高通量兼容的三维组织模型用于电穿孔阈值的定量分析

摘要

本方案利用计算建模，通过三维组织模拟物内转染细胞的空间分布，定量可逆与不可逆电穿孔的阈值，以实现对电穿孔方案的高通量分析。

摘要

电穿孔是一种利用电脉冲递送大分子并实现软组织消融的有前景技术，其应用包括新一代预防性治疗以及癌症等遗传性疾病的治疗。本研究展示了一种具备高通量能力的三维组织培养模型，可用于量化特定电穿孔方案下的可逆与不可逆电穿孔阈值。通过使用非均匀电场并分析转染细胞的空间分布，可在单个样本内同时确定可逆和不可逆阈值，从而提高电穿孔方案的表征效率，尤其有利于向体内应用转化。为验证该能力，采用环形与针状电极对包含HEK293细胞的三维组织模拟物进行转染，递送编码绿色荧光蛋白（GFP）的质粒。随后基于转染样本的荧光显微镜图像确定电穿孔阈值。该模型有望作为高通量评估电穿孔方案的有效手段，相较于当前评估此类阈值的方法具有显著优势——现有方法通常耗时较长，且对体内条件的代表性较差。

引言

可逆电穿孔（RE）是一种成熟的方法，用于将多种通常无法透过细胞膜的化合物和分子导入细胞^1,2,3。该方法利用脉冲电场（PEFs）达到临界电场强度，从而在细胞膜的某些区域诱导产生瞬时、局部的纳米孔。RE 已被用于递送多种分子和化合物，范围涵盖染料、核酸到化疗药物及其他药物^{4,5,6,7,8,9,10}。然而，若电场强度增加至足够高的水平，则会达到更高的临界阈值，导致细胞活力迅速下降^1,2,11,12。这一过程被称为不可逆电穿孔（IRE），....

方案

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 细胞准备

1. 在生物安全柜中，将 HEK293 细胞系以 1 × 10⁵ 个细胞/mL 的密度接种，每瓶组织培养 T75 培养瓶加入 10 mL Eagle's 最低必需培养基，培养基中添加 10% (v/v) 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素。
2. 将 HEK293 细胞置于 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润化培养箱中培养。
3. 接种后第 2 天进行实验，收获细胞：移除培养基，并加入 4 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液处理细胞。
4. 将细胞与胰蛋白酶在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润化培养箱中孵育 3–5 分钟，或直至细胞从培养表面脱落。
5. 加入 4 mL 培养基以终止胰蛋白酶的酶活性。
6. 在 180 × g 条件下离心 5 分钟收集细胞，弃上清，然后重悬于培养基中，调整细胞浓度至 8 × 10⁶ 个细胞/mL。

2. 三维组织模型的构建

注意：进行这些步骤时使用反向移液法，以防止....

结果

环形电极与针形电极成功将编码绿色荧光蛋白（GFP）的DNA质粒递送至嵌有HEK293细胞的三维胶原组织模拟物中。通过测量转染区域的外半径，并根据实验装置的计算模型推导出相应的电场强度，实现了可逆电穿孔（RE）阈值的成功量化，如图2所示。不可逆电穿孔（IRE）阈值则通过测量转染区域的内半径进行类似量化。图3A-C展示了使用双极微秒级脉冲电场（PEF）的三种实验方案所获得的RE和IRE阈值（分别以白色和红色轮廓标出）。各方案采用“P-N-D”命名法描述波形的正向脉冲时长（P）、负向脉冲时长（N）以及两个组分之间的延迟时间（D）。每个波形重复施加多次以形成一个脉冲串，总通电时间约为100 µs（例如，2-1-1波形单次通电时间为3 µs，因此重复34次形成总通电时间为102 µs的脉冲串）。在其中一种处理中，每个脉冲串进行到一半时将P和N值互换，从而产生整体电荷中性的“脉冲串平衡”处理。所有处.......

讨论

通过该方法，无需在离散电压下测试多个样品即可确定可逆电穿孔和不可逆电穿孔的阈值。利用非均匀电场可基于模型中转染细胞的空间分布进行量化分析。然而，这种非均匀分布也存在局限性。首要问题是，本文所述的RE和IRE阈值分别对应成功转染和细胞死亡的阈值，可能并非电穿孔程度的直接测量结果。例如，部分细胞可能发生电穿孔，但其孔隙不足以实现转染；或部分细胞可能因基因过表达等非电穿孔相关现象而死亡。尽管这并不会显著影响电穿孔方案的转化应用 体内 由于分子摄取程度和治疗导致的细胞死亡是关注的指标，基础研究可能需要更高的精确度，而通过该模型结合其他检测方法（如钙黄绿素和碘化丙啶）可实现这一目标。^27,37此外，该模型仅能确定与特定方案相关的可逆电穿孔（RE）和不可逆电穿孔（IRE）阈值，而无法确定该方案的转染效率。然而，利用这些方法评估上述阈值范围，可确保在评估转染效率的实验中选择合适的电压参数，尤其 体内.

电极放置对于确保治疗的可重复性至关重要。如.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200056
1000 µL 移液器吸头	Fisher Scientific	13-811-164
15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-70C
200 µL 移液器吸头	Fisher Scientific	13-811-139
304 不锈钢钝头针头	McMaster Carr	75165A753
316 不锈钢管	McMaster Carr	89785K319
丙烯酸材料	McMaster Carr	8505K754
生物安全柜	Fisher Scientific	13-261-312
CAD 软件	Dassault Systems	SolidWorks
离心机	Nuaire	NU-C200R
电穿孔仪	Hbio	45-0662	本研究中使用了自行构建的装置和 BTX ECM 830 系统
EMEM 培养基	Fisher Scientific	MT10009CV	若使用 HEK293 以外的细胞系，此条件可能有所不同
康宁 Falcon 12 孔透明平底组织培养处理多孔细胞培养板（带盖）	Corning	353043	可使用任意 12 孔板，但在制造电极支架时需考虑孔的尺寸
胎牛血清（FBS）	Fisher Scientific	A5670701
光纤温度探针	Micronor Inc.	TS5-20MM-02
GFP 质粒	Aldeveron	gWiz-GFP
HEK293 细胞	ATCC	CRL-1573	可使用其他细胞系，只需确保使用正确的培养基
加热板	Thermoelectric Cooling America Corporation	AHP-301CPV
冰浴或冷藏珠浴	Fisher Scientific	10-876-001
图像分析软件	Leica	LAS X
培养箱	Fisher Scientific	15-015-2633
倒置荧光显微镜	Leica	DMi8
激光切割机	McMaster Carr	7344N11
青霉素-链霉素	Fisher Scientific	15140122
移液器套装	Fisher Scientific	14-388-100
仿真软件	COMSOL	COMSOL Multiphysics 6.2
T75 培养瓶	Fisher Scientific	156499
I 型牛胶原蛋白溶液	Advanced Biomatrix	5005	3 mg/mL