用于定量电穿孔阈值的高通量三维组织模型

Summary

该协议使用计算建模来量化可逆和不可逆的电穿孔阈值，使用转染细胞在三维组织模拟物中的空间分布，以对电穿孔方案进行高通量分析。

Abstract

电穿孔是一项很有前途的技术，利用电脉冲进行大分子递送和软组织消融，其应用包括下一代预防和癌症等遗传疾病的治疗。本研究展示了一种高通量的 3D 组织培养模型，用于量化给定电穿孔方案的可逆和不可逆电穿孔阈值。通过使用非均匀电场并分析转染细胞的空间分布，可以在单个样品中识别可逆和不可逆阈值，从而提高表征电穿孔方案的效率，特别是对于 体内 翻译。为了显示这种能力，使用环形和针式电极转染含有 HEK293 细胞的 3D 组织模拟物，以递送编码 GFP 的质粒。然后根据转染样品的荧光显微镜图像得出电穿孔阈值。该模型显示出用作电穿孔方案高通量评估手段的潜力，这是与当前评估这些阈值的方法相比的一个关键优势，这些阈值往往耗时且不太能代表 体内 条件。

Introduction

可逆电穿孔（RE）是一种行之有效的方法，用于将各种通常不渗透膜的化合物和分子递送^{到细胞中1,2,3}。在这里，脉冲电场 （PEF） 用于实现临界电场强度，沿着细胞膜的某些部分诱导瞬态的局部纳米孔。RE 已被用于递送各种分子和化合物，从染料和核酸到化疗药物和其他药物 4,5,6,7,8,9,10。然而，如果电场强度充分增加，它可以满足更高的临界阈值，这会导致细胞活力迅速下降^1,2,11,12。该过程称为不可逆电穿孔 （IRE），已被研究用于软组织消融，包括作为其他无法手术的肿瘤和心律失常的治疗 11,12,13,14,15,16。为了了解治疗结果并为未来的治疗提供信息，量化这些 RE 和 IRE 阈值是电穿孔研究中的常见做法 12,17,18,19,20。然而，RE 和 IRE 阈值因许多因素而异，包括细胞类型、施加的电压、脉冲持续时间、脉冲数量和脉冲传递速率 ^{1,17,18,21,22}。

电穿孔方案具有许多参数，这些参数会导致不同的RE和IRE阈值^{1,17,18,21,22}。长期以来，人们一直在研究最佳治疗电压和波形。大多数市售电穿孔技术都使用单极PEF的方案，量程约为100μs-10ms23。虽然这些方案取得了临床相关的结果，但它们在体内诱导强烈的肌肉收缩 24,25,26。正因为如此，减轻这种刺激的较短的双极微秒脉冲已成为^{最近感兴趣的}话题^1,11,24。然而，这些脉冲引入了影响RE和IRE阈值的新因素，包括脉冲对称性，突发持续时间和温度依赖性1,17,22,27。此外，细胞类型和组织特性也被证明对RE和IRE结果有显着影响19,28,29。随着该领域的不断发展，需要进一步表征这些因素及其相互相互作用以及其他可能的环境因素如何影响RE和IRE阈值，因此越来越有必要提高实验效率以实现更高通量的实验。

典型的体外电穿孔实验通过在具有平行导电板的比色皿中处理细胞来测试方案，这导致在处理期间在比色皿内均匀分布电场19,30,31,32,33,34。如前所述，有必要确定方案的 RE 和/或 IRE 阈值，以确定给定治疗的最佳施加电压。为了在比色皿研究中实现这一点，必须处理多个比色皿，每个比色皿都施加离散的电压。这需要大量样品，必须分别制备、处理和分析，从而限制了实验通量。为了改进这一过程，已经开发了2D^35,36和3D 13,20,27,37,38,39培养模型，以使用产生不均匀场分布的电极来评估单个样品中的连续场强13,20,27,37^，38,39.然后从电场分布 ^{13,20,27,37,38} 的计算模型中推导出 RE 和 IRE 阈值。这大大减少了所需的样品数量，从而实现了更高通量的阈值定量方法。

本文旨在在3D 体外 模型中展示这种用于RE和IRE现场定量的方法，以证明其作为在多种环境（例如，细胞类型，治疗参数，要递送的分子）中有效评估电穿孔方案的一种手段的潜力。

