Chromobacterium violaceum 中紫色杆菌素的定量及其被生物活性化合物的抑制

摘要

本实验方案的目的是通过Chromobacterium violaceum ATCC 12472产生的紫色杆菌素产量，作为评估生物活性化合物对群体感应抑制作用的间接指标。

摘要

细菌通过一种称为群体感应（quorum sensing, QS）的系统进行交流，该系统使其能够根据细胞密度的变化协调自身行为。此过程涉及产生、分泌并检测小分子胞外信号分子，这些分子通常被称为自诱导物（autoinducers, AI）。QS调控多种基因和功能，包括生物膜的形成与解聚、群集运动、毒力因子的产生、抗生素抗性以及生物发光等。由于群体感应抑制相较于传统抗生素施加的选择压力更小，因此已成为一种有前景的抗毒力策略，用于对抗耐药细菌。在细菌Chromobacterium violaceum ATCC 12472中，QS蛋白CviI/CviR与Aliivibrio fischeri的LuxI/LuxR型QS蛋白同源，可调控多个基因，包括负责合成紫色色素紫色杆菌素（violacein）的基因。C. violaceum已被广泛用作群体感应抑制研究中的生物传感菌株，特别是用于检测对紫色杆菌素生成的抑制作用。许多化合物可通过结合QS蛋白（无论是LuxI还是LuxR同源蛋白）来干扰QS通路，从而实现对群体感应的抑制。本实验方案描述了定量测定C. violaceum ATCC 12472产生的紫色杆菌素及其在不影响细菌生长浓度下被生物活性化合物抑制的方法。此处所述的检测方法显示，受试化合物显著减少了紫色杆菌素的生成。本研究突出了该方案在筛选具有潜力的群体感应抑制候选分子研究中的应用价值。

引言

细菌可以通过一种称为群体感应（QS）的系统进行交流，该系统能够根据细胞密度的变化协调调节其行为。此过程涉及产生、分泌和检测小的胞外信号分子（也称为自诱导分子），从而实现不同物种之间以及同一物种内部的通讯^1,2。

这种通讯能够调控多种基因和功能，例如生物膜的形成与解聚、运动性与黏附、细胞增殖、胞外酶和铁载体的合成、芽孢形成、耐酸性、水平基因转移、抗生素抗性、生物发光、胞外多糖的产生等^3,4,5。鉴于群体感应调控表型的重要性，目前人们高度关注开发能够干扰这种细胞间通讯的系统。抑制群体感应信号传递的过程也被称为群体淬灭（quorum quenching, QQ）⁶。QQ 可通过多种方式实现，包括抑制自诱导物的合成、通过酶促反应使这些信号分子失活，以及使用对这些信号分子具有拮抗作用的化合物^4,7。

抗生素耐药性日益严重的威....

方案

1. 培养物制备（图2）

1. 在试管中，将5 mL的C. violaceum ATCC 12472菌液接种于LB液体培养基（LB：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L）中，于30 °C、摇床（220 rpm）振荡培养24小时。
2. 用LB液体培养基将菌液浓度调整至OD₅₉₅ 为0.1，相当于约1 × 10⁸ CFU/mL。

2. 化合物制备

1. 在平底96孔板中，根据以下所述的倍比稀释计算方法，加入LB肉汤和生物活性化合物。根据其溶解度，生物活性化合物通常用纯DMSO或DMSO:水（1:1）溶液进行稀释。
   注意：在评估群体感应抑制（QSI）的方法中，至关重要的是确保所用浓度低于最低抑菌浓度（sub-MIC），即不影响细菌生长。因此，建议在不同浓度下进行生长曲线实验，以确认该化合物特异性抑制细胞间通讯，而非微生物存活能力。有关本方案中所用生物活性化合物的生长曲线实验，请参见补充图1。
2. 计算孔中生物活性化合物浓度时，假设法尼醇和芳樟醇的储备液浓度为20 mg/mL，目标孔中浓度为200 µg/mL....

结果

本研究中展示的结果使用了本研究团队先前研究过的三种生物活性化合物⁸：白藜芦醇（resveratrol）、法尼醇（farnesol）和芳樟醇（linalool）。每种化合物均被检测其对C. violaceum ATCC 12472紫色色素（violacein）生成的抑制能力，该表型由群体感应（QS）系统通过调控vioABCDE操纵子所控制²³。

实验结果验证了本方案在定量分析C. violaceum ATCC 12472中紫色杆菌素产生及其被生物活性化合物抑制方面的有效性。法尼醇、芳樟醇和白藜芦醇在不影响细菌生长的情况下显著降低紫色杆菌素水平，证实该方法能够区分群体感应抑制（QSI）与抗菌效应²⁴。与早期方法^25,24,

讨论

20世纪90年代首次出现了从C. violaceum中提取和表征紫色杆菌素的方法，该方法主要关注为色素合成寻找合适的碳源。在此过程中，紫色杆菌素连同细胞和培养基一起被干燥，重新悬浮于乙醇中，然后通过上清液提取进行分离。此时溶解在乙醇中的紫色杆菌素再次被干燥，从而获得纯净的干粉状色素²⁷。1998年，该实验方案进行了改进²⁸。尽管仍使用乙醇溶解紫色杆菌素，但更新后的方法引入了过滤、索氏提取和结晶步骤。多年来，紫色杆菌素的提取与定量方法经历了多次修改，例如通过裂解细胞并用正丁醇提取紫色杆菌素²⁵，超声处理，以及用DMSO稀释²⁹，或将培养板干燥后用DMSO溶解³⁰。

需要注意的是，由于这是一项群体感应（QS）抑制试验，必须确保所测试化合物的浓度为亚抑制浓度，即不影响细菌生长。这是研究化合物对QS信号传导作用的关键前提之一

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMSO	Synth
法尼醇	Sigma-Aldrich	F203	95%
芳樟醇	Sigma-Aldrich	L2602	97%
LB培养基	Difco	244620
光学粘合膜	Thermo Fisher	4311971	MicroAmp
白藜芦醇	Sigma-Aldrich	R5010	≥99% (HPLC)
Synergy HTX 多功能酶标仪	Biotek
96孔细胞培养板	Kasvi	K12-096