本方案介绍了一种高通量、低成本的方法，通过量化果蝇运动功能障碍来评估其神经毒性，作为传统哺乳动物模型的替代方案。该方法旨在利用一种灵敏、可重复且符合伦理要求的模型，评估药物化合物、环境因子或基因修饰的神经毒性效应。
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摘要
摘要
本方案介绍了一种高通量、低成本的方法，通过量化果蝇（Drosophila melanogaster）的运动功能障碍来评估神经毒性。传统的哺乳动物模型虽然有效，但资源消耗大且存在伦理限制，凸显了对替代性体内模型的需求。本方法将经典的攀爬实验与实时监测平台相结合，以捕捉单只果蝇的运动功能损伤。该集成系统提高了检测的灵敏度、自动化程度和可重复性，为神经毒理学筛选提供了一种可扩展的策略。关键实验步骤包括标准化的饲养条件、谨慎的麻醉与操作以尽量减少果蝇死亡率或行为改变，以及系统的正确校准。基于微毛细管的喂食方式可选择性地整合摄食量的定量分析，补充运动行为检测，并在需要时实现对化合物摄入量的评估。该方法支持实时和长期的行为监测，减少观察者偏倚，并可在不中断实验的情况下进行每日进展评估。可通过直接测量方式整合光偏好测试。该平台在行为分辨率、通量和数据一致性方面具有显著优势。尽管缺乏某些替代系统所具备的实时荧光检测能力，其在大规模行为筛选中仍具有高度有效性。本方案特别适用于希望利用灵敏、可重复且符合伦理要求的体内模型，评估药物化合物、环境因子或遗传修饰神经毒性效应的实验室。
引言
评估神经毒性对于评价环境和药物化合物对发育中神经系统潜在不良影响至关重要1。传统的神经毒性检测依赖于哺乳动物模型（如啮齿类动物），这类方法成本高、耗时长，且存在伦理限制2。因此，亟需建立能够快速、高通量筛选神经毒物的替代模型3。研究表明，果蝇由于其遗传背景清晰、神经发育通路保守以及生命周期短，已成为研究神经毒性的有力模式生物4,5。在行为学终点指标中，运动功能障碍是神经发育损伤的一种敏感且可量化的生物标志物，可用于早期检测可能与人类神经系统疾病相关的神经毒性效应6。
果蝇的运动行为检测 可为神经毒性提供可量化的评估指标，并支持剂量-反应关系分析，因此在降低人类神经毒性风险方面具有重要意义7。负向重力趋性实验（爬行实验）是一种广泛应用的方法，该方法通过轻敲使果蝇跌落至试管底部后，观察其本能地向上攀爬的行为，从而反映其运动发育、协调性和平衡能力8,9。尽管该方法操作简单、成本低廉，适用于评估严重的运动功....
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方案
例如，本方案用于评估Physalis physalis毒液组分的神经毒性潜力。对照组仅接受生理缓冲液和蔗糖溶液，不含待测化合物。所有实验均在W118 品系上进行。由于果蝇不属于动物护理法规的适用范围，因此开展果蝇实验无需伦理审批。
1. 试剂与样品制备
- 根据特定实验的要求，准备生物缓冲液，如 PBS（10 mM，pH 7.0）或 HEPES（10 mM，pH 7.0），以及 10 M 蔗糖储备液。根据重复次数和实验持续时间计算样品体积。
- 使用生物缓冲液将样品稀释至所需浓度，并加入蔗糖溶液，使其终浓度为 1 M。如果样品透明，可添加适量食用染料（例如 0.1 mg/mL 蓝色或红色染料），以便直观评估摄食行为。在本研究中，Physalia physalis 的毒液组分使用 PBS 稀释至终浓度为 10 µg/µL，并进一步添加蔗糖溶液和食用染料。
- 制备仅含缓冲液的阴性对照溶液，并加入蔗糖使其终浓度为 1 M，同时加入食用染料。在本研究中，使用添加了蔗糖和食用染料的 PBS 作为阴性对照溶液。
- 对于果蝇培养基，请遵循文献18中提供的方案。
2. 生物材料的保藏<....
