Chromobacterium violaceum 中紫色杆菌素的定量及其被生物活性化合物的抑制

摘要

本实验方案的目的是通过Chromobacterium violaceum ATCC 12472产生的紫色杆菌素产量，作为评估生物活性化合物对群体感应抑制作用的间接指标。

摘要

细菌通过一种称为群体感应（quorum sensing, QS）的系统进行交流，该系统使其能够根据细胞密度的变化协调自身行为。此过程涉及产生、分泌并检测小分子胞外信号分子，这些分子通常被称为自诱导物（autoinducers, AI）。QS调控多种基因和功能，包括生物膜的形成与解聚、群集运动、毒力因子的产生、抗生素抗性以及生物发光等。由于群体感应抑制相较于传统抗生素施加的选择压力更小，因此已成为一种有前景的抗毒力策略，用于对抗耐药细菌。在细菌Chromobacterium violaceum ATCC 12472中，QS蛋白CviI/CviR与Aliivibrio fischeri的LuxI/LuxR型QS蛋白同源，可调控多个基因，包括负责合成紫色色素紫色杆菌素（violacein）的基因。C. violaceum已被广泛用作群体感应抑制研究中的生物传感菌株，特别是用于检测对紫色杆菌素生成的抑制作用。许多化合物可通过结合QS蛋白（无论是LuxI还是LuxR同源蛋白）来干扰QS通路，从而实现对群体感应的抑制。本实验方案描述了定量测定C. violaceum ATCC 12472产生的紫色杆菌素及其在不影响细菌生长浓度下被生物活性化合物抑制的方法。此处所述的检测方法显示，受试化合物显著减少了紫色杆菌素的生成。本研究突出了该方案在筛选具有潜力的群体感应抑制候选分子研究中的应用价值。

引言

细菌可以通过一种称为群体感应（QS）的系统进行交流，该系统能够根据细胞密度的变化协调调节其行为。此过程涉及产生、分泌和检测小的胞外信号分子（也称为自诱导分子），从而实现不同物种之间以及同一物种内部的通讯^1,2。

这种通讯能够调控多种基因和功能，例如生物膜的形成与解聚、运动性与黏附、细胞增殖、胞外酶和铁载体的合成、芽孢形成、耐酸性、水平基因转移、抗生素抗性、生物发光、胞外多糖的产生等^3,4,5。鉴于群体感应调控表型的重要性，目前人们高度关注开发能够干扰这种细胞间通讯的系统。抑制群体感应信号传递的过程也被称为群体淬灭（quorum quenching, QQ）⁶。QQ 可通过多种方式实现，包括抑制自诱导物的合成、通过酶促反应使这些信号分子失活，以及使用对这些信号分子具有拮抗作用的化合物^4,7。

抗生素耐药性日益严重的威胁推动了对替代疗法的研究，包括群体感应抑制剂（QSIs），这类物质可在不直接杀死病原菌的情况下干扰细菌间的通信。这些化合物与抗生素联用时可能产生协同效应，增强细菌对抗生素的敏感性，从而降低抗生素的使用剂量，这是延缓耐药性发展的关键策略。例如，白藜芦醇与卡那霉素联用可延缓Aeromonas hydrophila的生长⁸，而乙酰半胱氨酸与妥布霉素联用则可协同破坏Pseudomonas aeruginosa的生物膜⁵。

由于抗生素的过度使用以及新药研发进展缓慢，抑制群体感应（QS）等抗毒力策略提供了一种范式转变⁹。这类方法并不以细菌存活为靶点，而是针对其毒力因子，使细菌致病性降低，并更易受到宿主免疫系统或抗生素的清除⁵。与传统抗生素相比，该策略施加的选择压力较弱，有助于减少耐药性的产生，并保护有益的微生物群^10,11。尽管实验室研究结果令人鼓舞，但通过临床试验在真实世界中验证其效果仍较为缺乏¹²。群体感应抑制是一种有前景的抗生素辅助手段，但其向临床应用的转化仍需在复杂的生物环境中进一步证明其有效性和安全性。

C. violaceum 是一种β-变形菌，可形成具有光滑且有光泽表面的紫色菌落。它们是兼性厌氧杆菌，不形成芽孢¹³。在 C. violaceum 中，群体感应（QS）机制涉及一个基于类似于 Aliivibrio fisheri 的 lux 模型基因系统的正反馈环路，该系统包含蛋白 CviI（与LuxI同源）和CviR（与LuxR同源；图1）。在微生物生长静止期，当种群密度极高且营养几乎耗尽时，紫色杆菌素对多种生物体（包括真菌、细菌、线虫和病毒）表现出杀菌活性。因此，紫色杆菌素的产生可被视为一种竞争性策略，用以延长微生物菌落的存活时间¹⁴。

