使用氧化铁纳米颗粒标记人胚胎干细胞和人骨髓间充质干细胞以实现磁共振成像无创体内示踪

摘要

为了评估新的干细胞疗法，重要的是能够以非侵入性方式在活体内追踪注射的细胞。本视频将向您展示如何在活体内用基于氧化铁的对比剂标记人类间充质干细胞和胚胎干细胞，以便随后进行活体磁共振成像。

摘要

近年来，干细胞研究加深了我们对发育生物学、多种疾病以及其在再生医学中潜在影响的理解。一种能够无创地在活体内重复监测移植干细胞的方法，将极大提升我们解析调控干细胞死亡的机制，并识别有助于改善干细胞植入的营养因子和信号通路的能力。磁共振成像（MR imaging）已被证实是一种可在活体内以接近显微解剖分辨率显示干细胞的有效工具。为了利用磁共振成像检测干细胞，必须使用细胞特异性的磁共振对比剂对细胞进行标记。为此，通常应用氧化铁纳米颗粒，例如超顺磁性氧化铁颗粒（SPIO），因其具有高细胞检测灵敏度和优异的生物相容性。SPIO颗粒由氧化铁核心及右旋糖酐、羧基右旋糖酐或淀粉包被层组成，其作用机制是引起局部磁场不均匀性，从而导致T2加权磁共振图像上的信号降低。本视频将展示利用临床上可用的磁共振对比剂对干细胞进行标记的技术，以便后续通过磁共振成像对标记细胞进行无创的活体追踪。 关键词：干细胞研究，发育生物学，再生医学，无创监测，活体成像，磁共振成像，MR，干细胞追踪，氧化铁纳米颗粒，超顺磁性氧化铁颗粒，SPIO，细胞标记，对比剂，T2加权成像，信号降低，生物相容性，磁场不均匀性

方案

使用 Ferucarbotran 标记 hMSC

这是一种利用基于氧化铁的磁共振成像对比剂Ferucarbotran标记人源间充质干细胞的技术：

1. 首先，在标记操作前18-24小时，将细胞以80%融合度接种于T75培养瓶中。若使用其他培养皿，则相当于每平方厘米约10000个细胞².
2. 第二天，通过将30 µl Resovist加入8 ml无血清培养基中来制备标记培养基。该培养基可用于标记一个75 cm²培养瓶中80%融合度的细胞，对应铁浓度为100 µg Fe/ml培养基。
3. 吸除培养基，用 PBS 或无血清培养基洗涤细胞一次。此步骤旨在去除可能结合对比剂并影响标记效率的残留血清蛋白及其他培养基成分。
4. 将标记培养基加入培养瓶中，并将培养瓶放回培养箱。
5. 2小时后，加入2 ml FCS，使FCS终浓度达到20%。此步骤旨在确保细胞不会受到诱导分化的刺激，而是在其熟悉的环境中继续生长。
6. 孵育细胞超过18小时，最好过夜进行。
7. 第二天，用 PBS 清洗细胞，然后按照常规方法进行胰蛋白酶消化。
8. 消化后，细胞悬液需用PBS洗涤3次，以去除培养基中残留的游离对比剂。每次洗涤均通过离心完成。 400 rcf 离心 5 分钟。
9. 最终的细胞沉淀可重新悬浮，并可用于后续实验。
10. 此时对细胞进行计数，因为在之前的洗涤步骤中可能已损失部分细胞。同时使用台盼蓝排染法进行细胞活力检测，并取样进行分光光度分析以测定标记效率。

