体内共聚焦显微镜是一种具有高分辨率的有前景的成像技术。本文介绍了临床医生用于在眼睑边缘活体检测毛囊蠕形螨（Demodex）的操作步骤。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
毛囊蠕形螨 螨虫感染可引起睑缘炎症， 毛囊蠕形螨 睑缘炎在临床病例中可能引发一系列眼部疾病。许多医生诊断眼部寄生虫感染时 毛囊蠕形螨 通过睫毛拔除术获取螨虫并在光学显微镜下观察睫毛 体外然而，睫毛拔除后残留螨虫的存在以及该操作带来的疼痛感是标准临床护理的局限性。
体内共聚焦显微镜（IVCM）是一种非侵入性成像技术，可使临床医生无需拔除睫毛即可详细观察睑缘处的毛囊蠕形螨。该技术可实现无痛分析，整个检查可在<30分钟内完成。尽管该检查方法正受到越来越多的关注，但对于缺乏丰富经验的眼科医生而言，可能难以掌握。本文提供了一套标准化操作流程，用于通过IVCM对睑缘处的毛囊蠕形螨进行可视化观察，以促进该技术在临床工作中的推广应用。
引言
睑缘炎是临床实践中最常见的眼科诊断之一。证据表明，睑缘炎的发生与某些因素存在显著关联。 毛囊蠕形螨 螨虫 和睑缘炎1螨虫的侵染既包括由螨虫直接造成的损害 毛囊蠕形螨2 及其分泌物引发的免疫反应，这些分泌物可能发挥作用 作为细菌的载体，并可能促进睑缘炎的发展3. 毛囊蠕形螨 睑缘炎（DB）可引发一系列不良后果，包括角膜及眼表损伤1，对患者的生活质量产生负面影响4,5.
Demodex 是一种寄生性螨虫，栖居于毛囊和皮脂腺内及其邻近区域6。在睫毛毛囊内或周围检测到Demodex有助于诊断蠕形螨睑缘炎（DB）7。临床上诊断DB通常采用睫毛拔除术，并在光学显微镜下观察Demodex。然而，已知许多位于毛囊深部的螨虫在拔除睫毛后仍可能残留在毛囊口8,9,10，可能导致螨虫数量被低估。活体共聚焦显微镜（IVCM）是眼科中一种非侵入性成像工具，可作为在活体状态下可视化睫毛毛囊内或周围Demodex的替代方法11。该技术能够以类似组织学的分辨率观察眼表及眼睑的微细结构11。螨虫可根据其典型形态和活动性进行肉眼识别。然而，对于缺乏该成像技术丰富经验的眼科医生而言，IVCM可能存在一定的技术操作难度12。
为了促进共焦显微内镜（IVCM）在常规临床应用中的普及，包括 健康眼睑及DB的鉴别诊断与随访，我们提出一种用于观察的标准操作程序（SOP） 毛囊蠕形螨 睑缘螨虫检测。本方案为临床医生提供了一套系统的螨虫检测方法 体内.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案重点介绍使用共焦激光显微镜（IVCM）观察睑缘Demodex的标准化操作程序（SOP）（图1）。本研究已获温州医科大学附属眼视光医院伦理审查委员会（IRB）批准（IRB批准编号：H2023-022-K-20），由于本研究为回顾性分析，因此豁免了个人知情同意要求。本方案所描述的操作步骤参考了既往已发表的相关描述11,13,14,15,16。
图1：共焦激光扫描断层成像仪。 请点击此处查看此图的放大版本。
1. 准备设备和程序
- 打开计算机。
- 桌面出现后，将设备背面的摇杆开关从 O 切换到 I。启动任何检查前，请查看摇杆开关是否有绿色亮光，以确认设备已通电。
注意：在启动计算机之前先打开设备可能导致连接失败。 - 启动软件并在检查前设置程序参数。在 设置 菜单，选择 选项 (补充文件1：补充图S1）；然后，检查 显示图像编号 用于显示每张图像的图像编号。此外，检查 退出时显示信息 为防止软件意外关闭，请使用该盒子。
注意：将图像缩略图显示为大图标有助于直接观察结果。请勿频繁更改设置。
- 桌面出现后，将设备背面的摇杆开关从 O 切换到 I。启动任何检查前，请查看摇杆开关是否有绿色亮光，以确认设备已通电。
- 检查前的准备工作
- 使用镜头清洁湿巾清洁镜头。用浸有酒精的棉球对额托和颏托进行消毒，以避免因被污染的设备部件传播病原微生物而导致感染。
- 调整颏托。确保颏托的水平位置正确：按压两个黑色杠杆，将颏托向前拉出，直至其卡入到位。
- 向后移动相机。转动调节螺丝，确保在检查前使其远离患者。
- 在设备显微镜镜头的前表面涂抹一滴（约0.02 mL）以卡波姆为基础的眼用凝胶作为接触凝胶。
注意：确保耦合剂中无气泡，且仅使用少量。若在设备物镜前端涂抹过多耦合剂，可能流入物镜内部并附着于机械部件，导致设备损坏。 - 从保护盖中取出一个无菌的一次性聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）帽，用手稳固按压帽的两侧，将其固定在设备的显微镜镜头上，注意不要触碰帽的前表面图2).
