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13C2-视黄醇乙酸酯的合成及用于视黄醇同位素稀释试验的剂量制备

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DOI：

10.3791/68535

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2025年8月22日

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1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Wisconsin-Madison

本文内容

摘要

在使用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法分析血清和母乳时，通常将视黄醇乙酸酯标记两个13C。本文描述了13C2-视黄醇乙酸酯的合成方法，以及为视黄醇同位素稀释试验制备剂量的方法，这些剂量可通过正排量移液器或结核菌素注射器给药。

摘要

视黄醇同位素稀释（RID）检测是通过估算肝脏总储备量来评估维生素A营养状况的最敏感方法，被视为参考标准。对于采用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法检测的情况，需将13C标记添加至视黄醇部分。合成13C-视黄醇乙酸酯的工艺始于天然存在的β-紫罗兰酮。简而言之，由β-紫罗兰酮合成并纯化C18-四烯酮。若需制备13C4-视黄醇乙酸酯，可在向β-紫罗兰酮部分添加丙酮的三个碳原子以合成C18-四烯酮之前，使用13C2标记的磷酸三乙酯乙酸酯的碳负离子，向其引入两个13C原子。若需制备13C3-视黄醇乙酸酯，则可将丙酮的三个碳原子均用13C进行标记。

对于最常用的13C2-视黄醇乙酸酯，若后续需采用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法进行分析，则采用改进的Wittig-Horner法合成：将未标记的C18四烯酮与13C2-标记的磷酸三乙酯乙酸根碳负离子反应，从而在视黄醇分子的第14和第15位碳上引入两个13C原子。所得乙酯产物经还原生成醇，再用乙酸酐酯化为13C2-视黄醇乙酸酯。通过含8%水分失活的氧化铝柱层析纯化全-trans异构体，所用溶剂为相对无害且高度挥发性的正己烷和乙醚，随后通过旋转蒸发及油样超声处理去除溶剂。产物通过紫外-可见光谱（UV-Vis）、薄层层析（TLC）和高效液相色谱（HPLC）与分析标准品对照进行表征。浓缩后的样品溶解于大豆油中，于-80 °C保存。使用前将终剂量用大豆油稀释（约200 µL/剂量），并以空白大豆油为对照，通过UV-Vis光谱法进行定量。剂量通过正排量移液器或结核菌素注射器精确量取，用于人体同位素稀释（RID）试验。基于合理的假设，可据此计算总体维生素A储存量，并估算肝脏总储备量。

引言

视黄醇同位素稀释法（RID）是唯一能够定量测量体内总维生素A储存量（TBS）的维生素A营养状况生物标志物，并在适当假设条件下，可用来估算总肝脏储备量（TLR）。这是测量维生素A营养状况以及评估含有已形成视黄醇或维生素A原类胡萝卜素干预措施效果的最敏感方法。尽管该技术具有一定的挑战性，但RID准确且创伤极小，仅需采集血液样本，而无需进行肝活检1。RID检测根据所使用的质谱仪平台，需给予氘标记或13C标记的视黄醇乙酸酯。在给予剂量之前，需采集基线血液样本，使用13C标记物时此步骤至关重要，但也可在随机选取的亚组中进行。在13C标记的视黄醇乙酸酯与体内总维生素A储存量充分混合后，采集第二份血样1。

预防维生素A缺乏的干预措施包括食品强化、生物强化、膳食多样化和补充剂。然而，在一些国家，针对同一人群实施了重叠的干预措施，导致维生素A过多症2，因此需要建立监测框架以评估项目效果。为此，亟需能够定量测定维生素A营养状况的方法。国际原子能机构（IAEA）与成员国合作，推动同位素在研究和评估中的和平利用，支持RID检测方法的应用。RID检测正逐渐得到推广，未来可能被用于大规模人群调查，以评估实施维生素A干预国家中人群从缺乏到过量的维生素A营养状况3。

此前，10,11,14,15-13C4-视黄醇乙酸酯的合成采用了Bergen等人报道的氘代视黄醇乙酸酯合成方法的改进方案4,5。该化合物曾用于大鼠6和人类实验，结合气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法（GCCIRMS）进行分析7。通过这些重要的实验，我们发现GCCIRMS的灵敏度极高，因此在采用GCCIRMS进行相对剂量反应（RID）测试时，并不需要四个13C标记。因此，将示踪剂简化为仅在视黄醇分子的14和15位引入两个13C标记，即可显著降低其成本（图1）。这一改进不仅降低了合成相关的费用，还因合成路径的优化而提高了产率。本文中，我们描述了该化合物合成的放大工艺流程。

