为了评估新的干细胞疗法，重要的是能够以非侵入性方式在活体内追踪注射的细胞。本视频将向您展示如何在活体内用基于氧化铁的对比剂标记人类间充质干细胞和胚胎干细胞，以便随后进行活体磁共振成像。
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摘要
摘要
近年来，干细胞研究加深了我们对发育生物学、多种疾病以及其在再生医学中潜在影响的理解。一种能够无创地在活体内重复监测移植干细胞的方法，将极大提升我们解析调控干细胞死亡的机制，并识别有助于改善干细胞植入的营养因子和信号通路的能力。磁共振成像（MR imaging）已被证实是一种可在活体内以接近显微解剖分辨率显示干细胞的有效工具。为了利用磁共振成像检测干细胞，必须使用细胞特异性的磁共振对比剂对细胞进行标记。为此，通常应用氧化铁纳米颗粒，例如超顺磁性氧化铁颗粒（SPIO），因其具有高细胞检测灵敏度和优异的生物相容性。SPIO颗粒由氧化铁核心及右旋糖酐、羧基右旋糖酐或淀粉包被层组成，其作用机制是引起局部磁场不均匀性，从而导致T2加权磁共振图像上的信号降低。本视频将展示利用临床上可用的磁共振对比剂对干细胞进行标记的技术，以便后续通过磁共振成像对标记细胞进行无创的活体追踪。
关键词：干细胞研究，发育生物学，再生医学，无创监测，活体成像，磁共振成像，MR，干细胞追踪，氧化铁纳米颗粒，超顺磁性氧化铁颗粒，SPIO，细胞标记，对比剂，T2加权成像，信号降低，生物相容性，磁场不均匀性
方案
使用 Ferucarbotran 标记 hMSC
这是一种利用基于氧化铁的磁共振成像对比剂Ferucarbotran标记人源间充质干细胞的技术：
- 首先，在标记操作前18-24小时，将细胞以80%融合度接种于T75培养瓶中。若使用其他培养皿，则相当于每平方厘米约10000个细胞2.
- 第二天，通过将30 µl Resovist加入8 ml无血清培养基中来制备标记培养基。该培养基可用于标记一个75 cm²培养瓶中80%融合度的细胞，对应铁浓度为100 µg Fe/ml培养基。
- 吸除培养基，用 PBS 或无血清培养基洗涤细胞一次。此步骤旨在去除可能结合对比剂并影响标记效率的残留血清蛋白及其他培养基成分。
- 将标记培养基加入培养瓶中，并将培养瓶放回培养箱。
- 2小时后，加入2 ml FCS，使FCS终浓度达到20%。此步骤旨在确保细胞不会受到诱导分化的刺激，而是在其熟悉的环境中继续生长。
- 孵育细胞超过18小时，最好过夜进行。
- 第二天，用 PBS 清洗细胞，然后按照常规方法进行胰蛋白酶消化。
- 消化后，细胞悬液需用PBS洗涤3次，以去除培养基中残留的游离对比剂。每次洗涤均通过离心完成。 400 rcf 离心 5 分钟。
- 最终的细胞沉淀可重新悬浮，并可用于后续....
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讨论
非侵入性地显示干细胞对于监测几乎所有基于干细胞的治疗至关重要。通过磁共振图像可视化标记干细胞的体内动力学特征，有助于更深入地理解其行为，从而为合理且更有效地应用干细胞疗法提供指导。由于我们采用的是临床适用的对比剂和成像技术，所展示的实验方案可直接转化应用于患者。本方法潜在的临床应用包括对不同类型干细胞或基因工程改造干细胞的移植过程进行比较研究，以及评估治疗干预对干细胞移植效果的影响。这些结果将立即有助于干细胞疗法的临床前评估、相关临床试验的设计，以及后续在临床实践中对干细胞治疗效果的评价。值得注意的是，我们的成像技术同样适用于其他干细胞群体，例如造血干细胞或神经干细胞。
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致谢
本项目获得了加州再生医学研究所Leon J. Thal种子基金的资助。Tobias Henning获得了德国研究基金会（DFG，HE 4578/1-2）的研究奖学金支持。我们衷心感谢Juanito Meneses在人类胚胎干细胞培养方面提供的建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| D-MEM 高糖 | 试剂 | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| 明胶 | 试剂 | Sigma-Aldrich | G1890 | 用 PBS 稀释明胶至终浓度为 0.1 % |
| PBS（无钙镁离子） | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | 试剂 | Invitrogen | 25300-120 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | 试剂 | Invitrogen | 25200-114 | |
| 经鉴定的胎牛血清（FBS） | 试剂 | Hyclone | SH30071.03 | |
| 细胞滤网（40 μm 尼龙） | 工具 | BD Biosciences | 352340 | |
| Knockout DMEM | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout 血清替代物 | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-巯基乙醇（b-Mercapt–thanol） | 试剂 | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| 非必需氨基酸 | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | 试剂 | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| 谷氨酰胺 | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| 青霉素/链霉素 | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Ferumoxides (Endorem) | 试剂 | Guerbet | ||
| Ferucarbotran (Resovist®) | 试剂 | Bayer AG |
参考文献
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents. 228, 760-767 (2003).
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J.
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