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研究文章

通过抑制 RKIP 激活 NRF2/HO-1 通路减轻自发性脑内出血后神经元铁死亡

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DOI：

10.3791/68511

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2025年10月31日

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1Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital 2 of Nantong University

本文内容

摘要

通过开展生物体水平和细胞培养的研究，证实抑制Raf激酶抑制蛋白（RKIP）可减轻自发性脑出血后神经元的铁死亡，从而减少脑损伤。所观察到的细胞保护作用是通过调控NRF2/HO-1信号轴实现的。

摘要

Raf 激酶抑制蛋白（RKIP），作为磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族的主要成员，已被证实参与多种生理过程，包括细胞分化、迁移、细胞周期及凋亡。本研究探讨了其在自发性脑出血（ICH）后神经元铁死亡中的功能及相关机制。通过血晶素刺激培养的大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞，构建了自发性ICH的细胞模型。检测了细胞活力、RNA表达、活性氧（ROS）水平及脂质氢过氧化物（LPO）含量，并对蛋白表达水平进行了测定。本研究证实了 RKIP 抑制具有神经保护作用 体外 遵循 ICH。该效应与谷胱甘肽过氧化物酶 4（glutathione peroxidase 4,GPX4) 以及长链脂酰辅酶A合成酶家族4（acyl-CoA synthetase long-chain family 4，ACSL4），以及神经元中的活性氧（ROS）和脂质过氧化物（LPO）水平。 RKIP 抑制作用表现出对神经元铁死亡的保护作用 体外 遵循ICH，可能通过激活核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1（NRF2/HO-1）通路。该机制可能为针对脑出血（ICH）中神经元铁死亡的治疗策略提供新的思路。

引言

自发性脑内出血（ICH）是一种脑血管疾病，其特征是由于颅内血管损伤、坏死和血管破裂导致出血，常累及基底节区，是出血性卒中的主要亚型之一1。被诊断为 ICH 的患者死亡率约为 50%，且相当一部分幸存者会出现严重的独立生活能力丧失2。目前针对自发性 ICH 的治疗手段有限，尚无任何疗法被证实能显著降低死亡率或明显改善 ICH 后的神经功能预后。

铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式，其特征是脂质过氧化、亚铁离子积累以及谷胱甘肽耗竭，在遗传学、形态学和生物学特征上区别于其他类型的程序性细胞死亡3。越来越多的证据表明，神经元铁死亡在脑出血（ICH）的病理过程中发挥重要作用。Raf激酶抑制蛋白（RKIP），也称为磷脂酰乙醇胺结合蛋白1（PEBP1），参与神经系统的发育，并可通过与15-脂氧合酶（15LOX）结合形成15LOX/PEBP1复合物，该复合物是铁死亡的关键调控因子4。然而，RKIP在自发性脑出血进展相关的铁死亡中的具体作用及其机制仍有待探索。

本研究探讨了抑制RKIP对神经元铁死亡的保护作用，结果表明，抑制RKIP表达可抑制脑出血（ICH）后神经元的铁死亡，其机制可能与激活核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1（NRF2/HO-1）通路有关。这些发现对于开发针对ICH发病机制的新型治疗策略具有重要意义。

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方案

PC12 细胞的培养
PC12 细胞系在含有 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的 Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI-1640）培养基中进行传代培养，并在标准培养条件（37 °C，5% CO2 的湿化环境）下常规维持。在实验操作中，将贴壁细胞接种至培养容器中，使其增殖至接近融合的单层状态（约覆盖 90% 表面面积）。通过使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液进行酶消化处理实现细胞解离，并连续进行三次传代培养以确保细胞群体的稳定性。处理后的细胞随后用于后续实验应用及分析检测。

细胞活力检测
根据检测试剂盒制造商提供的说明，通过细胞活力检测评估血红素（hemin）和Locostatin对PC12细胞的细胞毒性。将PC12细胞均匀接种于96孔板中，并用血红素或Locostatin处理24小时。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，细胞在含有10%四唑盐溶液的RPMI-1640培养基中于37 °C孵育90分钟。随后使用酶标仪在450 nm处测定光密度（OD）值。

