使用电生理学平台进行视网膜波的高密度多电极阵列记录

摘要

高密度多电极阵列 （HD-MEA） 用于研究自发视网膜波，这在神经回路发育中起着至关重要的作用。该协议概述了在电生理学平台上使用 HD-MEA 制备小鼠视网膜组织和进行电生理记录的步骤。

摘要

自发视网膜波是发育过程中视网膜网络活动的标志，通过影响轴突的细化、脉管系统的通透性和神经回路的整体成熟，在视觉系统的形成中起着至关重要的作用。这些波通常在 离体 视网膜制备中使用多电极阵列 （MEA） 进行研究，从而能够对大量视网膜神经节细胞 （RGC） 活性进行电生理记录。基于 MEA 的电生理学因其易于使用而成为一种强大的工具，可快速收集高通量数据，因此非常适合研究各种实验条件下的视网膜活性。

在该协议中，我们概述了准备视网膜组织以在电生理学平台上使用高密度 MEA （HD-MEA） 获取电生理数据的关键步骤。该过程从生理条件下从新生动物中小心地分离完整的视网膜开始。准备好后，视网膜被小心地安装在 HD-MEA 芯片上，该芯片由一个由 26,400 个电极组成的网格组成，能够同时对至少 1,000 个 RGC 进行细胞外记录。记录可以持续长达几个小时。最终，这种方法在研究视网膜发育、疾病和潜在的跨物种比较研究方面提供了有价值的应用，有助于神经科学和视觉研究的更广泛进步。

引言

自发性视网膜波是在视力开始之前在发育中的视网膜中观察到的相关活动的周期性爆发。在小鼠中，启动和传播视网膜波的回路在发育过程中迅速变化，从胚胎开始到睁眼时（出生后第 14 ^天）结束1。随着视网膜回路的发育，视网膜波的时空特性发生了巨大变化 ^2,3。几项研究支持这些特定的时空特性指导视觉系统的发展：眼睛之间的异步活动指示眼睛特定的分离⁴，波面积大小指示双眼脑区域中视网膜轴突的细化 ^5,6，^波的传播方向与指示上丘中的方向选择性电路有关³.除了神经回路之外，视网膜波还负责血管通透性的发展⁷。此外，研究发现 II 期视网膜电波控制感受野区域的生长，并将其稳定在视网膜神经节细胞 （RGC） ^中8。至关重要的是，发育过程中异常的视网膜波可能是各种神经发育障碍的基础，事实上，视网膜波在先天性眼球震颤³ 的小鼠模型中是异常的。鉴于它们在早期视觉系统发育中的关键作用和对....

方案

该协议概述了使用 Maxwell Biosystems HD-MEA 平台从新生小鼠中分离和准备视网膜组织以进行视网膜波 MEA 记录的步骤。该程序旨在保持生理条件，确保视网膜组织保持结构完整、不受损伤，并为最佳电极接触做好充分准备。这些实验由范德比尔特动物护理和使用计划批准，方案编号为 M2200056-00。将小鼠 （1-2 周龄，两性） 饲养在 12 小时的昼夜循环饲养箱中，并喂食常规食物。

1. 视网膜组织的制备

1. 视网膜的分离
   注意：有关本方案中使用的材料、设备和试剂的详细信息，请参见 材料表 （另见 图 1）。
   1. 准备工作区
      1. 制备人工脑脊液 （aCSF）：125 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄、26 mM NaHCO₃、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM 葡萄糖，用碳水化合物鼓泡：95% O₂/5% CO₂ （pH 7.4，渗透压 290 ± 10 mOsm）并储存在 5 °C。 解剖前，将 aC....

结果

使用 HD-MEA 对视网膜波进行高通量记录和分析
我们对自发性视网膜波进行了长达一小时的 HD-MEA 记录（图 2）。神经元活动的栅格图显示了视网膜波的结构化模式，其中每个点代表从单个电极检测到的动作电位（图 2A，底部）。跨电极的活度求和会产生一条迹线，这使得在 1 小时记录中更容易可视化波的时间（图 2A，顶部）。代表平均神经元活动的热图表明，我们可以对视网膜的大面积进行采样（图 2B）。我们对 HD-MEA 记录数据进行了分析，以分析波的时空特性，显示波的起始位置（图 2C）、波间间隔 （IWI）（图 2D）、波持续时间（图 .......

