使用电生理学平台进行视网膜波的高密度多电极阵列记录

Summary

高密度多电极阵列 （HD-MEA） 用于研究自发视网膜波，这在神经回路发育中起着至关重要的作用。该协议概述了在电生理学平台上使用 HD-MEA 制备小鼠视网膜组织和进行电生理记录的步骤。

Abstract

自发视网膜波是发育过程中视网膜网络活动的标志，通过影响轴突的细化、脉管系统的通透性和神经回路的整体成熟，在视觉系统的形成中起着至关重要的作用。这些波通常在 离体 视网膜制备中使用多电极阵列 （MEA） 进行研究，从而能够对大量视网膜神经节细胞 （RGC） 活性进行电生理记录。基于 MEA 的电生理学因其易于使用而成为一种强大的工具，可快速收集高通量数据，因此非常适合研究各种实验条件下的视网膜活性。

在该协议中，我们概述了准备视网膜组织以在电生理学平台上使用高密度 MEA （HD-MEA） 获取电生理数据的关键步骤。该过程从生理条件下从新生动物中小心地分离完整的视网膜开始。准备好后，视网膜被小心地安装在 HD-MEA 芯片上，该芯片由一个由 26,400 个电极组成的网格组成，能够同时对至少 1,000 个 RGC 进行细胞外记录。记录可以持续长达几个小时。最终，这种方法在研究视网膜发育、疾病和潜在的跨物种比较研究方面提供了有价值的应用，有助于神经科学和视觉研究的更广泛进步。

Introduction

自发性视网膜波是在视力开始之前在发育中的视网膜中观察到的相关活动的周期性爆发。在小鼠中，启动和传播视网膜波的回路在发育过程中迅速变化，从胚胎开始到睁眼时（出生后第 14 ^天）结束1。随着视网膜回路的发育，视网膜波的时空特性发生了巨大变化 ^2,3。几项研究支持这些特定的时空特性指导视觉系统的发展：眼睛之间的异步活动指示眼睛特定的分离⁴，波面积大小指示双眼脑区域中视网膜轴突的细化 ^5,6，^波的传播方向与指示上丘中的方向选择性电路有关³.除了神经回路之外，视网膜波还负责血管通透性的发展⁷。此外，研究发现 II 期视网膜电波控制感受野区域的生长，并将其稳定在视网膜神经节细胞 （RGC） ^中8。至关重要的是，发育过程中异常的视网膜波可能是各种神经发育障碍的基础，事实上，视网膜波在先天性眼球震颤³ 的小鼠模型中是异常的。鉴于它们在早期视觉系统发育中的关键作用和对疾病的影响，有必要在任何年龄和任何动物模型中记录视网膜波的时空动力学。

已经出现了几种研究视网膜波的方法。单细胞电生理学 ^9,10 和钙成像 11,12,13,14,15 都导致了关于视网膜波回路和功能的开创性发现。在这里，我们专注于多电极阵列记录 （MEA），这种方法自视网膜波的早期研究¹⁶ 以来一直使用，并作为一种技术不断改进²。MEA 能够同时在细胞外记录从数百到数千个 RGC 的动作电位，使研究人员能够跟踪波的起始、传播和终止，类似于钙成像。由于 MEA 直接记录来自 RGC 的动作电位，因此 MEA 可用于研究各种遗传小鼠模型或非模式生物，而不会增加引入钙指示剂的复杂性。组织也可以直接在 MEA 中培养，从而实现非常长的记录时间。MEA 还具有高度可扩展性，当前产品可同时实现多达 6 个活性 MEA，从而能够快速评估视网膜并催化药物发现。MEA 的最大优势也许是它们能够以高采样率对许多细胞进行采样，这使得世界各地的实验室能够快速获得丰富的数据集，但需要后处理方面的专业知识。

该方案的主要目标是提供一个详细且可重复的方案，用于制备视网膜组织并使用单孔高密度 MEA （HD-MEA） 系统进行电生理记录，以研究 体外自发性视网膜波。该方法可确保高通量和长时间的数据采集，使其适用于广泛的发育和疾病相关研究。新的基于 CMOS 的先进 HD-MEA 系统一次允许 >1,000 个电极位点，与传统的电生理方法相比，它具有多项优势。其高密度电极阵列（26,400 个电极）能够精确、同步地记录多达 1,012 个 RGC，捕获精细的空间活动模式。单孔设计提供统一的记录条件¹⁷。此外，该系统允许持续数小时的长期记录，从而可以研究各种生理和药理条件下的波动力学，而不会显着降低信号¹⁸。通过提供协议，本研究旨在使神经科学、眼科和视觉科学领域的更广泛的研究人员能够使用 HD-MEA 技术。这种方法代表了视网膜波研究向前迈出的重要一步，为研究早期视觉系统发育、疾病机制和潜在的治疗干预提供了新的途径。