定量反转录-聚合酶链式反应（RT-qPCR）
使用RNA提取试剂从PC12细胞中提取总RNA。首先，将样品在提取试剂中充分匀浆，以确保细胞完全裂解。向混合物中加入氯仿，剧烈振荡后离心以分离各相（12,000 × g，15分钟，4 °C）。收集含有RNA的水相，通过加入异丙醇（水相 : iPrOH = 1:1）并室温孵育使RNA沉淀。离心收集RNA沉淀（12,000 × g，10分钟，4 °C），加入1 mL 70%乙醇以去除杂质，最后将RNA沉淀溶解于无RNase的水中，于-80 °C保存。使用反转录酶预混液（RT Master Mix）合成互补DNA（cDNA）模板。将所得模板按1:5比例稀释后，在实时荧光定量PCR仪上进行定量实时PCR扩增。每个样本设三个复孔进行扩增，取PCR产物的相对量平均值。所用引物列于表1，以β-actin作为内参基因。采用公式 E = 2−ΔΔCt 计算相对mRNA浓度，并记录每个反应的循环阈值（CT）值。

细胞内活性氧（ROS）和脂质氢过氧化物（LPO）检测
采用流式细胞术检测 ROS 和 LPO 水平。PC12 细胞用血红素（80 µM）、Locostatin（5 µM）和 ML385（5 µM）处理 24 小时，随后在培养皿中用 PBS 洗涤 3 次。然后将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下，与活性氧探针 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）和脂质氢过氧化物探针 BODIPY 581/591 C11 共同孵育 40 分钟。用 PBS 洗涤以去除多余探针后，通过流式细胞术测定荧光强度。所有样本均采用一致的设门策略：首先根据 FSC-A 与 SSC-A 设门以排除碎片，随后通过 FSC-A 与 FSC-H 设门筛选单细胞。未染色细胞和仅用血红素处理的细胞分别作为阴性对照和阳性对照，用于设定荧光补偿和设门范围。数据使用配套软件进行分析。

蛋白质提取与蛋白质印迹
总蛋白提取 
弃去处理后的PC12细胞上清液，用预冷的PBS洗涤三次。用胰蛋白酶消化收集细胞，200 × g 离心5分钟。弃去上清后，将细胞沉淀用含10%蛋白酶抑制剂和10%磷酸酶抑制剂的预冷放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液进行匀浆。冰上孵育30分钟后，4 °C条件下以12,000 × g 离心15分钟。取澄清上清液与上样缓冲液按4:1比例混合，于95 °C加热5分钟以使蛋白质变性。蛋白样品储存于-80 °C，以备后续使用。

Western blot 分析 
使用浓缩胶和分离胶进行 SDS-PAGE 分离蛋白质，并将样品加入加样孔中。浓缩胶电泳在 80 V 条件下进行，分离胶电泳在 120 V 条件下进行。通过转膜系统，将蛋白质以 300 mA 恒定电流转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，转膜时间为 1–2 小时（PVDF 膜预先在甲醇中活化 1 分钟）。用含 5% 脱脂奶粉的 TBST 溶液于室温封闭膜 2 小时，以防止非特异性结合。用 TBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟后，将膜与以下用 TBST 稀释的一抗于 4 °C 过夜孵育：兔抗-ACSL4（1:1,000）、兔抗-GPX4（1:1,000）、兔抗-HO-1（1:2,000）、兔抗-NRF2（1:1,000）、兔抗-RKIP（1:1,500）以及鼠抗-β-actin（1:5,000）。用 TBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟后，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗于室温孵育 2 小时：HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG（1:1,000）、HRP 标记的山羊抗兔 IgG（1:1,000）。再用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟，使用 ECL Western Blot 试剂盒显影蛋白条带，并用 ImageJ 软件进行定量分析。

免疫荧光染色
将细胞接种于预先放置在培养板中的盖玻片上，使其贴壁。实验处理后，弃去上清液，并用 PBS 洗涤细胞 3 次。细胞在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定 15 分钟，随后用 PBS 洗涤 3 次。接着，在室温下用 0.1% Triton X-100 对细胞进行透化处理 10 分钟，并再次用 PBS 洗涤 3 次。使用 3% 牛血清白蛋白（BSA）在室温下孵育 30 分钟以封闭非特异性结合位点。一抗在 4 °C 过夜孵育：Rabbit anti-HO-1（1:500）、Rabbit anti-NRF2（1:500）。次日用 PBS 洗涤 3 次后，细胞在避光条件下于室温与荧光二抗孵育 1 小时：Alexa Fluor 488 标记的 Goat Anti-Rabbit IgG（1:500）。完成最后的洗涤步骤后，使用含 4',6-二脒基-2'-苯基吲哚（DAPI）的封片剂对样本进行封片，以实现细胞核的复染。图像采用共聚焦激光扫描显微镜采集。

