Mycoplasma pneumoniae 核酸及耐药基因的检测

摘要

本方案提供了一种快速且可靠的检测Mycoplasma pneumoniae感染及鉴定抗生素耐药性的方法。该方法有助于临床医生更快地选择合适的治疗方案，改善肺炎患者的诊疗效果，并促进抗生素的合理使用

摘要

Mycoplasma pneumoniae（Mp）是导致儿童社区获得性肺炎（CAP）最常见的病原体之一。检测Mycoplasma pneumoniae耐药基因可为MP感染的精准临床诊断与治疗提供有力的技术支持和理论依据。准确诊断Mp感染并评估其耐药性对临床治疗至关重要。常见的Mycoplasma pneumoniae检测方法包括培养、抗体检测以及基于分子生物学的检测技术。Mp培养是诊断的金标准，但需要特定培养基，耗时较长且敏感性较低。基于抗体的Mp检测应用广泛，但在感染早期可能出现假阴性结果。基于分子生物学的检测具有快速、污染风险低、敏感性高、特异性强等优点，且不受采样时间或免疫状态限制，因此已被公认为诊断Mycoplasma pneumoniae感染的新型金标准。大环内酯类药物是儿童Mp感染的首选治疗药物。然而，随着大环内酯类药物在儿童呼吸道感染中的广泛使用，耐药Mycoplasma pneumoniae感染的发生率逐年上升。与敏感株感染者相比，耐药株感染者发热持续时间显著延长，住院时间更久，用药后仍持续发热。目前已发现的突变位点包括2063、2064、2067和2617。在中国，仅在2063和2064位点检出点突变，其中2063位点A-to-G替换最为常见。针对这些位点，已采用聚合酶链式反应（PCR）结合荧光探针技术，对人痰液样本中的Mycoplasma pneumoniae核酸及其耐药突变进行检测。检测Mycoplasma pneumoniae耐药基因为Mp感染的准确诊断和有效治疗提供了重要的技术支撑和理论基础。

引言

Mycoplasma pneumoniae（Mp）是能够独立生存的最小致病微生物，处于细菌与病毒之间的中间位置。它主要通过呼吸道飞沫或气溶胶传播，是儿童社区获得性肺炎（CAP）中第二常见的病原体¹，占所有CAP病例的20%至40%²。由于Mp缺乏细胞壁，而β-内酰胺类抗生素（如青霉素和头孢菌素）的作用靶点正是通过抑制细胞壁合成来杀菌，因此Mp对这类抗生素具有天然耐药性。Mp感染的主要治疗药物包括抑制蛋白质合成的药物，如大环内酯类和四环素类，以及抑制DNA复制的药物，如四环素类和氟喹诺酮类^3,4,5。因此，Mp的及时实验室检出对于指导抗生素的合理使用至关重要。目前用于Mp的实验室检测方法包括分离培养、抗原检测、抗体检测以及分子诊断技术。

作为一种传统的检测方法，分离培养至今仍是诊断肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）感染的金标准。Kashyap 等人观察到，从咽拭子或痰液标本中培养肺炎支原体（Mp）是一种可靠的诊断技术⁶。然而，该方法面临诸多挑战，例如 Mp 对培养条件要求严格、培养周期长以及通常....

方案

所有研究方案均经河源市人民医院医学伦理委员会审查并批准（批准号：YXYJLL-LW2025001）。所有患者在参与前均签署了书面知情同意书。

1. 标本采集

注意：在样品采集过程中需谨慎保持无菌操作技术。

1. 采集患者或疑似患者的痰标本。应在患者发病后3天内获取样本。
2. 指导患者用水漱口，深吸气，屏气5秒，然后缓慢呼气。
3. 要求患者再次深呼气，尽力咳出痰液，将其放入指定的塑料杯中，并盖紧盖子。痰标本应尽快在室温（RT）下送至临床实验室。样本应储存于2-8 °C的冰箱中。

2. 扩增试剂的制备

1. 在PCR实验室的试剂准备区，从-20 °C冰箱中取出试剂盒中的缓冲液、引物探针和水，置于4 °C条件下解冻。取出酶组分，轻轻振荡混匀，然后在1,006 × g 条件下离心10秒。
2. 取一支无菌无核酸酶的离心管，做好标记，并按照表1所示为每个个体配制反应体系。PCR反应总数应等于样本数加上一份弱阳性质量控制样本、一份质量控制产物W以及一份阴性提取对照。
3. 计算各试剂所需用量，加入适当规格的离心管中，充分混匀后短暂低速离心。将20 µL试剂分装至每支PCR反应管中，并转移至样本处理区域。

结果

在痰液样本经过液化、核酸提取及荧光PCR扩增后，根据扩增曲线的分析结果，对基线的起始值（Start value）、终止值（End value）和阈值（Threshold value）进行了调整。起始值设为3，终止值设为20。

本实验的代表性结果为肺炎支原体核酸阳性，且在2063或2064位点发生A:G耐药突变，提示存在肺炎支原体感染及其对大环内酯类抗生素的耐药性。

质控品W的扩增曲线校准后应保持在阈值线以下。阴性对照的目标基因为FAM荧光Ct > 35.33，VIC荧光Ct > 35.01。质控品W的目标基因为FAM荧光Ct > 35.33，VIC荧光Ct > 35.01。弱阳性质控品中FAM荧光和VIC荧光的Ct值范围为29.00至34.00。关于Mp及耐药基因的结果如下：阴性对照目标基因FAM荧光Ct &.......

讨论

与血清学方法相比，PCR 及其衍生技术在Mycoplasma pneumoniae（MP）的鉴定、分型及耐药性检测方面表现出更高的敏感性和特异性。此外，基于 PCR 的技术操作简便、成本较低，使其成为常规临床诊断的可行替代方案³⁶。MP 是社区获得性肺炎（CAP）的重要病原体，具有较高的流行率³⁷。选择合适的抗生素可加快患者康复，并降低不良反应发生的风险。大环内酯类抗生素是M. pneumoniae感染的主要治疗药物，尤其适用于儿科患者。近年来，M. pneumoniae 在中国感染率不断上升，给临床管理带来了重大挑战³⁷。

本研究采用聚合酶链式反应（PCR）结合荧光探针技术进行鉴定 肺炎支原体 人痰液样本中核酸及其耐药突变位点。肺炎支原体（Mp）对大环内酯类药物的耐药性主要源于23S rRNA基因的突变³⁵本研究中，引物.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动化核酸提取仪	广州达安基因股份有限公司	Smart 32
滤芯吸头	科睿生命科学有限公司	29822001	0-10µL
滤芯吸头	科睿生命科学有限公司	03023001	1-50µL
滤芯吸头	科睿生命科学有限公司	05623001	5-300µL
微量离心管	科睿生命科学有限公司	14124934	1.5mL
Mycoplasma pneumoniae 核酸及耐药突变位点检测试剂盒（荧光PCR法）	江苏默乐生物技术有限公司	20241111
核酸提取试剂（磁珠法）	圣湘生物科技股份有限公司	G24004
PCR管	DN生物科技（中国香港） 有限公司	6121003	0.2mL
实时荧光PCR仪	BIO-RAD	CFX96