与其它类型的质谱技术相比，气相色谱-同位素比质谱法（GCCIRMS）在测定稳定同位素方面更为灵敏8，并能够响应饮食变化以及血清视黄醇中自然的13C富集变化。这一现象已在食用玉米的沙鼠9和人类10以及参与蔬菜干预研究的人群11中得到描述。事实上，不同人群之间13C的自然丰度存在差异，因此在开展维生素A同位素稀释（RID）评估的研究对象中需测定其自然丰度12。然而，目前仅有少数小样本亚组研究报道了加纳和泰国儿童13,14以及泰国女性15在RID研究中的自然富集水平。为在个体水平上最准确地测定总身体储存量（TBS），应测定每个个体基线时的13C富集度12。

方案

注意：在招募人类受试者进行研究、干预或评估性研究时，必须获得机构审查委员会（IRB）的批准，并遵循适当的知情同意程序。

1. 13C2-视黄醇乙酸酯的合成（图2）

注意：所有合成步骤和定量操作均在金色荧光灯下进行，以防止化合物降解和异构化。

  1. 从市售的β-紫罗兰酮（β-ionone）大量合成乙酸β-紫罗兰酯（β-ionyl acetate）。例如，将氢化钠（NaH）（4 g，0.16 mol）用100 mL乙醚覆盖，然后在100 mL乙醚中逐滴加入未标记的三乙基膦酰乙酸酯（36 g，0.16 mol），搅拌2小时。反应过程中释放氢气（H2），初始悬浮液变为澄清的琥珀色。
    警告：氢化钠（NaH）是一种强还原剂，广泛用于多种化学反应中。然而，由于其与空气中的水分发生剧烈放热反应，可能引发实验室火灾16,17。建议查阅安全数据表；已有针对处理中等自燃性固体（如NaH）的附加操作指南发表18。操作时应将其悬浮于油或惰性溶剂中，反应容器和储存容器需用惰性气体（如氮气或氩气）吹扫，反应容器需冷却，并将NaH储存在密封容器中，置于干燥环境中。在本实验室中，NaH在氮气环境下以小量（约1 g）转移至小瓶中，随后储存在密封干燥器中待用。
  2. 在40 mL乙醚中加入β-紫罗兰酮（21 g，0.12 mol），于20 °C下反应过夜（约15小时）。第二天，用水淬灭反应，用己烷萃取乙基-β-紫罗兰叉乙酸酯，并在一系列分液漏斗中反复用水洗涤以最大化回收率。用无水硫酸镁（MgSO4）干燥有机层，过滤并浓缩。
    注意：薄层色谱（TLC）在此合成阶段通常仅检测到少量杂质。此产物可在-80 °C长期储存，再进行后续步骤。
  3. 将乙基-β-紫罗兰叉乙酸酯（28 g，0.11 mol）与120 mL 1 mol/L的四氢铝锂（LiAlH4）乙醚溶液反应。将反应容器浸入干冰-丙酮浴中，并持续搅拌，生成β-紫罗兰叉乙醇（β-ionylidene ethanol）。
    警告：四氢铝锂（LiAlH4）是一种强还原剂。请查阅安全数据表，并参考有关处理中等自燃性固体（如LiAlH4）的附加指南18,19。大多数安全预防措施的主要目标是尽量减少LiAlH4暴露于空气中的风险，并防止失控反应。通常包括在操作过程中将化合物悬浮于油或惰性溶剂中，反应容器和储存容器用惰性气体（如氮气或氩气）吹扫，冷却反应容器，并将LiAlH4储存在密封容器中，置于干燥环境中。在本实验室中，四氢铝锂以密封的1 mol/L溶液瓶形式购买，而非粉末形式，使用时用注射器取所需体积，并用氮气替换瓶内气氛。
