Drosophila melanogaster 运动功能障碍的行为学分析作为神经毒性的检测指标

摘要

本方案介绍了一种高通量、低成本的方法，通过量化果蝇运动功能障碍来评估其神经毒性，作为传统哺乳动物模型的替代方案。该方法旨在利用一种灵敏、可重复且符合伦理要求的模型，评估药物化合物、环境因子或基因修饰的神经毒性效应。

摘要

本方案介绍了一种高通量、低成本的方法，通过量化果蝇（Drosophila melanogaster）的运动功能障碍来评估神经毒性。传统的哺乳动物模型虽然有效，但资源消耗大且存在伦理限制，凸显了对替代性体内模型的需求。本方法将经典的攀爬实验与实时监测平台相结合，以捕捉单只果蝇的运动功能损伤。该集成系统提高了检测的灵敏度、自动化程度和可重复性，为神经毒理学筛选提供了一种可扩展的策略。关键实验步骤包括标准化的饲养条件、谨慎的麻醉与操作以尽量减少果蝇死亡率或行为改变，以及系统的正确校准。基于微毛细管的喂食方式可选择性地整合摄食量的定量分析，补充运动行为检测，并在需要时实现对化合物摄入量的评估。该方法支持实时和长期的行为监测，减少观察者偏倚，并可在不中断实验的情况下进行每日进展评估。可通过直接测量方式整合光偏好测试。该平台在行为分辨率、通量和数据一致性方面具有显著优势。尽管缺乏某些替代系统所具备的实时荧光检测能力，其在大规模行为筛选中仍具有高度有效性。本方案特别适用于希望利用灵敏、可重复且符合伦理要求的体内模型，评估药物化合物、环境因子或遗传修饰神经毒性效应的实验室。

引言

评估神经毒性对于评价环境和药物化合物对发育中神经系统潜在不良影响至关重要¹。传统的神经毒性检测依赖于哺乳动物模型（如啮齿类动物），这类方法成本高、耗时长，且存在伦理限制²。因此，亟需建立能够快速、高通量筛选神经毒物的替代模型³。研究表明，果蝇由于其遗传背景清晰、神经发育通路保守以及生命周期短，已成为研究神经毒性的有力模式生物^4,5。在行为学终点指标中，运动功能障碍是神经发育损伤的一种敏感且可量化的生物标志物，可用于早期检测可能与人类神经系统疾病相关的神经毒性效应⁶。

果蝇的运动行为检测 可为神经毒性提供可量化的评估指标，并支持剂量-反应关系分析，因此在降低人类神经毒性风险方面具有重要意义⁷。负向重力趋性实验（爬行实验）是一种广泛应用的方法，该方法通过轻敲使果蝇跌落至试管底部后，观察其本能地向上攀爬的行为，从而反映其运动发育、协调性和平衡能力^8,9。尽管该方法操作简单、成本低廉，适用于评估严重的运动功能异常和明显的运动障碍，但它仅能对运动行为进行一维评估，在检测由神经毒性物质引起的细微运动损伤、精细行为改变以及长期行为监测方面可能存在敏感性不足的问题⁸。为克服这些局限性，已开发出更先进的运动追踪技术，例如 Ethoscope 系统¹⁰。该自动化记录系统是一种高通量视频追踪装置，专为高精度、高重复性地分析果蝇行为而设计¹¹。与传统的运动行为检测方法不同，该系统可实现对运动行为的连续、实时监测，能够捕捉传统爬行实验可能忽略的细微行为异常^11,12,13。该技术采用红外照明摄像系统进行自动化视频追踪，以高分辨率持续记录果蝇的运动轨迹，从而消除观察者偏倚，提高实验的可重复性¹³。此外，系统还能检测微小动作，区分行走、静止以及理毛、摄食或抽搐等精细动作，从而对运动行为进行更详尽的分析¹³。该系统支持长期行为监测，可实现长时间连续追踪，非常适合用于评估渐进性神经毒性效应¹⁰。视频记录系统的可扩展性和高通量能力使其能够同时追踪多只果蝇，便于并行筛选多种神经毒性化合物和遗传条件¹⁰。此外，该系统集成了开源软件，研究人员可根据实验需求自定义分析流程，包括睡眠-觉醒周期、昼夜节律以及详细的运动行为参数分析^10,14。近年来的技术进展，例如整合基于 Python 的 Ethoscopy 分析框架，进一步提升了数据分析能力，增强了行为学研究的可及性和可重复性¹⁴。该框架使研究人员能够开展更复杂的运动行为分析，同时降低了非专业用户的使用门槛。基于 Jupyter 的 ethoscope-lab 环境进一步促进了数据处理的无缝衔接，推动了协作研究，并确保了实验结果的可重复性¹⁴。