使用 Ferumoxides 标记人类胚胎干细胞

1. 首先，按照常规方法将人胚胎干细胞（hESC）接种于10 cm培养皿中。这些培养皿预先包被了明胶，并含有经辐照的饲养层细胞。本方案也可用于无饲养层的培养体系。
2. 让hESC贴壁并生长约3–4天，使其形成中等大小的克隆。在此期间，需注意避免克隆过度生长，因为较大的克隆后续更难有效分散。
3. 分化细胞可能污染这些培养物，因此根据克隆的纯净程度， 可能需要通过显微解剖方式去除已分化的细胞区域。
4. 配制标记培养基，其中包含浓度为100 µg/mL的Ferumoxides和完全hESC培养基。具体操作为：将89 µL Ferumoxides与10 mL完全生长培养基混合。
5. 用完全培养基洗涤培养皿一次。
6. 每皿加入10 mL标记培养基，于培养箱中孵育4小时。
7. 此时，标记过程已完成。下一步需洗涤细胞，并获得单细胞悬液以供后续使用。首先用PBS洗涤培养皿一次。
8. 随后，将PBS替换为5 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，在培养箱中孵育5分钟，或直至细胞完全脱落。孵育过程中可频繁轻敲培养皿以促进细胞脱落。
9. 细胞现已脱落。需注意，若原培养皿中存在较大克隆，则可能仍有少量细胞团块残留。
10. 为去除这些团块，可用移液管将整个悬液轻轻吹打混合一次，然后静置2分钟。
11. 我们不使用移液枪（Eppendorf pipette），因为反复通过细小枪头吸取细胞可能导致细胞膜破裂。
12. 若仍有残留团块，可将细胞悬液通过40 µm细胞滤网过滤。
13. 若操作正确，此时应获得单细胞悬液，其中混有较多碎片，这些碎片来源于明胶包被层、ESC基质以及死亡细胞。为去除碎片，需将细胞以400 rcf离心5分钟，洗涤两次，并每次重新悬浮于完全培养基中。
14. 接下来，需将ESC与经辐照的饲养层细胞分离。可通过将细胞悬液接种至明胶包被的培养皿中高效实现此步骤。
15. 若不扰动培养皿，所有细胞均会沉降，但饲养层细胞贴壁速度比ESC更快。
16. 因此，在45分钟后收集上清液，其中应主要含有ESC，而饲养层细胞则大多已贴附于培养皿底部。
17. 通过此方法，可获得磁性标记的人胚胎干细胞单细胞悬液，可用于后续实验。
18. 与前述方案相同，此时需对细胞进行计数，并取样以评估细胞活力及标记效率。

 

讨论

非侵入性地显示干细胞对于监测几乎所有基于干细胞的治疗至关重要。通过磁共振图像可视化标记干细胞的体内动力学特征，有助于更深入地理解其行为，从而为合理且更有效地应用干细胞疗法提供指导。由于我们采用的是临床适用的对比剂和成像技术，所展示的实验方案可直接转化应用于患者。本方法潜在的临床应用包括对不同类型干细胞或基因工程改造干细胞的移植过程进行比较研究，以及评估治疗干预对干细胞移植效果的影响。这些结果将立即有助于干细胞疗法的临床前评估、相关临床试验的设计，以及后续在临床实践中对干细胞治疗效果的评价。值得注意的是，我们的成像技术同样适用于其他干细胞群体，例如造血干细胞或神经干细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
D-MEM 高糖	试剂	Sigma-Aldrich	D5648
明胶	试剂	Sigma-Aldrich	G1890	用 PBS 稀释明胶至终浓度为 0.1 %
PBS（无钙镁离子）	试剂	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	试剂	Invitrogen	25300-120
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	试剂	Invitrogen	25200-114
经鉴定的胎牛血清（FBS）	试剂	Hyclone	SH30071.03
细胞滤网（40 μm 尼龙）	工具	BD Biosciences	352340
Knockout DMEM	试剂	GIBCO, by Life Technologies	10829018
Knockout 血清替代物	试剂	GIBCO, by Life Technologies	10828028
b-巯基乙醇（b-Mercapt–thanol）	试剂	Sigma-Aldrich	7522
非必需氨基酸	试剂	GIBCO, by Life Technologies	11140050
FGF-2	试剂	R&D Systems	233-FB-025
谷氨酰胺	试剂	GIBCO, by Life Technologies	25030081
青霉素/链霉素	试剂	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Ferumoxides (Endorem)	试剂	Guerbet
Ferucarbotran (Resovist®)	试剂	Bayer AG