注意：为确保PMMA帽正确贴合，请确认耦合剂与帽的后表面接触且无气泡。帽应储存在专用容器中，以防止无菌包装受损。包装破损的帽不得使用，以免在检查过程中带来感染风险。 - 在帽的前表面涂抹一滴凝胶型人工泪液，作为帽与眼睑之间的凝胶桥梁（图2).
注意：为避免混淆不同凝胶，我们在两种应用中均使用同一种基于卡波姆的眼用凝胶：既作为人工泪液凝胶，也作为显微镜镜头与盖帽之间介质的凝胶。 - 创建新的患者档案或选择现有的患者档案。
图2：PMMA盖帽的正确安装与凝胶涂覆。 请点击此处查看该图的放大版本。
2. 准备患者
注意：如果角膜完整性存疑，则不要进行此项检查。
- 为了获得患者的配合并尽量减少潜在风险，请向患者说明以下事项：
- 向患者保证，尽管设备会接触眼睑，但使用该设备进行检查是安全的。告知患者，将在眼睑边缘滴入一滴局部麻醉剂以进行麻醉。
- 开始检查时，请患者将下巴置于下巴托上，并在整个检查过程中前额紧贴额托，以获得最佳图像质量。
- 告知患者，设备将逐渐靠近其眼睑，直至聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）帽接触眼睑。向患者保证，设备接触眼睑时不会感到疼痛，但会感觉到PMMA帽的接触。若检查过程中感到任何疼痛，请立即告知临床医生。
- 告知患者，在临床医生采集眼睑边缘图像以观察毛囊蠕形螨（Demodex）时，必须保持目光稳定。若患者感到任何疲劳，请其立即告知临床医生；检查将暂停，允许患者坐直休息片刻后再继续。检查结束后，会及时告知患者。
- 遵循局部麻醉剂和/或眼用凝胶包装上的使用说明，避免药物禁忌。询问患者是否有任何过敏史，以确认其过敏情况不属于该局部麻醉剂和/或眼用凝胶的禁忌证。
注意：由于存在未识别的过敏原，可能会发生对局部麻醉剂和/或眼用凝胶的过敏反应。 - 在待检查眼睑的边缘滴入一滴盐酸丙帕他卡因（Proparacaine hydrochloride）局部麻醉剂。
注意：若发生过敏反应，应立即用生理盐水冲洗。
3. 进行检查
- 先观察右眼。从操作者的视角，将扫描相机向左移动。OD 将通过相机的左右识别功能在 设置 区域中自动选定。
- 将 CCD 相机向左移动。旋转 CCD 相机的物镜，使 CCD 相机的图像（控制图像）与扫描激光相机的光轴垂直。
- 开始一项新的检查。
- 观察 检查数据 对话框，在 检查数据 选项卡中，从 设备 下拉列表中选择 Heidelberg Retina Tomograph-Cornea（补充文件 1：补充图 S2），并观察随之出现的 角膜模块设置 对话框。
- 从 视野镜 下拉列表中选择 FOV 400，然后点击 确定 进行确认（补充文件 1：补充图 S3）。
- 等待 采集窗口 打开；此时将显示扫描激光相机的实时图像和控制图像。如果未显示控制图像，请确保 CCD 相机电缆已正确连接至 CCD 相机，然后重新启动 采集窗口。
- 在 采集窗口 中设置参数（补充文件 1：补充图 S4）：从 CCD 缩放倍数 下拉列表中选择 1x，以设定控制图像的大小。勾选 自动亮度 和 自动 选项，以自动调节实时图像和控制图像的亮度。若自动亮度控制已关闭，则使用滑块手动调节控制图像和实时图像的亮度。确认已选择 截面 扫描类型，以便每次按下脚踏开关时获取并保存单幅图像。
- 获取参考图像。
- 开始采集前，关闭自动亮度控制，并将滑块向左移动以调节图像亮度。使用调节针调整焦平面，使扫描激光相机实时图像中先出现暗区，随后出现初始的强反射，表明已对准 PMMA 接触帽的前表面。
注：显微镜允许进行 10 µm 的焦距调节。 - 点击 焦点位置 [µm] 区域中的 重置 按钮，等待 焦点位置 [µm] 的数值变为 0；当前图像即被标记为参考图像。关闭 自动重置，并勾选 自动亮度 选项；实时图像的亮度将被自动控制。
- 如果 焦点位置 [µm] 区域中显示的是虚线而非数值，或尽管调整了焦平面但显示数值无变化，请确保显微镜镜头电缆已正确连接。
注：焦点位置 [µm] 在测厚过程中以微米为单位显示当前图像的焦平面位置。若后续移动焦平面，实际焦平面位置将相对于参考图像的位置进行计算。