通过结合高通量视频追踪平台与传统的攀爬实验，本研究对发育期神经毒性暴露后出现的运动功能障碍进行了全面且灵敏的评估。该方法能够分析细微的运动缺陷，因而成为筛选干扰神经发育和运动协调化合物的有力工具。与脊椎动物模型相比，利用果蝇进行神经毒性筛选具有多项优势，包括成本低廉和高通量能力；而在脊椎动物模型中，大规模筛选常因成本限制而难以开展¹⁵。果蝇模型可实现快速的遗传操作，以模拟疾病状态并鉴定受神经毒素影响的分子通路¹⁶。尽管果蝇神经系统较哺乳动物简单，但仍保留了参与神经发育和运动控制的关键保守通路¹⁷。诸如实时视频记录系统等高分辨率追踪技术可提高数据的准确性和可重复性，从而实现对毒性暴露所致早期运动功能缺陷的检测¹¹。

追踪技术与传统攀爬实验的结合实现了连续、高分辨率的行为监测，为检测神经毒性物质暴露引起的细微运动功能障碍提供了一种可靠且可扩展的方法。果蝇凭借其丰富的遗传工具、较短的生命周期以及先进的行为分析手段，成为用于神经毒性筛选的强有力替代性非脊椎动物模型，最终有助于更安全的药物开发和更完善的环境风险评估。

方案

例如，本方案用于评估Physalis physalis毒液组分的神经毒性潜力。对照组仅接受生理缓冲液和蔗糖溶液，不含待测化合物。所有实验均在W¹¹⁸ 品系上进行。由于果蝇不属于动物护理法规的适用范围，因此开展果蝇实验无需伦理审批。

1. 试剂与样品制备

1. 根据特定实验的要求，准备生物缓冲液，如 PBS（10 mM，pH 7.0）或 HEPES（10 mM，pH 7.0），以及 10 M 蔗糖储备液。根据重复次数和实验持续时间计算样品体积。
2. 使用生物缓冲液将样品稀释至所需浓度，并加入蔗糖溶液，使其终浓度为 1 M。如果样品透明，可添加适量食用染料（例如 0.1 mg/mL 蓝色或红色染料），以便直观评估摄食行为。在本研究中，Physalia physalis 的毒液组分使用 PBS 稀释至终浓度为 10 µg/µL，并进一步添加蔗糖溶液和食用染料。
3. 制备仅含缓冲液的阴性对照溶液，并加入蔗糖使其终浓度为 1 M，同时加入食用染料。在本研究中，使用添加了蔗糖和食用染料的 PBS 作为阴性对照溶液。
4. 对于果蝇培养基，请遵循文献¹⁸中提供的方案。

2. 生物材料的保藏

1. 将健康且性成熟的成虫转移至含有新鲜培养基的培养瓶中。操作时，轻敲培养瓶使果蝇沉至瓶底，打开瓶盖，通过倒置培养瓶的方式将果蝇转移至另一含有培养基的新瓶中。将培养瓶置于设定为25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环、相对湿度50%的培养箱中。让果蝇过夜产卵（约16–22小时），以收集足够数量的同步化卵。
2. 产卵结束后，使用一个含有70%乙醇的新培养瓶将成虫弃除。此步骤可防止进一步产卵，并确保果蝇群体年龄同步，这对于获得年龄差异最小的成虫群体至关重要。
3. 为保证发育的一致性，将培养瓶持续维持在相同的受控条件下（25 °C，12小时光照/12小时黑暗循环，50%湿度）。成虫通常在第9至第10天左右开始羽化。监测发育进程有助于准确预测成虫羽化的时间。
4. 将收集的果蝇在相同受控条件下继续培养，直至达到实验所需的年龄。建议在羽化后24–48小时内使用。这种受控的衰老过程有助于最小化个体间变异，提高实验结果的可靠性。