Protocol

该协议概述了使用 Maxwell Biosystems HD-MEA 平台从新生小鼠中分离和准备视网膜组织以进行视网膜波 MEA 记录的步骤。该程序旨在保持生理条件，确保视网膜组织保持结构完整、不受损伤，并为最佳电极接触做好充分准备。这些实验由范德比尔特动物护理和使用计划批准，方案编号为 M2200056-00。将小鼠 （1-2 周龄，两性） 饲养在 12 小时的昼夜循环饲养箱中，并喂食常规食物。

1. 视网膜组织的制备

1. 视网膜的分离
   注意：有关本方案中使用的材料、设备和试剂的详细信息，请参见 材料表 （另见 图 1）。
   1. 准备工作区
      1. 制备人工脑脊液 （aCSF）：125 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄、26 mM NaHCO₃、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM 葡萄糖，用碳水化合物鼓泡：95% O₂/5% CO₂ （pH 7.4，渗透压 290 ± 10 mOsm）并储存在 5 °C。 解剖前，将 aCSF 在充氧 10 分钟时保持在冰上。
         注：CaCl₂ 应在溶液用 carbogen 鼓泡 10 分钟后最后加入。
      2. 开始对新鲜的冰冷 aCSF 进行氧合（至少 10 分钟）。
      3. 设置解剖工具和显微镜。
   2. 根据机构指南对动物实施安乐死。
   3. 使用弯曲的弹簧剪刀摘除眼睛-
      1. 由于出生后的幼崽在 P11-13（小鼠）之前会闭上眼睛，并且需要小心打开眼睑，因此使用微型镊子抓住眼睑，用弹簧剪刀将其取下。用弹簧剪刀小心地取出眼睛，避免损伤眼睛。
      2. 切断视神经并将眼睛置于含氧 aCSF 中。使用移液管在培养皿之间轻轻移动眼睛。
         注意：对于解剖方案的其余部分，每 10 分钟用含氧 aCSF 刷新一次。
   4. 在解剖显微镜下，
      1. 用针头在角膜上做一个小切口，同时用镊子稳定眼睛。
      2. 沿着巩膜周边轻轻撕开，钝地解剖角膜。
      3. 取下光圈和镜头。如果视网膜附着在幼小动物的晶状体上，请使用镊子轻轻分离。
         注意：在幼小动物中，视网膜有时会附着在晶状体上。使用镊子轻轻地将晶状体从视网膜上拉出，使用一对镊子拉动晶状体，另一对镊子放在视网膜的外边缘，以便在取下晶状体时将视网膜保持在原位。
   5. 确定视网膜的方向。
      1. 使用脉络膜组织识别腹侧（有关定向的详细方案，请参见 Sondereker 等人 ¹⁹ ）并将其面向研究人员放置，RGC 层朝上。
      2. 使用弯曲的手术刀从腹轴逆时针方向做一个 45° 的参考切口。
      3. 使用细镊子轻轻地将视网膜与视网膜色素上皮 （RPE） 和巩膜分开。
         注意：在年轻的小鼠中，RPE 很容易从视网膜上剥落。在老年小鼠中，RPE 更贴近视网膜。如果在从视网膜的大部分去除 RPE 后，RPE 仍然通过视神经锚定在视网膜上，请使用弹簧剪刀切断该连接。这可以防止对视神经附近的视网膜组织造成损伤。
   6. 新生儿视网膜几乎没有玻璃体，但较旧的视网膜有（沿着视网膜边缘显示为棕色细丝，但纤维在玻璃体内也相互连接）。使用细镊子，去除位于 RGC 层上方的玻璃体组织。
      注意：取下晶状体时，该纤维层有时会脱落。如果没有，请务必尽可能多地去除它，否则会阻止 RGC 与电极正确接触。
   7. 使用手术刀进行四次缓解切口，以帮助视网膜平放在培养皿中。为了以后知道并保持方向，请用手术刀修剪腹侧象限的两个角。

