通过 NRF2/HO-1 通路激活自发性脑出血后 RKIP 抑制神经元铁死亡衰减

自发性脑出血 （ICH） 是一种脑血管疾病，其特征是颅内血管损伤、坏死和血管破裂导致的出血，通常影响基底神经节，是出血性中风的主要亚型¹。被诊断患有 ICH 的患者的死亡率约为 50%，很大一部分幸存者严重丧失独立性²。目前自发性 ICH 的治疗选择有限，现有疗法尚无显示可以显着降低死亡率或显着改善 ICH 后的神经系统结果。

铁死亡是一种铁依赖性形式的程序性细胞死亡，其定义是脂质过氧化、亚铁离子的积累和谷胱甘肽的消耗，在遗传、形态学和生物学方面将其与其他形式的程序性细胞死亡区分开来³。越来越多的证据强调了神经元铁死亡在 ICH 病理学中的作用。Raf 激酶抑制蛋白 （RKIP），也称为磷脂酰乙醇胺结合蛋白 1 （PEBP1），参与神经发育，并通过与 15-脂氧合酶 （15LOX） 结合形成 15LOX/PEBP1 复合物，15-脂氧合酶是铁死亡的关键调节因子⁴。然而， RKIP 在与自发性 ICH 进展相关的铁死亡中的具体作用和机制仍未探索。

本研究检查了 RKIP 抑制对神经元的抗铁死亡作用，表明抑制 RKIP 表达可以抑制 ICH 后的神经元铁死亡，可能通过激活核因子 E2 相关因子 2/血红素加氧酶-1 （NRF2/HO-1） 通路。这些发现对于开发针对 ICH 发病机制的新治疗策略具有重要意义。

PC12细胞培养
PC12细胞系在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的罗斯威尔公园纪念研究所1640（RPMI-1640）生长培养基中繁殖，在标准培养条件（37°C，5%CO₂加湿气氛）下进行常规维护。对于实验程序，将贴壁细胞接种到培养容器上并使其增殖，直到达到接近汇合的单层（约90%的表面覆盖率）。细胞解离是通过使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液进行酶处理来完成的，然后是三个连续的传代培养周期，以确保群体稳定性。处理后的细胞随后被分配用于下游实验应用和分析评估。

细胞活力测定
按照检测试剂盒制造商提供的说明，评估细胞活力以评估血红素和洛司汀对PC12细胞的细胞毒性。将PC12细胞均匀接种在96孔板中，并用血红素或洛司汀培养24小时。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤后，将细胞在含有10%四唑盐溶液的RPMI-1640培养基中在37°C下孵育90分钟。 然后使用酶标仪在 450 nm 处测量光密度 （OD） 值。

定量逆转录聚合酶链反应 （RT-qPCR）
使用RNA提取试剂从PC12细胞中提取总RNA。首先，将样品在提取试剂中均质化，确保彻底裂解。将氯仿加入混合物中，剧烈摇动，离心以分离相（12,000 × g，15 min，4 °C）。收集含有RNA的水相，加入异丙醇（水相：iPrOH = 1：1）沉淀RNA，室温孵育。离心沉淀RNA（12,000 × g，10 min，4 °C），加入1 mL 70%乙醇去除杂质，最后将RNA沉淀溶解在无RNase水中，在-80 °C下储存。 通过RT预混液逆转录生成互补DNA（cDNA）模板。然后将所得模板以 1：5 的比例稀释，并在实时 PCR 仪器上进行定量实时 PCR。将每个样品一式三份扩增，并平均PCR产物的相对量。所使用的引物列于表1中，其中β-肌动蛋白作为管家基因。使用公式E = 2^−ΔΔCt测定相对mRNA浓度，并记录每个反应的临界阈值循环（CT）值。

细胞内活性氧 （ROS） 和脂质氢过氧化物 （LPO） 测定
使用流式细胞术测量 ROS 和 LPO 水平。用血红素（80μM），洛司汀（5μM）和ML385（5μM）处理PC12细胞24小时，并在培养皿中用PBS洗涤3次。然后在 2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯 （DCFH-DA） 和 BODIPY 581/591 C11（LPO 探针）存在下，将细胞与 5% CO₂ 在 37 °C 下孵育 40 分钟。在PBS洗涤以去除多余的探针后，通过流式细胞术测量荧光强度。在所有样品中应用一致的门控策略：首先，在FSC-A和SSC-A上对细胞进行门控以排除碎片，然后通过FSC-A与FSC-H门控选择单个细胞。未染色细胞和单独用血红素处理的细胞作为阴性和阳性对照，以建立荧光补偿和门控。使用链接的软件分析数据。