讨论

此处描述的协议为制备视网膜组织和执行 HD-MEA 记录提供了一种可重复的高通量方法，为研究视网膜网络活动提供了一种强大的方法。与传统的电生理学和成像技术相比，HD-MEA 技术具有显著优势，尤其是在捕获高通量数据方面。HD-MEA 提供自发视网膜波动力学的实时、毫秒级精度记录，实现精确的波起始、传播和同步表征。此外，HD-MEA 超越了膜片钳方法，允许同时记录数千个视网膜神经节细胞 （RGC），从而提供网络活动的视图。这种可扩展性，再加上其易用性和长期记录稳定性，使 HD-MEA 成为发育研究的宝贵工具。该协议可以通过一些外推适用于大鼠和灵长类动物视网膜的 MEA 记录。最后，HD-MEA 记录的高通量特性具有药物发现的潜力，其高电极密度有助于精确监测药物诱导的视网膜活性变化。

该协议中最关键的步骤之一是正确隔离和安装视网膜。确保视网膜完好无损且没有撕裂或孔洞对于获得高质量的记录至关重要²⁰.快速进行解剖和制备以保持组织活力。在解剖显微镜下仔细检查视网膜，以确保视网.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 mL 一次性移液管（末端切断）	Fisherbarnd	13-711-9CM	协助在培养皿之间移动视网膜。
人工脑脊液 （aCSF）			维持视网膜组织的生理条件;由 NaCl、KCl、NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、MgCl2、葡萄糖组成，并用碳水化合物鼓泡。
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	制备人工脑脊液 （aCSF）
碳水化合物供应（95% O2，5% CO2）			用于给 aCSF 充氧并维持组织活力。
弯曲刀片手术刀 （#10）	Integra	4-110	用于精确切割组织。
解剖显微镜（立体镜）	Zeiss	Stemi 508	可视化和处理视网膜组织必不可少。
葡萄糖	Fisher Chemicals	BP350-1	制备人工脑脊液 （aCSF）
在线加热器	多通道系统	TC02	将 aCSF 加热至 32-34°;C 表示最佳条件。
Ismatec 灌注系统	Ismatec	ISM4208	维持含氧 aCSF 的连续流动。
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	制备人工脑脊液 （aCSF）
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	制备人工脑脊液 （aCSF）
MaxOne 记录单元	Maxwell Biosystems	MX1-BRD	MaxOne 芯片和系统
MaxOne 系统	Maxwell Biosystems	MX1-SYS	Core 系统，用于基于 MEA 的电生理反应。
MaxOne 组织支架，带有 3 轴显微作器和可更换插入物	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	确保视网膜在 MEA 芯片上的精确放置。
MEA 芯片 （MX1-S-CHP， MaxWell Biosystems）	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	用于记录神经元活动的高密度微电极阵列。
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	制备人工脑脊液 （aCSF）
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	制备人工脑脊液 （aCSF）
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500	制备人工脑脊液 （aCSF）
针头 （30 G x ½）	BD Biosciences	305106	帮助在角膜上做切口。
新生动物（P1-P14;小鼠）			模式生物，如小鼠、大鼠或其他用于视网膜研究的生物。
装有 MaxLab Live Scope 软件的 PC	HP	Z4	用于数据采集和记录分析。
培养皿（35 mm 或 60 mm）	Pyrex	3483E12	用作解剖工作区。
Roboz micro Adson 镊子（RS-5232,4.75 英寸长，1 x 2 齿，0.5 毫米尖端）	Roboz	RS-5232	用于精细解剖的专用镊子。
Roboz 弹簧剪刀（RS-5671,10 毫米刀刃，0.15 毫米尖端宽度，3¾" 总长度）	Roboz	RS-5671	用于切割精致组织的精密剪刀。
单发刷			改良为单根头发的小画笔，用于处理脆弱的组织。
两个细尖镊子	Roboz	RS-5060	用于精细的组织处理。
Whatman 滤纸 （#1），切成小块	GE Healthcare	1001-042	用于处理和干燥视网膜组织。