2. 将视网膜安装在 MEA 芯片上

1. 安装视网膜-
   1. 使用移液管轻轻地将视网膜从培养皿转移到 MEA 芯片上，吸头被切断。确保芯片中有足够的 aCSF 覆盖孔的底部。
   2. 使用单发刷轻轻纵视网膜，使其位于电极上方，RGC 层面向电极。
   3. 使用 10 μL 移液器，轻轻去除视网膜组织周围多余的 aCSF。将芯片倾斜一个角度以去除多余的 aCSF。
      注：切勿用移液器吸头接触电极或放大器。随着 aCSF 的去除，视网膜会更加平坦。如果视网膜的任何部分折叠在自身下方，请使用单发刷轻轻舀取所需的小叶以展开它。为了防止视网膜在展开小叶的任何部分时移动，可以使用第二把单发刷在视网膜中心（视神经连接的地方）施加轻柔的压力。
   4. 将芯片倾斜 45° 角，并去除积聚在芯片倾斜部分的最后一块 aCSF，尽可能多地干燥芯片。
      注意：这将增加视网膜和电极之间的连接。
   5. 使用滤纸轻轻擦拭并擦干视网膜的边缘。将 MEA 芯片放入记录室中。
2. 增强电极接触-
   1. 使用可更换的组织支架插入物轻轻地将视网膜推到电极上，确保最佳接触并提高信噪比。
      注意：组织支架插入物一旦与视网膜接触，就应立即停止下降（在接触点处可以看到明显的“湿点”）。进一步降低电极支架可能会损伤视网膜组织。从步骤 2.1.4 快速过渡到 2.2.1，以最大限度地减少视网膜在没有含氧 aCSF 的情况下保持的持续时间;此步骤至关重要，应尽快完成。在芯片上压平视网膜时，快速移动很重要，但是，同样重要的是，解剖中的大部分 aCSF 要变干，以便视网膜与电极良好接触。太快使视网膜处于氧合状态可能会与记录电极无法良好接触，而太慢则可能导致视网膜细胞缺氧并死亡。我们发现 30-60 秒会导致良好的接触和健康的视网膜（即，我们观察到典型的视网膜波）。
   2. 使用参考灌注系统，开始以 2 mL/min 的流速用含氧 aCSF 填充 MEA 芯片孔。
      注意：建议使用开放式灌注系统，因为电噪声保持低，并且它为视网膜提供新鲜的 aCSF。确保将在线加热系统连接到灌注装置上，以将 aCSF 加热到生理条件。
   3. 打开灌注系统的在线加热器，将 aCSF 加热至 32-34 °C。

3. 电生理记录

1. 细胞外记录-
   1. 打开录制系统。
   2. 在采集计算机上，先双击 Server 图标，然后双击 Scope 将其打开。
   3. 单击 Scope 界面中的 Initialize 图标并输入 MEA 芯片 ID，以开始使用 MEA 系统进行细胞外记录。
   4. 单击 Scope 界面中的 Offset 图标以设置偏移量。
   5. 调整增益和滤波器设置以优化信号检测。使用默认设置 512 增益和 300 Hz 的高通;将采样率设置为 20 kHz。
   6. 选择适当的录制配置。可采样的总有效面积为 3.85 x 2.1 mm²。该软件允许用户选择如何配置电极间距;要遵循此协议，请使用默认设置，将记录电极均匀分布在最大有效区域上，因为这会在尽可能多的视网膜上采样。这导致每个记录电极的间距为 87.5 μm。
   7. 让视网膜适应记录室 60 分钟。
   8. 导航到 Assay 选项卡并选择 Create New Assay 图标，开始从 RGC 进行自发活动记录。选择 Network assay type（ 网络 检测类型），分配适当的文件名，然后单击 OK（确定 ）以保存配置。通过调整 Record time （sec） 参数来设置所需的录制持续时间。启用 Only Spike 选项以专注于加标数据，然后单击 Run Assay 图标开始记录会话。
      注：对于 10 分钟或更长时间的视网膜波记录，我们建议使用 仅尖峰 设置，该设置使用内置的尖峰检测工具仅保存动作电位的时间戳，而不是每个通道的完整原始电生理轨迹。这是因为在 1,024 个通道上进行长时间的记录（>10 分钟）很容易产生 TB 级的数据文件，这些数据文件在技术上难以分析，并且会大大减慢研究进度。我们已经证实，使用 尖峰时间 的原始数据仅复制了视网膜波的已知时空特性：对于 II 期波，我们观察到覆盖大部分视网膜的，并且以与先前报告相匹配的频率发生（见 图 2）。我们确实注意到，如果研究项目需要对尖峰波形进行更深入的分析，那么记录原始电生理轨迹是必要的。
   9. 定期监控正在进行的记录，以确保数据采集按预期进行并且系统运行正常。

4. 清理程序

1. 记录完成并保存数据后，关闭在线加热器，然后关闭灌注系统。
2. 小心地取出组织支架插入物并提取 MEA 芯片。首先用 70% 乙醇冲洗芯片，然后用去离子 （DI） 水冲洗芯片。
3. 为防止管道堵塞，请用去离子水冲洗灌注系统 15 分钟。

Results

使用 HD-MEA 对视网膜波进行高通量记录和分析
我们对自发性视网膜波进行了长达一小时的 HD-MEA 记录（图 2）。神经元活动的栅格图显示了视网膜波的结构化模式，其中每个点代表从单个电极检测到的动作电位（图 2A，底部）。跨电极的活度求和会产生一条迹线，这使得在 1 小时记录中更容易可视化波的时间（图 2A，顶部）。代表平均神经元活动的热图表明，我们可以对视网膜的大面积进行采样（图 2B）。我们对 HD-MEA 记录数据进行了分析，以分析波的时空特性，显示波的起始位置（图 2C）、波间间隔 （IWI）（图 2D）、波持续时间（图 ...