Protocol

本研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。

1.细胞制备

1. 在生物安全柜中，将 1 × 10^{个 5} 个细胞/mL 细胞系 HEK293 接种，每个组织培养 T75 烧瓶的体积为 10 mL，置于 Eagle's Minimum Essential 培养基中，补充有 10% （v/v） 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素。
2. 将HEK293细胞在37°C的加湿培养箱中孵育，并采用5%CO₂ 环境。
3. 接种后 2 天，通过去除培养基并用 4 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 处理细胞来收获细胞进行实验。
4. 将细胞和胰蛋白酶在37°C的加湿培养箱中以5%CO₂ 环境孵育3-5分钟，或直到细胞从培养表面分离。
5. 通过加入 4 mL 培养基来灭活胰蛋白酶的酶活性。
6. 通过以 180 × g 离心 5 分钟来沉淀细胞，并重悬于培养基中至终浓度为 8 × 10⁶ 个细胞/mL。

2. 3D组织模型创建

注意：在这些步骤中使用反向移液以防止气泡进入混合物。

1. 在生物安全柜中，将制备的 8 ×^{10 6} 个细胞/mL 细胞悬液与 I 型牛胶原蛋白溶液 （3 mg/mL） 以 1：1 的比例彻底混合。放在冰上或冷珠浴中，以防止在处理混合物时过早聚合。
2. 移液 500 μL 组合溶液以包被 12 孔板的每个孔的底部。通过开始在孔中心分配溶液，然后轻轻向外螺旋，确保凝胶均匀地覆盖底部。
3. 轻轻旋转板，以确保凝胶的边缘接触孔壁。
4. 将凝胶在37°C的加湿培养箱中以5%CO₂ 环境孵育6小时，或直到凝胶变硬并且在倾斜板时不移动。
5. 倾斜孔板并轻轻地向每个孔中加入500μL培养基，使其在处理前至少1小时从板壁上滑下。凝胶应在创建后 48 小时内处理。

3. 电极制造

1. 拆下两个 1.64 mm 304 不锈钢钝头注射器针头上的塑料鲁尔连接。将一根针放在一边作为针电极。对于另一根针，将一端的最后 5 毫米压平。
2. 通过切割一段外径为 19 毫米的 316 不锈钢管来创建环形电极，该管的长度足以与孔板底部齐平。
3. 使用 CAD 软件设计一个电极支架，如 图 1 所示。确保支架有一个用于针式电极的中心孔、一个用于环形电极的凹槽以及一个与凹槽相交的孔，以便可以插入扁平的针头以形成压配合，将环形电极固定到位。
   1. 此外，确保支架有一个唇缘，设计为紧贴 12 孔板，并将环形和针式电极置于孔中的中心，以便电极和孔都为同轴³⁸。
4. 使用成熟的激光切割技术用亚克力制造电极支架⁴⁰.
5. 通过将环形和销状电极安装到电极支架中来组装电极。
6. 通过将一端扁平的针压入支架来固定环形电极。

4. 电穿孔处理3D组织模型

1. 在生物安全柜中，倾斜板并从每个孔中吸出 400 μL 培养基。注意不要接触凝胶。每个吸出孔中应保留 100 μL 培养基以保持凝胶水合。如果要吸出的液体少于 400 μL（移液器不留下液体/吸入空气），则添加 100 μL 培养基。
2. 通过倾斜板并将试剂添加到积聚在每个孔壁上的液体中，向这些抽吸孔中加入 20 μL 5 μg/μL GFP 质粒溶液（每孔总体积为 120 μL）。轻轻旋转以确保其均匀地涂抹在凝胶表面。
3. 将凝胶在37°C的加湿培养箱中以5%CO₂ 环境孵育10分钟。
4. 将光纤温度探头插入针式电极并开始读取温度。
5. 将电穿孔器的正极引线连接到针式电极，将负极引线连接到固定环形电极的针头。
6. 打开热板并加热凝胶，使其保持 37 °C 的温度。
7. 将带有光纤温度探头的环形和针式电极插入孔中。确保引脚垂直于板，并且两个电极都完全接触凝胶。
8. 确保凝胶处于 37 °C。
9. 提供电穿孔治疗。
10. 将 100 μL 培养基添加到任何看起来干燥的凝胶中。
11. 重复步骤 4.7-4.10。
12. 完成所有处理后，将凝胶在37°C的加湿培养箱中以5%CO₂ 环境孵育10分钟。
13. 倾斜孔板，轻轻地向每个孔中加入 500 μL 培养基，让其从孔板壁上滑下。
14. 将凝胶在37°C的加湿培养箱中以5%CO₂ 环境孵育24小时。