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结果
例如，本方案可用于评估Physalis physalis毒液组分的神经毒性潜力。处理组果蝇饲喂含有生理缓冲液和蔗糖溶液（终浓度最高达1 M）并添加待测毒液组分的饲料，对照组则仅给予生理缓冲液和蔗糖溶液，不添加待测化合物。所有实验均使用W118品系果蝇进行。
在所述方法中，未经处理的果蝇作为对照组，表现出典型的运动和攀爬行为（阴性表型），而暴露于毒性组分的果蝇则为处理组（阳性表型），常表现出运动能力受损。代表性结果包括攀爬速度降低、到达攀爬标记所需时间延长，以及平台记录的总移动距离减少。
使用负向趋地性实验评估爬行能力。本研究中，如图1所示，在24小时时，处理组果蝇的爬行效率与对照组相似（对照组：7.33 ± 2.69 s；处理组：6.71 ± 3.2 s）。然而，在48小时时，处理组果蝇表现出显著延迟，到达顶部所需时间几乎为对照组的2倍（对照组：6.57 ± 3.41 s；处理组：13.91 ± 2.99 s；***p .......
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讨论
首先，确定一个非致死性（亚致死）剂量是开展神经毒性实验的关键初始步骤。这可确保果蝇在整个研究过程中保持存活，从而能够在无死亡干扰因素的情况下观察其行为和运动功能的变化。在本研究中，Physalia physalis 毒液组分的亚致死剂量确定为 10 µg/µL。为确保结果的稳健性和可重复性，建议每个处理组至少进行三次生物学重复，每次包含十只果蝇，并至少进行三次技术重复。这相当于每种实验条件至少需要 30 只果蝇，并在三次独立实验中进行测试。该设计可增强统计效能并减少变异性，从而更可靠地检测由处理引起的行為变化。本方案采用多组数据构建图表，展示了该方法在检测神经毒性改变方面的敏感性。实验初期死亡的果蝇以及统计学上的离群值应予以剔除，以确保数据的准确性。收集大量数据集有助于获得更精确和可靠的结果，进而促进对细微神经毒性效应的检测。
本实验方案的关键步骤在于正确的果蝇操作和实验设置，以确保实验的可重复性和准确性。果蝇必须在标准化条件下培养，以保证其年龄、遗传背景和健康状况的一致性1。麻醉处理尤为敏感：冰上暴露超过10分钟会.......
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披露
作者 Zuzanna Tomkielska 受雇于 Mesosystem S.A.，作者 Ana Casas 也隶属于 Mesosystem S.A。其余作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
本研究由欧洲经济区资助计划项目 MOD.PN.FRM.059.PT.V03——“Physalia physalis：一种创新且未被开发的高附加值化妆品来源”资助；由“蓝色生物经济协议”（项目编号：C644915664-00000026）中的 WP5——“藻类垂直利用”项目资助，该项目由欧盟下一代欧洲基金和葡萄牙复苏与韧性计划（PRR）资助；以及由科学技术基金会（FCT）通过 CBA 项目（UIDB/05292/2020 和 UIDP/05292/2020）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 铝箔 | - | - | |
| 蓝色染料 | RAYNER | - | Rayners 蓝色染料 28ml |
| 摄像头模块 2 NoIR | Raspberry Pi | 096-4062 | 由 Mauser.pt 提供 |
| 棉条 | Sigma-Aldrich | BR28205 | |
| 果蝇培养瓶 | VWR | VWRI734-1249 | 圆形果蝇瓶 60Z |
| 果蝇培养管 | VWR | WRI734-2255 | |
| 玻璃培养皿 | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| 微量毛细管（血细胞比容管） | Sigma-Aldrich | BR749321 | |
| Micro SD 卡 | - | - | 制造商建议在安装 Raspberry Pi 操作系统时使用至少 32GB 存储容量的 SD 卡 |
| Micro-USB 电源适配器 | Raspberry Pi | 096-4585 | 由 Mauser.pt 提供 |
| 矿物油 | BIO-RAD | #1632129 | |
| 画笔 | - | - | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 组分来自不同公司 | - | 用于配制对照组食物及样品稀释的缓冲液；10 mM，pH 7 |
| 果蝇培养管和培养瓶用塞子 | VWR | VWRI734-2875 | |
| 果蝇培养管和培养瓶用塞子 | VWR | VWRI734-2673 | |
| 密封膜 | Sigma-Aldrich | HS234526C | |
| 单板计算机 （3 Model B） | Raspberry Pi | 096-5700 | 由 Mauser.pt 提供 |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 透明塑料吸管 | - | - | 任何与 Ethoscopic 睡眠实验装置兼容的吸管（6.5 cm × 0.5 cm） |
参考文献
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H.
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重印与许可
