/空气混合物进行麻醉，由于先前有麻醉事件，因此更容易恢复。在清洁手术区域之前取下伤口夹。
3. 术前给予丁丙诺啡镇痛剂（见 材料表）。
4. 按照程序步骤 1.1-1.9 使用原始皮肤切口开始。
5. 在肾脏上方的右侧胁腹肌和筋膜上做一个小切口，然后将右肾向外侧。
6. 用光滑弯曲的镊子轻轻握住肾脏，小心地解剖肾脏的上下两极，使其脱离周围组织。
   注意：来自上极周围的组织包含肾上腺，携带自己的血液供应，可以从肾脏中拉出，但显然不应从小鼠身上移除（见 图 2）。
7. 将肾脏从周围组织中解放出来后，使用双手术结将 4-0 丝缝完全系在肾血管和输尿管周围。如果放置 ~30 秒，肾脏会变黑。用光滑、弯曲的镊子握住肾脏，然后用弯曲的剪刀向远端剪开结，取出肾脏。
8. 使用浸有盐水的无菌棉签轻轻地将剩余的肾蒂推回腹膜后间隙。
9. 按照上述步骤 1.13-1.18 进行作。

4. 组织采集

1. 用 5% 异氟醚/空气混合物麻醉，以在终末手术前实现稳定的手术麻醉平面。
2. 打开腹腔，露出左肾
3. 检查肾脏以查看肾盂是否有任何肿胀（参见步骤 2.3）。
4. 如果看起来肾盂仍然肿胀，插入一个小规格蝶针，该针连接到装有 0.5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中 1：5000 稀释的亚甲蓝的注射器。如果输尿管通畅，则蓝色溶液从肾盂进入膀胱时将可见。否则，肾盂会因蓝色溶液而肿胀，并且不会出现在膀胱中。
5. 要进行灌注固定肾脏，请打开胸腔并露出心脏。
   1. 当心脏仍在跳动时，将 23-25 G 蝶针插入左心室，开始输注生理盐水，并切开右心房或心室，用生理盐水代替血容量。
   2. 大约一分钟后，确保肾脏是白色的。继续盐水输注再输注一分钟，或将其换成 10% 福尔马林溶液的输注再输注 1-2 分钟以固定组织。
   3. 此时，鼠标将死机;收获组织。如果收集组织用于 RNA 或蛋白质研究，请勿灌注固定。
6. 从动物身上取出肾脏后（无论它们是否已灌注固定），使用剃须刀片通过肾脏中心切下最多三个 2-3 毫米厚的矢状切片（图 4）。这提供了包括肾髓质和皮质在内的代表性切片，并为组织学、蛋白质或 RNA 检测提供了足够的组织。
7. 根据研究要求继续固定/冷冻样品。

Results

对于长期研究，我们通常通过测量清醒小鼠的连续血尿素氮 （BUN） 和透皮肾小球滤过率 （tGFR） 来评估肾功能（参见以前发表的描述这²⁶ 的文章），此外还通过评估尿渗透压 （UCC） 来自剥水 18 小时后收集的点尿样。虽然我们总是进行 BUN 检查，但这些检查对于评估肾切除术后早期损伤的严重程度最有用（见讨论）。然而，对于长期研究，BUN（和血清肌酐）测量的灵敏度不足以检测肾功能的细微变化。这些通常在肾切除术后的不同时间点进行（图 1A）。UCC 分析提供了肾髓功能的简单测量，通常显示尿渗透压值在同一时间点明显低于肾切除术对照小鼠。图 1B-E 显示了 R-UUO 后 84 天的典型生存曲线、BUN、tGFR 和尿渗透压测量值。

有关更详细的信息，包括优化不同小鼠品系输尿管夹时间的研究以及不同时间点肾皮层和髓质的组织学变化，请参阅我们之前发表的工...

Discussion

与一些用于研究小鼠延长 UUO 逆转的方法相比^{6,7,8,9,10,11,12,13,14}，此处描述的方案相对简单，不需要高水平的先前手术专业知识。它涉及相对较少的生存手术（最多 3 次），可用于评估长期功能结果。要使该技术成功且可重复，需要解决许多关键步骤。这些包括： 1） 将夹子始终放置在输尿管沿的相似点，因为有证据表明，增加梗阻与肾盂的距离可以减缓梗阻期间肾损伤的进展...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% 氯化钠	VUMC药房	倍数
可吸收缝合线 Vicryl 6-0	国际医学兽医 - ETHICON	J492G型
酒精拭子	BD牌异丙醇拭子	BD 326895
甜菜碱溶液	汉纳制药供应有限公司	67618015017
夹钳应用镊子：S&T CAF-4型	精细科学工具	00071-14
Deltaphase 等温垫	布伦特里科学	DPIP的
电动修剪器	奥斯特	倍数
ENCORE 乳胶纹理手术手套	安思尔	5785003
Ethiqa XR 丁洛芬诺 （CIII） VI 1.3 毫克/毫升	帕特森兽医 - 埃蒂卡	86084010030
EZ 夹子 9 毫米	布伦特里科学	EZC-CS型	或 7 毫米
EZ 夹子贴标机 9 mm	布伦特里科学	EZC-APL	或 7 毫米
EZ 夹子拆卸器 9 mm	布伦特里科学	EZC-RMV型	或 7 毫米
纱布海绵 2 ´2	费雪科学	22-362178
Graefe 斜角或弯曲锯齿状尖端	精细科学工具	11049-10
Graefe 直锯齿尖	精细科学工具	11050-10
加热硬垫 15 &锐度;24	布伦特里科学	HHP 2
加热硬垫泵连接器	布伦特里科学	HHP Gaymar 连接器
热珠消毒器	精细科学工具	18000-45
胰岛素注射器 0.5 mL 29 g	埃克塞尔国际	26028
异氟醚	帕特森兽医 - 皮维塔尔	78949580
氯胺酮 100 毫克/毫升	VUMC药房
不可缝合的丝绸 4-0	国际医学兽医 - ETHICON	683克
Olsen Hegar 持针器：带缝合刀	精细科学工具	12002-12
Optixcare 眼部润滑剂 20 克	国际医学兽医	PHOPTIXCARE的
剪刀-钝词-婴儿	精细科学工具	14078-10
剪刀-锋利的弯曲	精细科学工具	14005-12
无菌棉头涂抹器	清教徒	25806 2WC
无菌纱布海绵 4 ´4	费雪科学	22-415-469
无菌外科一次性手术单 18 & 急性;26	国际医学兽医	20001
灭菌器械袋 5 & 急性;10	费雪科学	01-812-54
T/泵加热冷却泵	布伦特里科学	TP-700型
泰勒镊子弯曲，光滑	精细科学工具	11017-17
血管夹：S&T 5 至 15 g 压力机	精细科学工具	00396-01
甲苯噻嗪 100 毫克/毫升	帕特森兽医 - 克洛诺斯	CR04305