- 开始采集前，关闭自动亮度控制，并将滑块向左移动以调节图像亮度。使用调节针调整焦平面，使扫描激光相机实时图像中先出现暗区，随后出现初始的强反射，表明已对准 PMMA 接触帽的前表面。
- 调节检查台的高度以适应患者。让患者将下巴置于下巴托上，前额紧贴额托（图 3A,B）。通过设备上指定的黑色调节螺钉调节下巴托的高度，使患者的上眼睑与头托柱上的红色标记对齐。
- 嘱患者注视前方固定光源并保持凝视稳定（图 3A,B）。
注：图像采集过程中眼球移动可能导致图像质量下降，并可能损伤眼表。 - 使用棉签翻转上眼睑，充分暴露睫毛根部和睑缘。通过旋转设备的调节螺钉，将激光束的反射点对准患者上眼睑水平位置。缓慢将扫描激光相机向患者上眼睑边缘移动，直至其垂直轻触 PMMA 接触帽中心（图 3C）。若患者报告不适，应暂停操作并检查 PMMA 接触帽的对位情况。
注：切勿对患者眼睑施加过大压力。若因接触凝胶桥不足、患者眼球或头部移动，或操作者相机移动过猛，导致 PMMA 接触帽与眼睑接触，可能损伤眼表和眼睑。 - 通过睑缘微小的水平移动，从颞侧向鼻侧仔细扫描睫毛根部，以便评估睫毛及其毛囊。通过顺时针或逆时针旋转设备的显微镜镜头进行扫描并采集图像，逐步调节焦平面以观察整个毛囊和睫毛根部，并记录扫描激光相机实时图像中显示的不同深度。每眼采集六至十个睫毛毛囊的图像，采样应覆盖睑缘的颞侧、中央和鼻侧区域。
注：若在扫描激光相机实时图像中显示一个小的强反射点，且改变焦平面位置后该反射点仍持续存在，可能提示接触凝胶中存在气泡。解决方法是更换新的接触凝胶。 - 手动保存图像，并通过踩下脚踏板记录所有疑似 Demodex 螨虫的图像。启用脚踏板音频反馈以确认图像采集成功。若扫描激光相机实时图像中未显示任何眼睑结构，仅可见高反射的边界层，可能表明 PMMA 接触帽与患者眼睑边缘的接触中断。解决方法是重新对准相机，直至 PMMA 接触帽正确接触患者眼睑边缘。
- 若实时图像模糊、失真或未显示毛囊结构，可能表明患者正在移动头部或眨眼。提醒患者注视固定光源以减少移动。如有可能，调节亮度、焦平面和扫描位置以改善图像质量。
- 若需调整扫描激光相机，或患者感到疲劳或疼痛，应让患者后仰，将扫描激光相机向后移动，并重新调整相机。若患者在检查过程中持续感到不适，且休息后症状无缓解，应立即停止检查并重新安排时间，以确保患者安全。
- 若患者在一天内接受多次检查，应将所有图像保存在图像查看窗口的同一检查标签页中。
- 检查左眼时，从操作者视角将相机向右移动，并等待 OS 自动选定。从设备上取下 PMMA 接触帽，在显微镜镜头上安装新的 PMMA 接触帽，并重复前述步骤。
图3：患者体位。（A,B）患者已就位。（C）正在调整帽具以接触眼睑。请点击此处查看此图的放大版本。
4. 检查后
- 结束检查；确保睫毛毛囊的图像已保存，并且所获取的图像已显示在图像查看窗口中。若未显示，则可能图像采集失败或数据未被保存。首先排除设备故障的可能性，例如软件连接问题或脚踏开关故障。在排除故障后，向患者说明情况并重新进行检查。
- 嘱患者在检查后不要揉眼，直至局部麻醉效果消退。
- 从设备上取下PMMA帽。
- 使用镜头清洁纸清洁显微镜镜头。
- 在选项对话框中选择按采集时间排序（快速），并观察显示的睫毛毛囊图像是否按从颞侧到鼻侧的顺序排列（补充文件1：补充图S5）——即沿睑缘扫描睫毛根部的顺序。逐一审阅所有图像，选取高质量图像用于分析（图4），并删除低质量图像。由一名观察者评估图像中是否存在螨虫，并记录每只眼含有Demodex螨虫的睫毛毛囊总数。
注：高质量图像应清晰显示螨虫形态，且图像中螨虫部分应尽可能大，理想情况下大于100 µm。若无法获得高质量图像，则需由第二名观察者独立评估。若两名观察者结果不一致，须由第三名观察者裁定，以解决差异并确定最终结果，用于报告。 - 生成报告时，将从颞侧到鼻侧的高质量图像依次放入报告的阅片框中。根据检查结果，从报告模板和螨虫计数格式（见补充文件2）中选择合适的报告模板来描述结果。