统计学分析
测量数据以均值 ± 标准差（S.D.）表示。定量数据来自三次独立重复实验，用于分析。两组之间的比较采用t检验，多组之间的比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验进行多重比较。当p值< 0.05时，认为差异具有统计学显著性。

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结果

血红素可诱导质膜损伤，因此常用于构建体外脑出血（ICH）细胞模型。本研究探讨了不同浓度和作用时间的血红素处理对PC12细胞活力的影响，同时通过蛋白质印迹分析（图1A）检测了相应实验条件下RKIP蛋白表达的动态变化。当血红素浓度达到60 µM或更高时，细胞活力显著降低（图1B），且随着浓度升高呈剂量依赖性下降。此外，血红素的细胞毒性具有时间依赖性，在暴露后24小时内达到峰值，随后逐渐下降（图1C）。蛋白质印迹分析显示，在80 µM血红素处理下，RKIP蛋白表达显著上调（图1D、E），并在刺激后24小时达到最高水平（图1F、G）。基于上述结果，我们选择80 µM血红素处理24小时作为后续实验条件，以进一步阐明其潜在的作用机制和信号通路。

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讨论

本研究探讨了其效应及潜在机制 RKIP 敲低对脑出血诱导的铁死亡的影响 体外 刺激细胞后，血红素可引发氧化应激，伴随活性氧（ROS）和脂质过氧化（LPO）的过度产生，从而促进铁死亡。内源性抑制 RKIP 表达加速了释放的 NRF2 进入细胞核并与抗氧化反应元件（ARE）结合，启动下游抗氧化基因的转录。 HO-1血红素代谢中的关键酶，也是下游靶点之一 NRF2，具有强大的抗氧化作用。该通路可减轻铁死亡和氧化损伤，同时维持组织稳态（图7。这些发现表明 RKIP 可作为治疗脑出血（ICH）的潜在治疗靶点。

脑出血（ICH）损伤后，破裂的红细胞释放血红蛋白，血红蛋白进一步降解为血红素。血红素随后被HO-1分解为铁离子，促进芬顿反应，产生可引发氧化应激并损伤脂质、蛋白质和DNA的自由基7,

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披露

作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的经济利益或可能被认为影响本文所报告工作的个人关系。

致谢

本研究由南通市卫生健康委员会项目（MS2022015）和南通市科学技术局项目（JCZ2023022）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgGBeyotime BiotechA0423
抗 ACSL4 抗体Cell signaling38493T
抗 GPX4 抗体Cell signaling59735S
抗 HO-1 抗体MedChemExpressHY-P80499
抗 NRF2 抗体Cell signaling12721T
抗 RKIP 抗体Abcamab76582
抗-β-肌动蛋白抗体Abcamab179467
BeyoECL PlusBeyotime BiotechP0018M
BSANCM BiotechWB6504-100g
细胞计数试剂盒-8Beyotime BiotechC0037
CELLSAVINGNCM BiotechC40050
ChamQ SYBR Color qPCR 主混合液VazymeQ411-02
DMSOBeyotime BiotechST038
胎牛血清GibcoA5670801
GraphPad Prism
血红素MedChemExpressHY-19424
HiScript Q RT 超混合液用于 qPCR（含 gDNA 清除剂）VazymeR123-01
HRP 标记的山羊抗小鼠 IgGThermoC31430100
HRP 标记的山羊抗兔 IgGThermoC31460100
脂质过氧化物（LPO）含量检测试剂盒SolarbioBC5245
LocostatinMedChemExpressHY-W013411A
ML385MedChemExpressHY-100523
封片介质？抗荧光淬灭（含 DAPI）SolarbioS2110
脱脂奶粉SolarbioD8340
PBS（粉末，pH 7.2–7.4）SolarbioP1010
PC-12Adh南京百川生物技术BC-C-RA-005
青霉素-链霉素溶液SolarbioP1400
PRMI-1640GibcoA1049101
通用型蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液，50xBeyotime BiotechP1045
蛋白分子量标准Thermo26617
PVDF MilliporeRIKB43638
活性氧检测试剂盒SolarbioCA1410
RIPA 裂解缓冲液（高浓度）SolarbioR0010
SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒EpizymePG110
SDS-PAGE 样品上样缓冲液，5xBeyotime BiotechP0015
TritonX-100SolarbioIT9100
TRIzolThermo15596018CN
胰蛋白酶-EDTA 溶液？0.25%（不含酚红）SolarbioT1300

参考文献

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