从食物废弃物中可持续生产生物塑料的可扩展逐步方法

摘要

本方案介绍了一种将食物废弃物转化为可生物降解的聚羟基脂肪酸酯（PHA）生物塑料的可扩展方法。该方法利用受控的厌氧消化进行食物废弃物预处理，采用嗜盐微生物发酵合成PHA，并通过无化学试剂的下游工艺实现PHA的回收。

摘要

全球微塑料危机与日益严峻的食物废弃物处理难题亟需创新性解决方案，以协同应对这些环境问题。聚羟基脂肪酸酯（PHAs）是一类独特的生物塑料，可在包括海洋生态系统在内的所有环境中完全生物降解，为石油基塑料提供了可持续的替代选择。同时，利用食物废弃物作为原料生产PHA，不仅有效缓解了食物废弃物处理的挑战，还可生成高附加值的可生物降解塑料。本研究提供了一套从食物废弃物中生产PHA的分步实验方案，重点强调为确保细胞内PHA含量与质量所需的关键操作要点。该过程始于抑制性厌氧消化，通过维持厌氧环境并优化固体停留时间等参数，将食物废弃物转化为微生物可同化的挥发性脂肪酸（VFA），以最大化VFA产量，而VFA是PHA合成的关键前体。随后，利用富含VFA的消化液培养 Haloflex mediterranei，一种嗜盐微生物，可积累高达其干重66% ± 5%的聚羟基烷酸酯（PHA）。该微生物在高盐度培养环境中生长。 H. mediterranei 防止了培养污染，确保PHA的高效生产。通过测定光密度监测细胞生长，以确定PHA收获的最佳时机。采用无化学试剂、以水为基础并利用渗透压差的方法裂解细胞，实现93% ± 3%的PHA回收率，随后通过溶剂法纯化PHA，获得纯度达96% ± 2%的产物。每一步骤均对生产高质量、可生物降解塑料至关重要。本文提供了阻断式厌氧消化、纯培养发酵、无化学试剂细胞裂解及溶剂法PHA纯化的详细方法，为将食物废弃物转化为适用于中试及大规模应用的可生物降解生物塑料，提供了一种可扩展且可持续的技术路径。

引言

塑料污染和食物废弃物处理日益成为重要的环境问题，凸显了通过可持续废弃物管理和材料开发来同时应对这两项挑战的创新方法的必要性¹。传统的石油基塑料是环境污染和微塑料污染的主要来源，在垃圾填埋场和水生生态系统中可存留数百年²。聚羟基脂肪酸酯（PHAs）是一类微生物合成的生物塑料，具有与传统塑料相当的力学性能，并可在自然环境中完全降解，是一种完全可生物降解的替代材料³。然而，PHAs较高的生产成本仍是其大规模商业化应用的主要障碍⁴。克服这一限制的一个有前景的途径是利用有机废弃物作为低成本的碳源用于微生物合成PHA，因为在当前依赖玉米淀粉或葡萄糖等纯碳源的工业生产过程中，原料成本约占总生产成本的50%⁵。通过废弃物资源化，该方法不仅可将有机废弃物从垃圾填埋场转移，还能将其转化为石油基塑料的可持续替代品，从而同时解决废弃物累积和塑料污染问题。

H. mediterranei 是一种嗜盐微生物，由于其能够在高盐环境（2–5 M NaCl）下生长，可有效抑制非嗜盐微生物的生长，从而避免污染，因此在利用废弃物衍生的原料进行聚羟基脂肪酸酯（PHA）生产方面展现出巨大潜力⁶。这种高盐环境消除了工业....

方案

1. 食物废弃物的收集与预处理

1. 如图1A所示，从当地餐馆收集厨余垃圾。通过目视评估所获得的垃圾。观察发现，这些垃圾主要由蔬菜皮、废弃的生肉以及富含碳水化合物的成分（如米饭和面条）组成。可能需要按照步骤5.1和5.2所述测量碳氮比（C:N），如果厨余垃圾以碳为主，则需进行调整，最佳C:N比约为20:1²⁸。
2. 将10 kg厨余垃圾放入一个5加仑的桶中，并加入2.5 L水。将搅拌机连接至电源。将刀头浸入厨余垃圾和水的混合物中，然后按下启动按钮开始搅拌。持续搅拌至少30分钟，直至完全均质化（图1B）。上下移动刀头，以确保厨余垃圾被充分搅拌。
   警告：为防止过热，每运行2分钟后需松开搅拌机的启动按钮，暂停1分钟。
3. 搅拌完成后，取出搅拌机，并用热水和洗洁精清洗。用盖子盖住桶，贴上标签注明样品名称和制备日期，若不立即使用，则在4 °C下储存。
   ​注意：由于从不同来源和时间收集的厨余垃圾性质存在差异，每次制备后应根据步骤5.1测量所得浆液的基本参数（如总固体含量（TS）和挥发性固体含量（VS）），以确保后续使用时TS和VS输入值的准确性。本方案中，4 °C用于短期储存（少于7天），-20 °C用于长期储存。

结果

食物废弃物特性及通过厌氧酸化发酵（aAD）生产挥发性脂肪酸
制备的食物废弃物浆液中总固体（TS）、挥发性固体（VS）及碳氮比（C:N）的示例如下所示 表1由于不同采样来源和时间点的食物垃圾成分存在固有差异，总固体（TS）、挥发性固体（VS）和碳氮比（C:N）的数值波动是预期之内的。尽管这种变异性在可接受范围内，但定期测定TS、VS和C:N比对于工艺监控、微生物平衡以及整个厌氧消化（aAD）系统的优化至关重要。³⁷.