5. 清洗和成像

1. 倾斜板并从每个孔中吸出培养基。注意不要接触凝胶。
2. 倾斜板并轻轻地向每个孔中加入 500 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），让其沿板壁滑下。
3. 将凝胶在37°C的加湿培养箱中以5%CO₂ 环境孵育5分钟。
4. 倾斜板并从每个孔中吸出 PBS。注意不要接触凝胶。
5. 倾斜板并轻轻地向每个孔中加入 500 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS），让其沿板壁滑下。
6. 轻轻旋转板，倾斜板，然后从每个孔中吸出PBS。注意不要接触凝胶。
7. 加入 100 μL 新鲜 PBS 以保持凝胶水合以进行成像。
8. 使用标准荧光显微镜技术的图像板。这应该产生具有明显绿色环面形区域的凝胶图像，其中可逆和不可逆电场阈值分别结合该区域的外边缘和内边缘。
9. 倾斜孔板，轻轻地向每个孔中加入 500 μL 培养基，让其从孔板壁上滑下。
10. 将凝胶在37°C的加湿培养箱中以5%CO₂ 环境孵育24小时。
11. 对每个时间点重复步骤 5.1-5.10。

6. 计算模型创建

1. 打开物理模拟软件并创建一个新的 2D 轴对称模型，该模型利用电流、固体中的传热和电磁加热物理。
2. 为实验装置的环形和针式电极、凝胶和孔板的电压、环境温度、热板温度、温度设定点、脉冲输送速率、集成电剂量以及尺寸创建参数。
3. 创建表示环形和针式电极、凝胶和实验装置孔板的径向横截面的域几何形状，如 图 2A 所示。
4. 在凝胶高度的一半处将探针点放置在中心电极内，以表示体外实验期间使用的光纤温度探针。
5. 创建一个使用 temperature 作为其输入参数的分段函数。
6. 定义函数，当温度低于步骤 6.2 中定义的温度设定点参数时，其值为 1，否则为 0。
7. 将电压边界条件应用于表示引脚电极的域几何的最顶层表面，并将电压值设置为步骤 6.2 中定义的电压参数，乘以步骤 6.6 中的分段函数，该函数在步骤 6.4 中创建的探针点温度下计算。
8. 将“地面”边界条件应用于表示环形电极的域几何的最顶层曲面。
9. 将“电气绝缘”边界条件应用于所有剩余的域边界。
10. 创建一个使用温度的连续函数。
11. 使用胶原蛋白凝胶的温度依赖性电导率的既定模型²⁷ 将函数定义为0.8277 + 0.0323 * T。
12. 定义自定义材料并将电导率设置为步骤 6.11 中定义的连续函数。将这种材料应用于凝胶结构域。
13. 定义材料或使用软件默认值（如果可用）将 304 和 316 不锈钢材料分别分配给引脚和环形电极域，并将聚苯乙烯分配给孔板域。
14. 将温度边界条件应用于模型的底部，并将温度值设置为 37 °C。
15. 将表面环境辐射边界条件应用于不与另一个域界面的所有其他域边，并将发射率设置为 0.97、0.9 和 0.075，具体取决于域是板、凝胶还是电极的一部分，²⁷。
16. 向模型添加自由三角形网格。将元素大小设置为“精细”。
17. 如果评估各种参数级别，请创建一个参数扫描，其中列出要计算参数的所有值。
18. 单击“ 计算” 按钮运行模拟。
19. 完成后，在“结果”部分创建电场的二维切割线图。
20. 定义从针电极穿过凝胶结构域中间到环形电极的切割线。这应该会导致从针电极边缘到环形电极边缘的指数衰减。
21. 将绘图数据导出为.csv或.xlsx文件以创建查找表。