植物通过次生代谢产生多种化合物，这些化合物在增强其对不利环境的适应能力方面发挥着关键作用。这类代谢产物（如生物碱、酚类、黄酮类、醌类、单宁、萜类和凝集素）被广泛认为是植物抵御草食动物和微生物的防御机制¹⁵。由于植物与微生物之间存在复杂的相互作用，植物来源化合物作为群体感应抑制剂（QSI）的潜力已引起特别关注。在根际环境中开展的植物-病原体互作研究表明，植物能够响应细菌的自诱导分子，分泌具有生物活性的化合物，从而发挥对病原体的抑制作用¹⁶。

本研究介绍了一种旨在定量分析C. violaceum产紫色杆菌素的方法，重点评估生物活性化合物对其产生的抑制作用。该方法可作为初步筛选具有潜在群体感应抑制（QSI）活性化合物的工具，为针对革兰氏阴性致病菌的未来治疗开发提供快速且实用的途径。本标准化实验方案具有重要价值，因其提供了以往研究中尚未详细描述的操作步骤，有助于未来不同研究之间的结果比较^17,18,19。

方案

1. 培养物制备（图2）

1. 在试管中，将5 mL的C. violaceum ATCC 12472菌液接种于LB液体培养基（LB：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L）中，于30 °C、摇床（220 rpm）振荡培养24小时。
2. 用LB液体培养基将菌液浓度调整至OD₅₉₅ 为0.1，相当于约1 × 10⁸ CFU/mL。

2. 化合物制备

1. 在平底96孔板中，根据以下所述的倍比稀释计算方法，加入LB肉汤和生物活性化合物。根据其溶解度，生物活性化合物通常用纯DMSO或DMSO:水（1:1）溶液进行稀释。
   注意：在评估群体感应抑制（QSI）的方法中，至关重要的是确保所用浓度低于最低抑菌浓度（sub-MIC），即不影响细菌生长。因此，建议在不同浓度下进行生长曲线实验，以确认该化合物特异性抑制细胞间通讯，而非微生物存活能力。有关本方案中所用生物活性化合物的生长曲线实验，请参见补充图1。
2. 计算孔中生物活性化合物浓度时，假设法尼醇和芳樟醇的储备液浓度为20 mg/mL，目标孔中浓度为200 µg/mL；白藜芦醇储备液浓度为2.5 mg/mL，孔中浓度为25 µg/mL，计算方法如下：
   C₁V₁ = C₂V₂
   20,000 µg/mL × V₁ = 200 µg/mL × 200 µL
   V₁ = 40,000/20,000 µL
   V₁ = 2 µL
   其中C₁ = 储备液浓度（20 mg/mL，相当于20,000 µg/mL）；V₁ = 需加入的储备液体积；C₂ = 目标终浓度（200 µg/mL）；V₂ = 孔中终体积（200 µL）。

3. 连续稀释²⁰ 和平板制备（图3）

注意：连续稀释法用于快速评估待测化合物在一系列浓度下的效果。在此过程中，化合物以恒定比例（本例中为1:2）依次进行稀释。每次稀释均使其浓度较前一浓度降低一半，从而获得一系列递减的浓度²⁰。

1. 在倍比稀释的第一列中加入 196 µL LB 培养基（在本示例中为第 3、5 和 7 列）。在倍比稀释的后续孔中加入 100 µL LB 培养基（在本例中为第 4、6 和 8 列）。
2. 然后加入上一步（2.2）计算所得生物活性化合物体积的两倍，用于进行倍比稀释。计算结果显示，每个待测化合物需加入 2 µL 以达到第一孔的终浓度，因此应加入 4 µL 化合物（第 3、5 和 7 列）。
3. 将孔中总体积的一半（100 µL）转移至下一列（在本例中为第 4、6 和 8 列），依此类推，直至达到所需的最终稀释浓度（如进行倍比稀释）。转移前请务必充分混匀孔内液体。
   注意：在本实验设置中，为简化操作仅使用了两种浓度，且所有化合物均容纳于同一块板中。
4. 每种化合物的每个浓度至少需设置三个重复。建议进行三次生物学重复。每次更换孔时均需更换吸头，并重复操作直至达到最终所需浓度。在最后一列（在本例中为第 4、6 和 8 列），取出 100 µL 并弃去。
5. 向所有孔中加入 80 µL LB 培养基，使总体积达到 180 µL（B 至 D 行）。然后加入 20 µL 在步骤 1.2 中标准化的 C. violaceum 菌液，确保每孔终体积为 200 µL（B 至 D 行）。每次更换孔时务必更换移液器吸头，以避免孔间高浓度物质的交叉污染或污染。
6. 若化合物溶解于某种溶剂中，则需使用该溶剂制备对照组。本实验使用 DMSO。此时应设置溶剂对照组，即未处理对照组（UC，不含生物活性化合物；第 9 列）。每孔对照孔中加入 2 µL DMSO。这使得测试中 DMSO 的最高浓度为 1%。
   注意：1% 浓度的 DMSO 不影响细菌生长^21,22。
7. 准备空白对照，若使用有色化合物则准备颜色对照，且不接种细菌。在向所有孔中加入 80 µL LB 培养基、使总体积达到 180 µL 后（B 至 D 行，如前所述），向相应的空白孔中加入 20 µL LB 培养基，使总体积达到 200 µL（E 至 G 行）。此步骤的目的是消除结晶紫染色带来的背景干扰，该背景值将在本方案的第 5 步中从 OD 读数中扣除。
8. 若仍有空列，请向其中加入 200 µL LB 培养基或无菌蒸馏水（第 1、2、10、11 和 12 列）。此步骤对于防止培养基在培养箱中过度干燥至关重要。