3. 负向重力趋性实验

注意：负向重力趋性实验的示意图见补充图1。

1. 实验当天，将果蝇轻轻转移至一个空瓶中。
2. 在转移前，需将果蝇短暂置于冰上麻醉，以减少活动和操作应激。为此，将装有果蝇的瓶子放入盛有冰的容器中，确保整个瓶子被冰覆盖。
3. 1分钟后，轻敲瓶子以确认所有果蝇均已麻醉。继续将其保持在冰上1分钟，以确保完全麻醉，同时避免引起应激或影响其攀爬能力。
   注意：需注意某些麻醉剂（如CO₂）可能会影响后续行为，包括导致攀爬行为受损，从而影响负向趋地性实验的结果。
4. 在果蝇处于麻醉状态时，准备一个较小的容器并装满冰，在冰上放置培养皿或平坦洁净的表面，形成一个低温操作平台。该装置有助于在分选过程中维持麻醉状态，并减少果蝇苏醒后的活动。
5. 在冰上放置2分钟后，通过确认果蝇完全不动来评估麻醉效果。待果蝇完全麻醉后，将装有果蝇的管子倒置在低温培养皿上方，轻敲使其掉落。冷表面有助于在操作过程中保持果蝇的静止状态。
6. 使用细毛笔并在体视显微镜下（如有，使用10倍或20倍放大倍数），根据体型大小和色素分布等特征，轻轻分离雄性和雌性果蝇。雄性通常体型较小，腹部有宽大的黑色条带；雌性则体型较大，腹部较浅且细长。此步骤应尽快完成，以尽量减少麻醉对果蝇的影响。
   注意：若实验无需区分性别，可省略分选步骤。应尽量缩短暴露时间，并轻柔操作果蝇，以减少应激和潜在的行为改变。
7. 将分选好的果蝇小心转移至标记清晰的空试管中。在受控环境（25 °C，12小时光照/12小时黑暗循环，50%湿度）中恢复约30分钟，再进行后续实验。
8. 制备微量毛细管饲喂液时，使用移液器将10 µL测试溶液手动加入每根微量毛细管中。确保所有样品的体积一致，以标准化饲喂条件。
9. 使用移液器，在微量毛细管的开口端加入3–5 µL矿物油。此举可防止实验过程中样品蒸发或泄漏。
10. 将预先装好液体的微量毛细管插入棉塞上的孔中，确保其稳固放置。如有需要，可使用预先剪裁的管尖，使其紧密贴合棉塞而不阻碍通气。
11. 将装有果蝇的试管放入设定为25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的培养箱中。在整个实验期间保持此条件，并每天手动更换为新制备的含食物毛细管，以确保持续且一致的暴露。暴露时间取决于样品的毒性和性质，通常持续2至7天。
12. 每隔12小时，将果蝇转移至干净的空试管中，以评估其运动活性。
13. 使用永久性记号笔在试管底部上方7 cm处画一条标记线，作为攀爬目标高度。
14. 将相机或手机固定在稳定位置，用于记录攀爬行为。确保光照充足，背景透明，便于后续分析。确认实验装置处于相机视野范围内。
15. 轻敲试管，使果蝇全部落至底部，然后立即开始录像。避免用力过猛，以免损伤或使果蝇迷失方向。
16. 回放录像，测量每只果蝇到达7 cm标记线所需的时间。设定最长时限（例如30秒）；对于未能到达标记线的果蝇，其时间记为该上限值。
17. 密切观察是否存在异常行为，例如动作不协调、攀爬启动延迟或攀爬模式异常。这些表现可能提示受试化合物具有神经毒性作用。
    注意：有关饲喂液制备的详细说明，请参阅毛细管饲喂（CAFE）实验方案¹⁹。该方法为果蝇液体食物来源的制备提供了精确指导，可准确量化摄食量，并减少饲喂实验中的变异性。