图4: 毛囊蠕形螨 睫毛毛囊内部。 （图像： 400 µm x 400 µm). (A三 毛囊蠕形螨 在毛囊内可见螨虫（黄色箭头），单根睫毛被标记（白色箭头）. (B五 毛囊蠕形螨 在毛囊内可见螨虫（黄色箭头），单根睫毛被标记（白色箭头）. 由于螨虫可能在不同深度迁移，在单一焦平面成像可能仅捕获到螨虫的片段，从而导致形态学表征不完整。 请点击此处以查看此图的放大版本。
5. 每天下班后关闭设备
- 关闭所有对话框和窗口后，退出软件。
- 关闭计算机。
- 通过将设备背面的摇杆开关从 I 挪至 O 来关闭设备。为确保系统性能最佳并保障数据安全，应先关闭软件，再关闭设备。
注意：设备不应持续开启过长时间，尤其不应超过一整天。 - 定期维护连接到设备的不间断电源（UPS），确保其正常运行，以防止因突然断电导致数据丢失或设备故障。
- 定期执行数据备份，例如使用网络附加存储（NAS）进行存储。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
根据上述标准操作程序（SOP），我们在2024年对疑似Demodex感染的患者进行了检查。此外，我们还比较了2023年尚未实施该SOP时的数据。如图5所示，2024年接受共聚焦显微镜（IVCM）检测以诊断Demodex的患者数量显著高于前一年。该SOP使得对不同年龄患者（从4岁至92岁）的检查成为可能。
图5：接受检测的受试者数量及年龄分组 体内 共聚焦显微镜用于 毛囊蠕形螨 2023年和2024年的观...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
外寄生虫 毛囊蠕形螨 是人类最常见的寄生虫之一。这些螨虫生活在睫毛毛囊、睑板腺（MGs）以及皮脂腺中，呈透明、细长形，体长为0.15–0.4 mm。17使用该设备进行的共焦显微内镜（IVCM）可提供400 µm × 400 µm的实时图像，横向分辨率为1 µm/像素，放大倍数为800倍。通过IVCM，可获得详细的图像 毛囊蠕形螨 可在睫毛毛囊中获取；也可监测患者对眼睑边缘治疗反应的变化11,13作为一种非侵入性技术，共焦激光显微镜（IVCM）已被用作眼科成像工具，可快速可视化睑缘处的螨虫18与睫毛拔除后在光学显微镜下观察微生物相比，IVCM 无痛，可进行频繁检查，便于随访，并能获取高分辨率图像。 表1 展示了两种方法之间的比较。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究获得了国家中医药管理局科技司—浙江省中医药管理局共建科技计划（GZY-ZJ-KJ-23086）项目的资助。活体共聚焦显微镜检测使用配备Rostock角膜模块的海德堡视网膜断层扫描仪III型完成。作者谨此感谢Heidelberg Engineering GmbH公司、所有参与者以及参与本标准操作规程工作的人员。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 基于卡波姆的眼用凝胶，Vidisic | 博士伦，德国柏林 | 8187195 | |
| 海德堡眼底检查仪软件 | Heidelberg Engineering GmbH，德国海德堡 | 版本 1.3.3.0 | |
| 海德堡视网膜断层扫描仪III | Heidelberg Engineering GmbH，德国海德堡 | HRT3-08398 | |
| 盐酸丙帕他卡因 | Alcon Laboratories，美国德克萨斯州沃思堡 | 8387271 | |
| TomoCap | Heidelberg Engineering GmbH，德国海德堡 | 18829 | PMMA 盖帽 |
参考文献
- Cheng, A. M., Sheha, H., Tseng, S. C. Recent advances on ocular Demodex infestation. Curr Opin Ophthalmol. 26 (4), 295-300 (2015).