蛋白质提取和蛋白质印迹
总蛋白提取
弃去处理过的PC12细胞的上清液，然后用冰冷的PBS洗涤3次。使用胰蛋白酶收获细胞，并以 200 × g 离心 5 分钟。除去上清液后，将细胞沉淀在含有10%蛋白酶抑制剂和10%磷酸酶抑制剂的冷放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解缓冲液中均质化。在冰上孵育30分钟后，将裂解物在4°C下以12,000 × g离心15分钟。 将透明上清液与上样缓冲液 （4：1） 混合，并在 95 °C 下加热 5 分钟以使蛋白质变性。将蛋白质样品储存在-80°C以备后续使用。

蛋白质印迹分析
使用堆叠凝胶和分离凝胶通过 SDS-PAGE 分离蛋白质，并将样品加载到孔中。对堆叠凝胶进行电泳，在 120 V 下对分离凝胶进行电泳。使用转印系统以 300 mA 的恒定电流将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜上（在甲醇中预活化 1 分钟），持续 1-2 小时。在室温下用5%脱脂牛奶在TBST中封闭膜2 h，以防止非特异性结合。用TBST洗涤3次（每次10分钟）后，将膜在4°C下孵育过夜，在TBST中稀释以下一抗：兔抗ACSL4 （1：1,000），兔抗GPX4 （1：1,000），兔抗HO-1 （1：2,000），兔抗NRF2 （1：1,000），兔抗RKIP （1：1,500）和小鼠抗β-肌动蛋白（1：5,000）。用TBST洗涤膜3 x 10分钟，并在室温下与HRP偶联的二抗孵育2小时：HRP标记的山羊抗小鼠IgG（1：1,000），HRP标记的山羊抗兔IgG（1：1,000）。在额外的 TBST 洗涤 3 x 5 分钟后，使用 ECL 蛋白质印迹试剂盒可视化蛋白质信号，并使用 ImageJ 软件进行定量。

免疫荧光染色
将细胞接种到预先放置在培养板中的盖玻片上并使其粘附。实验处理后，弃去上清液，用PBS洗涤细胞3次。在室温下用 4% 多聚甲醛 （PFA） 固定细胞 15 分钟，然后进行 3 次 PBS 洗涤。随后，在室温下用0.1%Triton X-100透化细胞10分钟，并用PBS洗涤3次。通过在室温下与3%牛血清白蛋白（BSA）孵育30分钟来阻断非特异性结合。在4°C下施用一抗过夜：兔抗HO-1 （1：500），兔抗NRF2 （1：500）。第二天进行三次PBS洗涤后，将细胞与荧光二抗在室温下在黑暗中孵育1小时：Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG（1：500）。在最后的洗涤之后，用含有4'，6-二脒基-2'-苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片样品进行核复染。使用共聚焦激光扫描显微镜捕获图像。

统计分析
测量数据表示为平均值±标准差 （SD）。获取代表三种独立重复测定结果的定量数据进行分析。对于两组之间的比较，采用 t 检验，同时采用单因素方差分析 （ANOVA） 进行多组间比较，然后采用 Tukey 事后检验进行多重比较。p 值< 0.05 被认为具有统计学意义。

血红素可诱导质膜损伤，因此常用于构建ICH的体外细胞模型。本研究研究了不同浓度和持续时间的血红素处理对PC12细胞活力的影响，同时通过蛋白质印迹分析了相应实验条件下的RKIP蛋白表达动态（图1A）。在血红素浓度为60μM或更高时，细胞活力显着降低（图1B），并且随着浓度的增加，这种降低以剂量依赖性方式发生。此外，血红素细胞毒性是时间依赖性的，在暴露的前24小时内达到峰值，然后逐渐下降（图1C）。蛋白质印迹分析表明，RKIP蛋白表达在80μM血红素时显着升高（图1D，E），并在刺激后24小时达到峰值（图1F，G）。基于这些发现，我们选择了80μM血红素和24 h的处理期进行后续实验，以阐明所涉及的潜在机制和信号通路。