4. 实时监测实验

注意：有关实验装置，包括追踪系统组件的示意图及校准方案，请参考先前发表的文献^11,12。实验的总体概述见补充图2。

1. 实时运动行为检测（追踪检测）
   1. 重复步骤 3.8–3.9，用样品填充微毛细管，并以矿物油密封。
   2. 使用透明塑料吸管制备独立的运动检测室，每根吸管长约 6 cm。这些吸管成本低且透明，适用于行为记录。吸管应与睡眠检测装置¹¹兼容，该装置可容纳 20 根吸管，适用于高通量行为研究。
   3. 用透明薄膜密封每根吸管的一端，确保密封严密不漏气。在密封端附近开一个小孔，用于插入喂食微毛细管。确保小孔大小适中，能牢固固定微毛细管，避免检测过程中发生泄漏或移动。
   4. 重复步骤 3.1–3.6，麻醉果蝇，可选择性地进行分选，并使用细毛刷将一只麻醉后的果蝇轻柔地放入每根吸管中。用透明薄膜或棉塞密封吸管的开口端，确保空气流通并防止果蝇逃逸。
   5. 将组装好的吸管放入检测装置中，确保每根微毛细管的末端露在外部，以便每日更换。将预先装好食物的微毛细管插入每根吸管中。让果蝇恢复并适应环境约 30 分钟，然后开始检测。
   6. 将装置置于环境条件受控的培养室中（例如 25 °C、12 h 光照/12 h 黑暗循环、50% 湿度）。将设备连接至网络或本地追踪系统。
   7. 登录平台并定位实验所分配的设备。确保系统能够准确追踪每只果蝇，表现为屏幕上出现标记。输入所有相关的实验元数据，并开始记录检测数据。对于高级数据分析，可使用 rethomics 框架，这是一个专为高通量行为数据分析设计的 R 软件包^11,12。
   8. 每天更换微毛细管中的食物，使用新配制的溶液。每天目视检查每只果蝇，确保其在整个实验期间（通常持续 3 至 5 天）存活且行为正常。
2. 昼夜节律评估
   1. 为研究果蝇的昼夜节律及其可能的变化，确保实验开始时与特定的光照/黑暗周期同步。在整个记录阶段维持 12 h 光照/12 h 黑暗的光周期，以避免干扰内源性节律。设定条件后，重复步骤 4.1.1–4.1.8，确保所有操作在光照/黑暗周期的各个阶段保持一致。
3. 光照/黑暗偏好行为评估
   1. 重复步骤 3.1–3.11，准备果蝇和喂食用微毛细管。
   2. 喂食管准备完成后，将其放入培养箱中，使果蝇摄取待测样品 2 小时（或根据先前的运动活性数据确定的其他时长）。
   3. 为评估光照偏好行为，使用铝箔包裹每根吸管的 50%，以形成明确的黑暗区域。确保所有吸管的铝箔覆盖范围一致，以便进行标准化比较。
   4. 重复步骤 4.1.2–4.1.4，将果蝇单独转移至运动检测室，但省略微毛细管的插入。
   5. 将准备好的吸管放入检测装置中，让果蝇适应环境约 30 分钟。
   6. 重复步骤 4.1.6–4.1.7，并记录果蝇行为 60 分钟。若某些吸管中记录到运动减少，可能表明果蝇具有避光偏好，因为追踪系统无法检测位于铝箔覆盖区域内的果蝇，从而提示该区域存在遮挡。

5. 数据分析

1. 通过包含所有必要信息（如 ID、处理方式、化合物详情、检测持续时间及其他相关变量）来准备元数据模板。补充表 1 中提供了模板示例及相应的数据处理流程。
2. 将完成的元数据文件保存为 CSV 格式。为确保兼容性，请在文本编辑器中打开该 CSV 文件，检查其是否包含不必要的字符或格式问题。如存在多余字符，应予以删除。
3. 在进行数据分析之前，创建数据备份。打开终端并执行以下命令：sudo python backup_tool.py。此步骤可防止数据分析过程中发生数据丢失或损坏。
4. 识别并记录与实验对应的数据文件所在位置。确保这些文件可被访问以供分析。
5. 使用 Rethomics 进行数据分析。打开 RStudio 并加载用于行为数据分析的必要 Rethomics 软件包。详细说明和教程可在 Rethomics 网站获取： https://rethomics.github.io/scopr.html