4. 孵育与紫色杆菌素的提取

1. 根据所使用的分光光度计，在培养板上加盖或使用密封膜（如材料表中所述）以防止蒸发。
2. 将培养板在30 °C、130 rpm振荡条件下孵育24 h。随后，从培养箱中取出培养板，放入60 °C的干燥培养箱中，打开盖子，使培养板完全干燥（约8 h）。
3. 培养板干燥后，从培养箱中取出，向每孔加入200 µL纯DMSO，然后盖上盖子。将培养板置于25 °C培养箱中，在130 rpm振荡条件下孵育30 min，以充分溶解紫色素。
4. 孵育结束后，从培养箱中取出培养板，将100 µL溶液转移至另一块微孔板中，注意移液枪头避免接触孔壁。

5. 紫色杆菌素产量的定量分析

1. 使用合适的酶标仪在 595 nm 处测定吸光度，定量紫色杆菌素的产量（材料表）。紫色杆菌素色素的抑制程度与吸光度读数的降低成正比。
2. 以阴性对照（未处理对照）作为 100% 紫色杆菌素产量的参考基准（表 1）。首先，从每个处理组的重复样本中减去空白组的吸光度值，以获得仅对应于紫色杆菌素色素的吸光度（排除培养基或化合物颜色的干扰）。然后，使用以下公式计算每个处理组的紫色杆菌素产量百分比。
   %紫色杆菌素产量 = （活性化合物的 OD / 未处理对照的 OD）× 100
3. 对三个重复样本进行统计分析。结果可采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 检验。p <0.05 被认为具有统计学显著性。

结果

本研究中所示结果采用了本研究团队先前研究过的三种生物活性化合物⁸：白藜芦醇（resveratrol）、法尼醇（farnesol）和芳樟醇（linalool）。每种化合物均检测其对C. violaceum ATCC 12472产生紫色杆菌素的抑制能力，该表型由QS系统调控vioABCDE操纵子所控制²³。

实验结果验证了本方案在定量分析C. violaceum ATCC 12472菌株中紫色杆菌素生成及其受生物活性化合物抑制方面的有效性。法尼醇、芳樟醇和白藜芦醇在不影响细菌生长的前提下显著降低了紫色杆菌素水平，表明该方法能够有效区分群体感应抑制（QSI）与抗菌作用²⁴。与先前的方法^25,24,26相比，本...

讨论

20世纪90年代首次出现了从C. violaceum中提取和表征紫色杆菌素的方法，该方法主要关注为色素合成寻找合适的碳源。在此过程中，紫色杆菌素连同细胞和培养基一起被干燥，重新悬浮于乙醇中，然后通过上清液提取进行分离。此时溶解在乙醇中的紫色杆菌素再次被干燥，从而获得纯净的干粉状色素²⁷。1998年，该实验方案进行了改进²⁸。尽管仍使用乙醇溶解紫色杆菌素，但更新后的方法引入了过滤、索氏提取和结晶步骤。多年来，紫色杆菌素的提取与定量方法经历了多次修改，例如通过裂解细胞并用正丁醇提取紫色杆菌素²⁵，超声处理，以及用DMSO稀释²⁹，或将培养板干燥后用DMSO溶解³⁰。

需要注意的是，由于这是一项群体感应（QS）抑制试验，必须确保所测试化合物的浓度为亚抑制浓度，即不影响细菌生长。这是研究化合物对QS信号传导作用的关键前提之一

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMSO	Synth
法尼醇	Sigma-Aldrich	F203	95%
芳樟醇	Sigma-Aldrich	L2602	97%
LB培养基	Difco	244620
光学粘合膜	Thermo Fisher	4311971	MicroAmp
白藜芦醇	Sigma-Aldrich	R5010	≥99% (HPLC)
Synergy HTX 多功能酶标仪	Biotek
96孔细胞培养板	Kasvi	K12-096