为了研究RKIP在ICH后神经元铁死亡中的作用，我们使用Locostatin来抑制RKIP表达（图2A）。洛司汀与RKIP结合，破坏RKIP与Raf-1激酶和GRK2之间的相互作用，从而减弱RKIP的功能作用，达到抑制目的。在这项研究中，我们使用洛司汀作为RKIP抑制剂来研究相关的分子机制5,6。首先使用活力测定在0-40μM的浓度范围内评估Locostatin的细胞毒性。结果显示，在≤5μM时没有明显的细胞毒性，为后续实验建立了安全的浓度范围（图2B）。我们使用蛋白质印迹和 RT-qPCR 分析进一步证实了 5 μM Locostatin 对 RKIP 表达的抑制作用。Western blot显示RKIP蛋白水平显着降低（图2C，D），而RT-qPCR显示RKIP mRNA水平降低（图2E）。这些发现证明了 5 μM Locostatin 在抑制 RKIP 表达方面的功效。

本研究开发了血红素诱导的脑出血（ICH）PC12细胞模型，以描述 RKIP在铁死亡中的调节功能。我们的结果表明，血红素刺激显着增加了 RKIP 表达，同时降低了细胞活力。根据现有研究，我们推测血红素诱导的细胞死亡可能与铁死亡密切相关，铁死亡是一种铁催化的脂质过氧化过程，其特征是细胞区室内的病理性铁沉积和活性氧 （ROS） 水平升高。

为了进一步探讨RKIP与铁死亡之间的关系，我们用Locostatin处理血红素刺激的PC12细胞。Western blot分析显示，血红素处理组中，铁死亡的关键驱动因素酰基辅酶A合成酶长链家族4（ACSL4）的表达显著增加（图3A，B）。ACSL4 是铁死亡中关键的促死亡基因，可促进多不饱和脂肪酸 （PUFA） 的酯化，从而增加细胞对铁死亡的敏感性。此外，血红素处理组中，铁死亡抑制剂谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达显着降低（图3A，C）。GPX4是铁死亡的关键调节因子，通过清除脂质过氧化物来抑制脂质过氧化，从而保护细胞免受氧化损伤。这些结果表明，血红素刺激会增加 PC12 细胞的铁死亡。然而，与血红素组相比，用洛司汀药理学抑制RKIP逆转了这些改变，表明抑制RKIP表达抑制了PC12细胞的铁死亡。在 mRNA 水平上也观察到一致的结果（图 3 F，G）。

我们还研究了铁死亡相关通路分子的表达。NRF2/HO-1 通路已被证明在铁死亡中起关键作用。基于此，我们假设 RKIP 抑制可能通过激活 NRF2/HO-1 通路来抑制神经元铁死亡。为了验证这一假设，我们首先用血红素刺激PC12细胞，发现NRF2蛋白的表达显着增加（图3A，D），其下游产物HO-1显着增加（图3A，E）。这些发现表明，血红素诱导的铁死亡激活了NRF2/HO-1通路，从而对细胞发挥保护作用。NRF2作为细胞抗氧化反应的主要调节因子，通过调节HO-1等下游靶基因的表达来增强细胞抗氧化能力，从而抑制铁死亡。随后，与血红素治疗组相比，Locostatin治疗进一步增加了HO-1和NRF2的表达（图3A，D）。在mRNA水平上也观察到一致的结果（图3I，J），进一步证实RKIP的抑制通过调节NRF2及其下游分子HO-1来抑制血红素刺激的PC12细胞中的铁死亡。

值得注意的是，另一种铁死亡抑制剂铁蛋白重链1（FTH1）在血红素刺激下表现出表达增加，当 RKIP 受到抑制时，其表达进一步升高（图3H）。 FTH1 是铁蛋白的主要成分，负责铁的储存和氧化。它将铁离子转化为更稳定的形式，减少游离铁引起的氧化应激。血红素刺激后 FTH1 的上调可能代表对铁过载的代偿反应，因为细胞试图储存多余的铁以避免氧化损伤。洛司汀治疗后 FTH1 表达的进一步增加表明游离铁水平降低和抗氧化能力增强，强化了 RKIP 抑制抑制血红素诱导的 PC12 细胞铁死亡的结论。