结果

例如，本方案用于评估Physalis physalis毒液组分的神经毒性潜力。处理组果蝇饲喂含有蔗糖溶液（终浓度最高达1 M）和待测毒液组分的生理缓冲液，对照组则仅给予生理缓冲液和蔗糖溶液，不添加待测化合物。所有实验均使用W¹¹⁸品系果蝇进行。

在所述方法中，未经处理的果蝇作为对照组，表现出典型的运动和攀爬行为（阴性表型），而暴露于毒性组分的果蝇则为处理组（阳性表型），常表现出运动能力受损。代表性结果包括攀爬速度降低、到达攀爬标记所需时间延长以及平台记录的总移动距离减少。

使用负向趋地性实验评估攀爬能力。本研究中，如图1所示，在24小时时，处理组果蝇的攀爬效率与对照组相似（对照组：7.33 ± 2.69 秒；处理组：6.71 ± 3.2 秒）。然而，在48小时时，处理组果蝇表现出显著延迟，到达顶端所需时间几乎是对照组的2倍（对照组：6.57 ± 3.41 秒；处理组：13.91 ± 2.99 秒；***p &l...

讨论

首先，确定一个非致死性（亚致死）剂量是开展神经毒性实验的关键初始步骤。这可确保果蝇在整个研究过程中保持存活，从而能够在无死亡干扰因素的情况下观察其行为和运动功能的变化。在本研究中，Physalia physalis 毒液组分的亚致死剂量确定为 10 µg/µL。为确保结果的稳健性和可重复性，建议每个处理组至少进行三次生物学重复，每次包含十只果蝇，并至少进行三次技术重复。这相当于每种实验条件至少需要 30 只果蝇，并在三次独立实验中进行测试。该设计可增强统计效能并减少变异性，从而更可靠地检测由处理引起的行為变化。本方案采用多组数据构建图表，展示了该方法在检测神经毒性改变方面的敏感性。实验初期死亡的果蝇以及统计学上的离群值应予以剔除，以确保数据的准确性。收集大量数据集有助于获得更精确和可靠的结果，进而促进对细微神经毒性效应的检测。

本实验方案的关键步骤在于正确的果蝇操作和实验设置，以确保实验的可重复性和准确性。果蝇必须在标准化条件下培养，以保证其年龄、遗传背景和健康状况的一致性¹。麻醉处理尤为敏感：冰上暴露超过10分钟会...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
铝箔	-	-
蓝色染料	RAYNER	-	Rayners 蓝色染料 28ml
摄像头模块 2 NoIR	Raspberry Pi	096-4062	由 Mauser.pt 提供
棉条	Sigma-Aldrich	BR28205
果蝇培养瓶	VWR	VWRI734-1249	圆形果蝇瓶 60Z
果蝇培养管	VWR	WRI734-2255
玻璃培养皿	Sigma-Aldrich	BR455701
微量毛细管（血细胞比容管）	Sigma-Aldrich	BR749321
Micro SD 卡	-	-	制造商建议在安装 Raspberry Pi 操作系统时使用至少 32GB 存储容量的 SD 卡
Micro-USB 电源适配器	Raspberry Pi	096-4585	由 Mauser.pt 提供
矿物油	BIO-RAD	#1632129
画笔	-	-
磷酸盐缓冲液（PBS）	组分来自不同公司	-	用于配制对照组食物及样品稀释的缓冲液；10 mM，pH 7
果蝇培养管和培养瓶用塞子	VWR	VWRI734-2875
果蝇培养管和培养瓶用塞子	VWR	VWRI734-2673
密封膜	Sigma-Aldrich	HS234526C
单板计算机 （3 Model B）	Raspberry Pi	096-5700	由 Mauser.pt 提供
蔗糖	Sigma-Aldrich	S9378
透明塑料吸管	-	-	任何与 Ethoscopic 睡眠实验装置兼容的吸管（6.5 cm × 0.5 cm）