挥发性脂肪酸（VFA）浓度是衡量aAD消化器运行稳定性和效率的关键指标。表3列出了四个运行周期的VFA数据作为示例。在这些周期中，VFA浓度稳定在4.13 ± 0.05 g HAc/L，证实aAD发酵罐能够持续稳定地生成VFA。该数值与文献报道的结果相当²²，表明中试规模的aAD系统运行成功。甲烷产量占总沼气的6% ± 3.3%，远低于传统厌氧消化中通常观察到的>.......

讨论

从厌氧酸化过程（aAD）中生产挥发性脂肪酸（VFA）
VFA 作为 H. mediterranei 将厨余废物转化为聚羟基脂肪酸酯（PHA）的关键前体，发挥着至关重要的作用。因此，在厌氧酸化过程中维持较高的 VFA 浓度至关重要。可通过多种策略提高厌氧酸化过程中的 VFA 产量²⁵。其中一种有效方法是优化污泥停留时间（SRT），理想时长为 8 天或更短，这有助于淘汰产甲烷菌，同时最大化水解和产酸作用，从而防止 VFA 被过度消耗⁴⁶。另一种有效策略是温度调控，嗜热条件（45–55 °C）可促进底物溶出和产酸作用，相比中温条件能获得更高的 VFA 生产效率⁴⁷。此外，添加化学抑制剂（如 2-溴乙烷磺酸钠）或在 pH 4 条件下进行短期 pH 冲击，可通过靶向关键微生物代谢途径或广泛抑制产甲烷活性，有效抑制产甲烷过程，减少 VFA 损失，确保 VFA 高效积累^46,<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
空气	Airgas	AI UZ300	用于气相色谱操作
空气泵	Cloudray	Hailea ACO-009D
氯化铵	Acros Organics	A0396560
高压灭菌器	STERIS	AMSCO Lab 250	用于ATCC培养基制备
天平	METTLER TOLEDO	ME204TE/00
搅拌器	VEVOR	IB750LV+BLD300+WB-1
桶	Lowe's	型号 50640	5加仑无BPA塑料通用桶
二水氯化钙	Acros Organics	A0362932
氯仿	Millipore Sigma	C2432
干燥器			任何可用于TS、VS、VSS测定的类型
带螺帽和PTFE内衬的消解管	Millipore Sigma	CLS982613
数字反应块	Hach公司	DRB200	用于Hach VFA定量方法
数字搅拌器	SCILOGEX	SCI550-Pro
碟片离心机	Alfa Laval公司	Clara 20
锥形瓶	Amazon	B07V3JPQMM
乙醇	Amazon	B09DGVL4ML
冷冻干燥机	Labconco	10030133、1027319 和 0109621	FreeZone 2.5升冷冻干燥系统
通风橱	Kewaunee Scientific Corporation	Supreme Air LV
炉子	Thermo Scientific	型号 F30428C
气相色谱（GC）	Agilent	型号 8890
Haloferax mediterranei	ATCC	33500
氢气	Airgas	HY UHP300	用于气相色谱操作
刀具			任何用于切割食物废弃物的类型
润滑油	Fisher Scientific Company	NC9844626
六水氯化镁	Fisher Scientific Company	BP214-500
七水硫酸镁	Millipore Sigma	M1880
甲醇	Millipore Sigma	34860
苯甲酸甲酯	Millipore Sigma	93583	用作PHA定量中的内标物
酶标仪	BioTek Synergy	Synergy H1
氮气	Airgas	NI UHP300	用于气相色谱操作
烘箱	Thermo Scientific	OMH750
蠕动泵	Simply Pumps Inc.	PM6000 AC	高流量、自吸式泵，具有优异的干运行能力，可处理高颗粒含量的浆料，适用于内径1/8英寸的管路。
pH计	Fisher Scientific Company	AE150
PHA标准品	Millipore Sigma	403105
中试aAD消化器	Quasar能源集团，美国俄亥俄州独立市	总容积100 L、工作容积80 L的不锈钢发酵罐
中试PHA发酵罐	manukatree	SF-50l ISO 9001 CE	双层夹套玻璃反应器
氯化钾	G-BIOSCIENCES	162006
泵用管路			任何品牌的硅胶管，内径1/8英寸，外径3/8英寸
碳酸氢钠	Fisher Chemical	241787
溴化钠	Carolina	21139-45
氯化钠	Amazon	B0787CFHF3
氢氧化钠颗粒	Fisher Bioreagents	236088
次氯酸钠	Millipore Sigma	425044
Sorvall LYNX 4000超高速离心机	Thermo Scientific	75006580	用于下游PHA回收过程中的PHA颗粒收集
分光光度计	Hach公司	DR3900	用于Hach VFA定量方法
硫酸	Millipore Sigma	258105
注射器滤器	Amazon	B06X6GTKVY
总有机碳分析仪（TOC analyzer）	Shimadzu	型号 TOC-LCSN
挥发性酸TNTplus试剂管测试	Hach公司	TNT 872	可测定50–2,500 mg/L乙酸范围内的VFA。
热水器	Bosch Inc.	Tronic 3000 T 7加仑（ES8）
酵母提取物	Fisher Scientific Company	AAJ6028736