- Czepita, D., Kuźna-Grygiel, W., Czepita, M., Grobelny, A. Demodex folliculorum and Demodex brevis as a cause of chronic marginal blepharitis. Ann Acad Med Stetin. 53 (1), discussion 67 63-67 (2007).
- Clifford, C. W., Fulk, G. W. Association of diabetes, lash loss, and Staphylococcus aureus with infestation of eyelids by Demodex folliculorum (acari: Demodicidae). J Med Entomol. 27 (4), 467-470 (1990).
- O'Dell, L., et al. Psychosocial impact of Demodex blepharitis. Clin Ophthalmol. 16, 2979-2987 (2022).
- Yeu, E., Holdbrook, M. J., Baba, S. N., Gomes, P. J. Psychosocial impact of Demodex blepharitis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 1261-1261 (2021).
- Wu, M., Wang, X., Han, J., Shao, T., Wang, Y. Evaluation of the ocular surface characteristics and Demodex infestation in paediatric and adult blepharokeratoconjunctivitis. BMC Ophthalmol. 19 (1), 67(2019).
- Zou, D., et al. Characteristics of bacterial community in eyelashes of patients with Demodex blepharitis. Parasit Vectors. 17 (1), 64(2024).
- Coston, T. O. Demodex folliculorum blepharitis. Trans Am Ophthalmol Soc. 65, 361-392 (1967).
- Mastrota, K. M. Method to identify Demodex in the eyelash follicle without epilation. Optom Vis Sci. 90 (6), e172-e174 (2013).
- Gao, Y. Y., et al. High prevalence of demodex in eyelashes with cylindrical dandruff. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (9), 3089-3094 (2005).
- Randon, M., et al. In vivo confocal microscopy as a novel and reliable tool for the diagnosis of Demodex eyelid infestation. Br J Ophthalmol. 99 (3), 336-341 (2015).
- Muntz, A., Purslow, C., Wolffsohn, J. S., Craig, J. P. Improved Demodex diagnosis in the clinical setting using a novel in situ technique. Cont Lens Anterior Eye. 43 (4), 345-349 (2020).
- Kojima, T., et al. In vivo evaluation of ocular demodicosis using laser scanning confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 565-569 (2011).
- Tas, A. Y. Interobserver and intraobserver agreements of the detection of Demodex infestation by in vivo confocal microscopy. Beyoglu Eye J. 7 (3), 173-180 (2022).
- Wang, Y. -J., Ke, M., Chen, X. -M. Prospective study of the diagnostic accuracy of the in vivo laser scanning confocal microscopy for ocular demodicosis. Am J Ophthalmol. 203, 46-52 (2019).
- hrt3 rostock cornea module user manual v. 1.5 english. , Heidelberg Engineering GmbH. http://www.HeidelbergEngineering.com (2025).
- Lee, S. H., Chun, Y. S., Kim, J. H., Kim, E. S., Kim, J. C. The relationship between Demodex and ocular discomfort. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 2906-2911 (2010).
- Sattler, E. C., et al. Noninvasive in vivo detection and quantification of Demodex mites by confocal laser scanning microscopy. Br J Dermatol. 167 (5), 1042-1047 (2012).
- Duncan, N., Sood, P., Khandelwal, S. Demodex blepharitis: Its role and treatment in ocular surface disease. Curr Ophthalmol Rep. 10 (4), 107-113 (2022).
- Luo, X., Li, J., Chen, C., Tseng, S., Liang, L. Ocular demodicosis as a potential cause of ocular surface inflammation. Cornea. 36 Suppl 1 (Suppl 1), S9-S14 (2017).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