  4. 将28 g（0.12 mol）β-紫罗兰叉乙醇溶于300 mL己烷中。在3天内每天加入约50 g的90%二氧化锰（MnO2）（分别为51 g、52 g和54 g），并持续搅拌反应混合物（通常在20 °C下持续2天）。最后加入35 g MnO2，静置过夜约15小时；此时反应完成度约为90%。用二氯甲烷过滤并洗涤，从MnO2中提取出β-紫罗兰叉乙醛。
  5. 将粗制的β-紫罗兰叉乙醛（22 g，0.10 mol）溶于150 mL丙酮中，持续搅拌，并逐滴加入10 mL 1 N氢氧化钠溶液。反应持续6小时。
  6. 用己烷萃取C18四烯酮，并在一系列分液漏斗中反复用水洗涤以最大化回收率。用旋转蒸发仪干燥所得溶液，得到粗制的cis-trans C18四烯酮。由于trans异构体在人体研究中最理想，因此使用4%水失活的硅胶（300 g），以己烷中0–10%乙酸乙酯的缓慢梯度进行纯化。
  7. 将NaH（1.2 g，0.05 mol）与50 mL乙醚搅拌，然后将溶于50 mL乙醚中的13C2-三乙基膦酰乙酸酯（11 g，0.049 mol）逐滴加入，搅拌2小时。将C18四烯酮（12 g，0.044 mol）溶于50 mL乙醚中，于20 °C下反应过夜约15小时。
  8. 用水淬灭反应，用己烷在分液漏斗中萃取14,15-13C2-视黄酸乙酯，并用水洗涤。用无水MgSO4干燥有机层并浓缩；使用8%水失活的中性氧化铝（400 g），以己烷中0–3%二乙醚的缓慢梯度进行纯化，得到cis/trans异构体。
    注意：首次纯化后，薄层色谱（TLC）常显示存在杂质。可通过将TLC板暴露于碘蒸气中观察到杂质。若存在杂质，必须使用400 g 8%水失活的中性氧化铝，以100%己烷进行再次纯化，以获得纯净的14,15-13C2-视黄酸乙酯。
  9. 在干冰-丙酮浴中，将14,15-13C2-视黄酸乙酯（3.7 g）与15 mL 1 mol/L四氢铝锂搅拌还原，生成14,15-13C2-视黄醇（图1）。
  10. 将14,15-13C2-视黄醇（3.5 g）溶于20 mL三乙胺中。在搅拌下，将3.5 mL乙酸酐与7 mL三乙胺混合后逐滴加入反应瓶中。将反应瓶置于冰箱中过夜（约15小时），以生成14,15-13C2-视黄基乙酸酯。
  11. 将3.9 g粗制的14,15-13C2-视黄基乙酸酯用己烷萃取，干燥、浓缩，并在500 g 8%水失活的中性氧化铝上，以己烷中0–3%二乙醚的缓慢梯度进行纯化。使用紫外-可见（UV-Vis）分光光度计在325 nm处监测各馏分。用旋转蒸发仪除去所有残留溶剂。通过高效液相色谱（HPLC）和光电二极管阵列检测评估最终产物，以确定cis/trans比例。使用超高压液相色谱分离cis/trans异构体的高级梯度系统示例见补充图S1。
    注意：在此阶段，cis/trans比例通常>95%，为全-trans构型。
  12. 储存时，将全-trans 14,15-13C2-视黄基乙酸酯溶于食品级大豆油中，不添加其他成分，用氮气吹扫后储存在棕色玻璃瓶中，于-80 °C保存，并标记为浓缩储备液。