通过流式细胞术评估 PC12 细胞中的 ROS 和脂质氢过氧化物 （LPO） 水平。血红素治疗导致 ROS 和 LPO 水平显着升高，在给予洛克抑素后逆转。这一发现表明，抑制RKIP可能有助于抑制神经元的铁死亡（图4A-D）。

总之，血红素诱导的 PC12 细胞活力的剂量和时间依赖性降低，伴随着 RKIP 蛋白水平的显着增加。这一过程与 ACSL4 水平升高和 GPX4 表达抑制有关。同时，观察到氧化损伤标志物（ROS 和 LPO）的显着积累，两者都通过介导氧化应激和脂质膜破坏成为铁死亡的核心驱动因素。此外，铁储存蛋白 FTH1 的上调表明细胞对铁过载的代偿性反应。至关重要的是，Locostatin 对 RKIP 的药理学抑制逆转了这些改变并消除了血红素诱导的铁死亡（图 1、 图 2、 图 3 和 图 4）。

检测结果表明，抑制 RKIP 可有效抑制神经元铁死亡并调节 NRF2/HO-1 表达。鉴于 NRF2/HO-1 通路在铁死亡中起关键作用，据推测， RKIP 抑制观察到的神经元铁死亡的抑制可能是通过刺激该途径介导的。为了检验这一假设，进行了进一步的实验（图5A）。

使用选择性NRF2抑制剂ML385，结果证实NRF2在蛋白质（图5B，C）和mRNA水平（图5E）上均有效降低表达。此外，还评估了 NRF2 下游分子 HO-1 的表达。研究结果表明，虽然RKIP抑制最初增加了HO-1表达，但在NRF2抑制后这种作用被逆转（图5B，D，F）。这些结果表明，RKIP 抑制可能通过激活 NRF2/HO-1 通路来减弱神经元铁死亡。免疫荧光染色进一步支持了这些发现，因为在RKIP抑制后观察到NRF2的核易位（图5G-J）。

随后，我们使用流式细胞术进一步评估了PC12细胞中ROS和LPO的水平。我们发现，用 ML385 抑制 NRF2 可逆转 Locostatin 诱导的 ROS 和 LPO 水平降低。这些发现表明，RKIP抑制可能通过激活NRF2 / HO-1通路来抑制神经元铁死亡（图6A-D）。

数据可用性：
当前研究期间生成的数据集包含在 补充文件 1 中。

图1： 通过血红素刺激的PC12细胞构建体外疾病模型。 （A）血红素刺激的PC12细胞模型构建示意图。（B）使用细胞活力测定法确定体外脑出血模型建立的最佳血红素浓度，以评估细胞活力。（C）用血红素（80μM）处理的PC12细胞在不同时间点进行细胞活力测定。（D，E）用不同血红素浓度处理的PC12细胞中RKIP表达水平的代表性蛋白质印迹分析和定量评估（24小时）。（F，G）不同持续时间暴露于血红素 （80 μM） 的 PC12 细胞中 RKIP 表达水平的代表性蛋白质印迹分析和定量评估。所有数据均以平均值表示±标准差 （n = 3）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。缩写：CCK8 = 细胞计数试剂盒-8;WB = 蛋白质印迹;RKIP = Raf 激酶抑制剂蛋白。请点击此处查看此图的大图。

图2：Locostatin对 血红素刺激的PC12细胞中RKIP表达的影响。（A）PC12细胞中Locostatin治疗实验程序的示意图。（B）使用细胞活力测定评估用不同浓度的Locostatin处理的PC12细胞的细胞活力。（C，D）用蛋白质印迹法分析用血红素（80 μM，24 h）和/或洛司汀（5 μM，24 h）处理的PC12细胞中RKIP的表达，并显示代表性印迹和统计分析。（E）使用RT-qPCR测量用血红素（80μM，24 h）和/或Locostatin（5 μM，24 h）处理的PC12细胞中的RKIP mRNA表达。所有数据均以平均值表示±标准差 （n=3）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。缩写：CCK8 = 细胞计数试剂盒-8;WB = 蛋白质印迹;RT-qPCR = 定量逆转录聚合酶链反应;ROS = 活性氧;LPO = 脂质过氧化。请点击此处查看此图的大图。