Discussion

此处描述的协议为制备视网膜组织和执行 HD-MEA 记录提供了一种可重复的高通量方法，为研究视网膜网络活动提供了一种强大的方法。与传统的电生理学和成像技术相比，HD-MEA 技术具有显著优势，尤其是在捕获高通量数据方面。HD-MEA 提供自发视网膜波动力学的实时、毫秒级精度记录，实现精确的波起始、传播和同步表征。此外，HD-MEA 超越了膜片钳方法，允许同时记录数千个视网膜神经节细胞 （RGC），从而提供网络活动的视图。这种可扩展性，再加上其易用性和长期记录稳定性，使 HD-MEA 成为发育研究的宝贵工具。该协议可以通过一些外推适用于大鼠和灵长类动物视网膜的 MEA 记录。最后，HD-MEA 记录的高通量特性具有药物发现的潜力，其高电极密度有助于精确监测药物诱导的视网膜活性变化。

该协议中最关键的步骤之一是正确隔离和安装视网膜。确保视网膜完好无损且没有撕裂或孔洞对于获得高质量的记录至关重要²⁰.快速进行解剖和制备以保持组织活力。在解剖显微镜下仔细检查视网膜，以确保视网...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL 一次性移液管（末端切断）	Fisherbarnd	13-711-9CM	协助在培养皿之间移动视网膜。
人工脑脊液 （aCSF）			维持视网膜组织的生理条件;由 NaCl、KCl、NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、MgCl2、葡萄糖组成，并用碳水化合物鼓泡。
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	制备人工脑脊液 （aCSF）
碳水化合物供应（95% O2，5% CO2）			用于给 aCSF 充氧并维持组织活力。
弯曲刀片手术刀 （#10）	Integra	4-110	用于精确切割组织。
解剖显微镜（立体镜）	Zeiss	Stemi 508	可视化和处理视网膜组织必不可少。
葡萄糖	Fisher Chemicals	BP350-1	制备人工脑脊液 （aCSF）
在线加热器	多通道系统	TC02	将 aCSF 加热至 32-34°;C 表示最佳条件。
Ismatec 灌注系统	Ismatec	ISM4208	维持含氧 aCSF 的连续流动。
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	制备人工脑脊液 （aCSF）
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	制备人工脑脊液 （aCSF）
MaxOne 记录单元	Maxwell Biosystems	MX1-BRD	MaxOne 芯片和系统
MaxOne 系统	Maxwell Biosystems	MX1-SYS	Core 系统，用于基于 MEA 的电生理反应。
MaxOne 组织支架，带有 3 轴显微作器和可更换插入物	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	确保视网膜在 MEA 芯片上的精确放置。
MEA 芯片 （MX1-S-CHP， MaxWell Biosystems）	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	用于记录神经元活动的高密度微电极阵列。
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	制备人工脑脊液 （aCSF）
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	制备人工脑脊液 （aCSF）
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500	制备人工脑脊液 （aCSF）
针头 （30 G x ½）	BD Biosciences	305106	帮助在角膜上做切口。
新生动物（P1-P14;小鼠）			模式生物，如小鼠、大鼠或其他用于视网膜研究的生物。
装有 MaxLab Live Scope 软件的 PC	HP	Z4	用于数据采集和记录分析。
培养皿（35 mm 或 60 mm）	Pyrex	3483E12	用作解剖工作区。
Roboz micro Adson 镊子（RS-5232,4.75 英寸长，1 x 2 齿，0.5 毫米尖端）	Roboz	RS-5232	用于精细解剖的专用镊子。
Roboz 弹簧剪刀（RS-5671,10 毫米刀刃，0.15 毫米尖端宽度，3¾" 总长度）	Roboz	RS-5671	用于切割精致组织的精密剪刀。
单发刷			改良为单根头发的小画笔，用于处理脆弱的组织。
两个细尖镊子	Roboz	RS-5060	用于精细的组织处理。
Whatman 滤纸 （#1），切成小块	GE Healthcare	1001-042	用于处理和干燥视网膜组织。