2. 稳定同位素标记的视黄醇乙酸酯油溶液的剂量配制

注意：同位素标记的醋酸视黄酯已通过胶囊20或使用250 µL正排量移液器21或医用注射器22给予的油溶液形式给药（图3）。我们已测试了胶囊的稳定性（图4），如下所述。

  1. 合成后立即在标记的醋酸视黄酯开始结晶前，将其溶解于约15 mL未强化的植物油（例如食品级大豆油）中，并储存于24 mL棕色琥珀色小瓶内，置于-30至-80 °C条件下，直至准备最终剂量时使用。
    1. 若标记的醋酸视黄酯为购买所得，应小心用锉刀划痕后折断真空密封安瓿的顶部，或打开螺旋盖瓶的密封。根据所需质量，称取适量放入24 mL棕色琥珀瓶中，并加入少量植物油（10 mL通常足够）。超声处理混合物直至形成澄清溶液。
  2. 通过将受试者数量乘以200 µL来估算所需最终油剂的总量。例如，若有60名受试者，则应配制约70份剂量，以预留损耗量（约10-20%）。因此，70 × 200 µL = 14 mL。
    注意：切勿依赖合成油或晶体的质量进行计算。必须使用分光光度计对剂量进行定量。所有合成维生素A均含有残留溶剂，这些溶剂可通过超声处理或在温和氮气流下挥发，但正是这些残留物导致无法仅凭质量确定同位素剂量。
    ​若标记的醋酸视黄酯溶液在冷冻条件下长期存放而未使用，应重新分析以确定是否发生了显著降解。
  3. 定量醋酸视黄酯：
    1. 开启紫外-可见分光光度计（推荐使用扫描型双光束分光光度计）及其连接的计算机（如适用）。按照制造商说明启动仪器，并在测量前让仪器预热至少30分钟。
    2. 准备两个25 mL容量瓶及瓶塞，各加入接近刻度线的25 mL正己烷。将其中一个标记为"油"或"空白"，另一个标记为"维生素A"或"剂量"；随后将维生素A容量瓶暂放一旁，待空白样品测定完成后使用。
    3. 将纯大豆油倒入一次性塑料杯中，取20–40 µL加入“油”容量瓶以作系统空白。
      注意：通常使用20 µL，但只要空白与同位素剂量体积一致，也可使用更多。
    4. 倒置混合4–5次使油与正己烷充分混匀，然后用该溶液冲洗两支分光光度计石英比色皿，并填充至约75%满。
    5. 将两支比色皿放入分光光度计中，注意不要触碰透明的前后表面（仅握持磨砂侧面）。为获得最佳准确性，应将配对的比色皿编号面朝向操作者。
    6. 关闭样品室遮光门。
    7. 点击空白或基线功能，使系统测量油与正己烷的基线吸光度，以校正“油空白”正己烷溶液的吸收。扫描波长范围为260至400 nm；扫描完成后确认400 nm处读数为"零"。若非如此，点击归零按钮并重新扫描。完成后，系统即可用于测定醋酸视黄酯剂量的吸光度。
    8. 弃去样品比色皿中的溶液，换入“剂量”正己烷溶液。将样品置于指定位置并扫描光谱。选择峰值并读取吸光度。纯醋酸视黄酯在325 nm处仅有一个λ最大吸收峰。
      注意：若出现多个峰或在280 nm处有吸收峰，则表明醋酸视黄酯已降解，不应用于给药。
  4. 步骤2.3的计算
    注意：视黄醇在正己烷中于325 nm处的E 1%, 1 cm值为1,810。您将按视黄醇当量对醋酸视黄酯进行定量。
    1. 将吸光度除以0.181，得到溶液中µg/mL的浓度。
    2. 乘以25 mL，得到20 µL油溶液中所含的µg数。
      注意：示例：20 µL油溶于25 mL正己烷后的吸光度为0.295。
      0.295 / 0.181 = 1.630 µg/mL × 25 mL = 40.75 µg（即20 µL油中含40.75 µg）
      ​若所需剂量为286 µg，则需140.4 µL。此为1 µmol，但由于标记的存在，肠道中将生成288 µg的13C2-视黄醇。您可能需要进行稀释，使剂量体积更接近200 µL，并重复上述定量步骤。
  5. 制备用于稳定性测试的胶囊
    1. 将胶囊分为较大的白色底帽和较小的蓝色顶帽。
    2. 将白色胶囊底帽放入移液枪头盒中（每盒96个），盖好以防止灰尘进入；将蓝色顶帽放入密封塑料袋中过夜。丢弃有裂纹的胶囊。
    3. 使醋酸视黄酯油溶液恢复至室温。取少量（约5 mL）倒入一个未使用的小型塑料杯中。
    4. 准备可重复移液器：安装5 mL注射器（1对应100 µL），并将设定值调至"2"，以便每次按压释放200 µL。
    5. 通过拉动加样臂将醋酸视黄酯油吸入可重复移液器中。先向杯中释放至少4次200 µL的等分试样，以排除枪头中的气泡。
    6. 每次轻轻将移液器枪头接触白色胶囊底帽内壁并按下触发器，向每个白色底帽中加入一份200 µL的油剂。
    7. 当可重复移液器接近排空时，重新吸入更多油剂。
    8. 完成整批96个胶囊后，将剩余油剂排回杯中，然后开始轻轻将蓝色顶帽滑套至每个白色底帽上，注意避免压裂。
    9. 所有顶帽安装完毕后，逐个取出胶囊，轻压确认顶帽已牢固，再放回枪头盒中。
    10. 将胶囊储存在选定的温度和条件下。可通过将胶囊架包裹铝箔实现避光。以下为示例：
      a.  冷冻保存：-20 °C避光
      b.  冷藏保存：4 °C避光
      c.  室内台面保存：20 °C（室温）避光
      d.  室内台面暴露保存：20 °C（室温）暴露于常规荧光灯光下
      e.  恒温箱保存，模拟其他地区较高环境温度：37 °C避光