图3：RKIP抑制对血红素刺激后PC12细胞铁死亡的影响。（A-E）用血红素（80μM，24小时）和/或洛司汀（5μM，24小时）处理的PC12细胞中ACSL4，GPX4，NRF2和HO-1蛋白表达变化的蛋白质印迹分析。（F-J）用血红素（80 μM，24 h）和/或 Locostatin（5 μM，24 h）处理的 PC12 细胞中 ACSL4、GPX4、NRF2、HO-1 和 FTH1 的 mRNA 表达水平的 RT-qPCR 分析。所有数据均以平均值表示±标准差 （n=3）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。缩写：WB = 蛋白质印迹;RT-qPCR = 定量逆转录聚合酶链反应;RKIP = Raf 激酶抑制剂蛋白;ACSL4 = 酰基辅酶A合成酶长链家族4;GPX4 = 谷胱甘肽过氧化物酶 4;NRF2 = 核因子 E2 相关因子 2;HO-1 = 血红素加氧酶-1;FTH1 = 铁蛋白重链 1。请点击此处查看此图的大图。

图4： RKIP 抑制对血红素刺激后PC12细胞氧化应激的影响。 （A，C）用血红素（80μM，24小时）和/或洛司汀（5μM，24小时）处理的PC12细胞中活性氧产生的流式细胞术分析。（B，D）用血红素（80μM，24小时）和/或洛克抑素（5μM，24小时）处理的PC12细胞中脂质过氧化的流式细胞术分析。所有数据均以平均值表示±标准差 （n = 3）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。缩写：ROS = 活性氧;LPO = 脂质过氧化。 请点击此处查看此图的大图。

图5：NRF2在RKIP抑制介导的抗铁减速作用中的作用。（A）不同条件下处理PC12细胞的实验程序示意图。（B-D）Western blot分析不同处理条件下用血红素（80 μM，24 h）和/或Locostatin（5 μM，24 h）和/或ML385（5 μM，24 h）对PC12细胞中NRF2和HO-1蛋白表达变化的蛋白质印迹分析。（E，F）用血红素（80μM，24小时）和/或洛司汀（5μM，24小时）和/或ML385（5μM，24小时）处理的PC12细胞中NRF2和HO-1的mRNA表达水平的RT-qPCR分析。（G-J）用血红素（80μM，24小时）和/或洛司汀（5μM，24小时）和/或ML385（5μM，24小时）处理的PC12细胞中NRF2和HO-1表达的免疫荧光分析以及平均荧光强度的量化。比例尺 = 50 μm。所有数据均以平均值表示±标准差 （n = 3）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。缩写：WB = 蛋白质印迹;RT-qPCR = 定量逆转录聚合酶链反应;IF染色=免疫荧光染色;NRF2 = 核因子 E2 相关因子 2;HO-1 = 血红素加氧酶-1。请点击此处查看此图的大图。

图 6：NRF2 在抑制 RKIP 抑制 介导的氧化应激中的作用。（A，C）用血红素（80μM，24小时）和/或洛司汀（5μM，24小时）和/或ML385（5μM，24小时）对PC12细胞中活性氧产生的流式细胞术分析。（B，D）用血红素（80μM，24小时）和/或洛司汀（5μM，24小时）和/或ML385（5μM，24小时）处理的PC12细胞中脂质过氧化的流式细胞术分析。所有数据均以平均值表示±标准差 （n = 3）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。缩写：ROS = 活性氧;LPO = 脂质过氧化。请点击此处查看此图的大图。

图7：RKIP抑制通过激活NRF2 / HO-1途径 来减弱自发性ICH后神经元铁死亡的示意图。我们的研究结果表明，RKIP抑制可有效促进NRF2核易位，抑制脂质ROS积累，从而防止血红素诱导的铁死亡和氧化应激。请点击此处查看此图的大图。

表1：定量逆转录-PCR引物。

补充文件 1：支持前六个数字的原始和处理后的定量数据，包括 CCK-8 检测、蛋白质印迹、RT-qPCR 和流式细胞术分析。 数据按图子面板组织，包括用于统计分析的所有重复值。 请点击此处下载此文件。

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或个人关系似乎会影响本文中报告的工作。