7. 阈值推导

1. 使用显微镜的软件，沿垂直轴和水平轴测量环面区域的外边缘和内边缘的直径。如果软件没有此功能，请使用 ImageJ 来执行此作。
2. 分别对外径和内径进行平均，然后除以 2 以计算环面形区域的外径和内径。外半径表示 RE 阈值。内半径表示 IRE 阈值。
3. 使用在步骤6.21中创建的查找表，推导出测量半径处的电场强度。

Results

环形和针状电极成功地将编码绿色荧光蛋白 （GFP） 的 DNA 质粒递送到嵌入 HEK293 细胞的 3D 胶原组织模拟物中。通过测量转染区域的外半径并从实验装置的计算模型中推导出相应的场强度，成功实现了RE阈值量化，如图2所示。通过测量转染区域的内半径，同样量化IRE阈值。图3A-C突出显示了使用双极微秒PEF的三种方案的RE和IRE阈值（分别以白色和红色显示）。协议使用“PND”符号来描述波形的正脉冲 （P） 和负 （N） 脉冲持续时间以及这两个分量之间的延迟 （D）。每个波形被多次传递以产生一个突发，这构成大约 100 μs 的导通时间（例如，2-1-1 波形有 3 μs 的导通时间，因此重复 34 次以产生具有 102 μs 导通时间的突发）。对于一种处理，P 和 N 值在每次爆发的中途反转，以创建总体电荷中性的“爆发平衡”处理。所有处理都包括以大约 2 Hz 的 50 次突发，...

Discussion

使用这种方法，可以识别可逆和不可逆的电穿孔阈值，而无需在离散电压下测试多个样品。使用非均匀电场可以根据模型中转染细胞的空间分布进行定量。然而，这种不均匀分布存在局限性。首先，本文描述的RE和IRE阈值分别是成功转染和细胞死亡的阈值，这可能不是电穿孔程度的直接测量。例如，一些细胞可能被电穿孔，但孔隙不足以进行转染，或者一些细胞可能死于基因过表达等非电穿孔现象。虽然这不会显着影响电穿孔方案在体内的转化方式，但由于处理引起的分子摄取程度和细胞死亡是感兴趣的指标，基础研究可能需要更高的精度，这可以通过使用其他测定方法（如钙黄绿素和碘化丙啶^{）来完成27,37}.此外，该模型仅识别与给定方案相关的 RE 和 IRE 阈值，而不是方案的转染效率。然而，使用这些方法来评估这些界限可以确保为评估转染效率的实验选择适当的电压，尤其是在体内。

电极放置对于确保治疗的可复制性至关重要。如果...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	吉布科	25200056
1000 uL 移液器吸头	费雪科学	13-811-164
15 mL锥形管	费雪科学	14-959-70C
200 uL 移液器吸头	费雪科学	13-811-139
304不锈钢钝头针	麦克马斯特·卡尔	75165A753
316不锈钢管	麦克马斯特·卡尔	89785K319
丙烯酸	麦克马斯特·卡尔	8505K754
生物安全柜	费雪科学	13-261-312
CAD软件	达索系统	固体工厂
离心机	努艾尔	NU-C200R
电穿孔器	Hbio 公司	45-0662	本研究使用了定制设备和 BTX ECM 830 系统
埃梅姆	费雪科学	MT10009CV	这可能会有所不同 如果使用 HEK293 以外的细胞系
Falcon 12 孔透明平底 TC 处理多孔细胞培养板，带盖	康宁	353043	可以使用任何 12 孔板，只需确保在制造电极支架时考虑孔尺寸即可。
FBS的	费雪科学	A5670701
光纤温度探头	Micronor 公司	TS5-20MM-02型
GFP-质粒	奥尔德弗伦	gWiz-GFP
HEK293 细胞	ATCC	CRL-1573型	可以使用其他细胞系，只需确保使用正确的培养基即可
热板	热电冷却美国公司	AHP-301CPV
冰或冷藏珠浴	费雪科学	10-876-001
图像分析软件	徕卡	拉斯 X
孵化器	费雪科学	15-015-2633
倒置荧光显微镜	徕卡	DMi8
激光切割机	麦克马斯特·卡尔	7344N11
青霉素-链霉素	费雪科学	15140122
移液器套件	费雪科学	14-388-100
仿真软件	康索尔	COMSOL Multiphysics 6.2
T75 烧瓶	费雪科学	156499
I 型牛胶原蛋白溶液	先进的生物基质	5005	3 毫克/毫升