一种多模态宽场傅里叶变换拉曼显微镜

摘要

基于紧凑且超稳定的双折射干涉仪的宽场傅里叶变换显微镜，可对二维探测器的所有像素并行采集光谱。该时域方法能够分离光致发光信号与拉曼信号，并实现快速拉曼成像（约5毫秒/像素），空间分辨率约为1 µm，光谱分辨率约为23 cm^-1。

摘要

拉曼显微技术是一种用于确定样品化学成分的强大方法。当前主流的自发拉曼显微镜基于点扫描频率域检测，其主要挑战在于获取大面积拉曼图谱时通常需要较长的像素驻留时间（0.1–1 s），导致效率低下。本文介绍的宽场傅里叶变换（FT）显微镜可实现对大尺寸样品的快速测量，空间分辨率约为1 µm，光谱分辨率约为23 cm^-1。该系统基于一种超稳定且紧凑的共路双折射干涉仪，可集成于商用显微镜的检测光路中，实现二维探测器所有像素点光谱的并行采集，显著缩短测量时间（比传统方法快10–100倍）。这种时域方法还有效解决了频率域技术的另一局限性，即从光致发光背景中分离拉曼信号——在某些情况下，拉曼信号可能被淹没在强烈的荧光背景中。本实验方案详细描述了如何在升级后的商用显微镜上进行高光谱测量，包括照明光路的调节、测量参数的选择标准，以及光谱数据的提取与分析方法。

引言

光谱成像是一种同时提供光谱信息和空间信息的技术，已广泛应用于从显微成像¹到遥感²等多个领域。多光谱成像与高光谱成像的区别在于：前者对二维传感器的每个像素仅记录若干离散的光谱波段，而后者则记录连续光谱。拉曼成像是光谱成像的一种特定实现方式。

拉曼散射显微技术是一种用于测量系统振动频率 ν_R 的强大方法。振动模式与化学键相关，因此拉曼光谱³ 可用于研究生物⁴ 和材料科学⁵ 中样品的化学组成。在自发拉曼光谱中，样品被频率为 ν₀ 的单色辐射照射，该辐射称为 泵浦光。部分泵浦光与振动模式相互作用后可能发生非弹性散射，产生频率为 ν_S (ν_AS)=ν₀-(+) ν_R 的光子，其中 ν_R 是样品内分子的振动频率。能量较低的散射光（ν_S）称为斯托克斯辐射，而能量较高的散射光（ν_AS

方案

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 样品制备

警告：制备过程中需佩戴乳胶手套，因为硫化镉（CdS）颜料具有毒性，尤其是吸入时更为危险。

1. 使用刮刀将每种颜料粉末各 20 mg 置于精密天平上，获得 1:1:1 的质量比例。
   注意：每次取样后需仔细清洁刮刀尖端，以避免交叉污染。
2. 用研钵混合粉末，以去除结块。
3. 将混合后的样品倒入显微镜载玻片上；用刮刀尖轻轻按压，使样品层接近均匀厚度。
4. 在显微镜盖玻片的边缘涂抹指甲油。将盖玻片放置在样品上，指甲油面朝下，施加适当压力以密封样品。静置数秒，使指甲油固化。

2. 显微镜设置

警告：激光开启时请佩戴安全护目镜，因为样品平面上可达到的最大功率为 300 mW。

注意：只要泵浦激光器在数据手册规定的温度范围内工作（例如，本文报道的激光器为10–40 °C），其性能不受温度变化的影响。 材料表).

1. 将TWINS干涉仪沿显微镜的检测光路进行对准。
   ....

结果

图4A展示了粉末混合物选定区域的拉曼成像图。该图是通过MCR-ALS方法获得的丰度分布图的伪彩表示，具体方法如步骤4.5所述。由于在视场内可清晰区分三种物质，因此该图提供了有关样品组成的信息。图4B展示了在成像图选定区域内获得的平均光谱，其光谱分辨率为23 cm^-1，由所选扫描长度决定。所用滤光片组允许测量105–2130 cm^-1范围（补充图2），但仅展示285–750 cm^-1范围，因为该范围内包含用于物质鉴别的主要峰。与文献中的参考光谱^21,22相比，每种颜料的特征峰均可识别（以垂直虚线标示），但由于各物质位置接近甚至重叠，存在交叉污染现象。未显示金红石相在144 cm^-1处的峰，因其强信号会扩散至锐钛矿区域，因而无法有效区分这两种同质多象变体。这可能归因于两种粉末不同的拉曼散.......

讨论

一种宽场傅里叶变换多模态显微镜已被用于获取自发拉曼散射和发光图像，并适用于材料科学领域。Candeo 等人¹⁷展示了其在生物样品中的适用性， 提供了染色人源细胞的高光谱荧光图像。该领域拉曼散射测量的主要挑战是防止因广泛照明区域散热效率低而导致的光损伤。一种可能的解决方案是采用更长的激发波长（例如， 785 nm）以减少光功率吸收，但其缺点是会降低拉曼散射截面。另一种方法是使用水浸物镜，以提高散热效率。

多模态性是时域方法的内在特性。它使得采样策略能够根据所研究的信号（光致发光或拉曼散射）进行选择。为了说明这一概念，回顾傅里叶变换操作的两个性质（见图6）：（1）信号的光谱带宽与其自相关函数（干涉图）的持续时间成反比；（2）由于傅里叶变换算子的线性性质，多个信号线性组合的干涉图等于各个信号对应干涉图的组合。由此可知，持续时间较长的干涉图振荡对应于较窄的光谱特征，而零延迟附近早期的振荡主要来源于宽带光谱成分。因此，仅对干涉图尾部进行采样即可获取关于拉曼峰的信息，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
锐钛矿	Kronos	1200	白色TiO2 颜料的同质多象变体
硫化镉粉末	Kremer Pigmente GmbH & Co.	21060	镉黄，色标深色/PY35
相机	Andor	Luca R	电子倍增CCD相机，像素为1004×1002，每个像素尺寸为8µm × 8µm
滤光片（净化用）	Semrock	LL01-532-12.5	Ø1/2"，在532 nm处带宽为2.0 nm（FWHM）的激光线滤光片
盖玻片	BRAND GmbH & Co	4700 55	硼硅酸盐玻璃显微镜盖玻片，尺寸为22×22×0.15 mm
二向色镜	Semrock	Di02-R532-25x36	25.2×35.6 mm单边激光二向色分光镜，工作波长为532 nm
光纤	Thorlabs	M74L05	纤芯直径400µm，数值孔径NA为0.39的多模光纤
激光器	Hubner Photonics	Cobolt Samba 1000	连续波二极管泵浦激光器，波长532 nm，最大输出功率1000 mW
长通滤光片	Semrock	LP03-532RU-25	在532 nm处具有超陡长通边缘的滤光片
显微镜	Leica	DMRBE	三目研究型显微镜
物镜	Leica	PL-FLUOTAR, 10x/0.30	激发与信号收集用物镜，放大倍数10倍，数值孔径0.3
物镜	Newport	M-10X	照明光路中的物镜，放大倍数10倍，数值孔径0.25
金红石	Kronos	2900	白色TiO2 颜料的同质多象变体
短通滤光片	Thorlabs	FESH600	Ø25.0 mm短通滤光片，截止波长600 nm
载玻片	Marienfeld	1000612	76×26×1 mm显微镜载玻片