3. 剂量给药

注意：已使用结核菌素注射器直接对比正向置换移液器，以确定技术人员操作时的准确性和精密度（图5）。

使用250 µL Rainin正向置换移液器或1 mL结核菌素注射器进行给药。

  1. 解冻冷冻的剂量，或在前往野外现场时将其放入带有冰袋的冷藏箱中。运输过程中，剂量通常会解冻。
  2. 从冷藏器中取出棕色玻璃小瓶并打开。将小瓶保持在 "杯子" 或烧杯，以防止其倾倒。
  3. 将移液器吸头或结核菌素注射器插入油中，吸取少量液体。快速按压推杆以排出可能形成的气泡。缓慢吸取所需体积的液体至移液器或注射器中。确保其中无气泡。
  4. 用纸巾擦拭吸头外部。不要触碰移液器吸头或注射器的末端，以免将液体吸出。
  5. 将吸头放入受试者口中，释放油样至其口腔内，并指导受试者闭口吞咽。
    注意：给药时，若受试者能将头部稍向后仰，会更便于操作。
  6. 给药后，给予一次 "追加液" 或含至少10克脂肪的高脂零食。对于幼儿，可在塑料勺上给予1 mL未强化的油作为后续摄入。对于较大儿童和成人，花生酱三明治半份、油炸白土豆或涂抹巧克力酱的法式长棍面包均为适宜的后续零食。
    注意：应开展具有参考价值的研究，以确定当地可接受的零食种类。

结果

以市售的β-紫罗兰酮为起始原料，合成了28 g乙基-β-紫罗兰叉乙酸酯。经还原后，将22 g β-紫罗兰叉乙醛在碱性条件下与丙酮反应，得到C18-四烯酮；获得12 g纯化的C18-四烯酮产物，其中全-反式构型约占90%。随后，采用改良的Wittig-Horner反应方法，使该产物与13C2-三乙基膦酰乙酸酯的碳负离子反应，从而在视黄醇分子的14和15位引入两个13C标记。所得乙酯产物收率为3.7 g，经还原生成相应的醇，并用溶于三乙胺的乙酸酐酯化为13C2-视黄醇乙酸酯。合成的维生素通过含8%水分的失活氧化铝柱，使用高挥发性有机溶剂（正己烷和乙醚）进行纯化。最终产物采用紫外-可见光谱（UV-Vis）、薄层色谱（TLC）和高效液相色谱（HPLC）进行表征。标记的视黄醇乙酸酯溶液需在-80 °C下溶于大豆油中长期保存。

上述14,15-13C2-视黄醇乙酸酯的成功合成路线如图2所示。该全合成路线从β-紫罗兰酮起始，共包含七个步骤。首次获得0.9 g全-trans构型的14,15-13C2-视黄醇乙酸酯。顺式/反式异构体组分（1.2 g）合并后，使用300 g含8%水失活的中性氧化铝进行再次纯化，额外获得0.3 g全-trans构型的14,15-13C2-视黄醇乙酸酯。

为了确定胶囊中醋酸视黄酯的稳定性，将1 g醋酸视黄酯溶解于己烷中，并使用300 g含8%水失活的氧化铝进行开放式柱层析纯化，以己烷作为洗脱溶剂。通过薄层层析（TLC）和紫外-可见光谱法（UV-Vis）监测醋酸视黄酯，仅收集纯的组分用于后续实验。该过程与上述Tanumihardjo实验室用于RID检测的13C2-醋酸视黄酯合成与纯化方法完全相同。将纯化后的醋酸视黄酯溶解于大豆油中，通过旋转蒸发仪除去有机溶剂，再加入更多大豆油，使其终浓度达到7.5 µM（即每200 µL含1.5 µmol，此剂量介于成人与儿童在使用GCCIRMS分析时进行RID检测的剂量之间）。醋酸视黄酯浓度的测定方法同上，采用紫外-可见光谱法进行测定。

取200 µL油样，分装入3号纤维素胶囊（最大容量300 µL）中，用于稳定性研究。每种剂量的胶囊分别在五种条件下储存。通过将胶囊置于铝箔覆盖的架子中以实现避光条件。每种条件准备150粒胶囊，共750粒：i）冷冻保存：-20 °C避光；ii）冷藏保存：4 °C避光；iii）室温放置于实验台：20 °C（室温）避光；iv）暴露于光照的实验台：20 °C（室温）暴露于标准荧光灯光照下；v）置于烘箱中，模拟其他地区较高的环境温度：37 °C避光。

在胶囊稳定性研究中，每个时间点（-20 °C、4 °C、室温避光、室温光照、37 °C）均测量每种条件下的三个胶囊。所有胶囊均需恢复至室温后再进行测量（室温条件的胶囊优先分析）；温度变化会导致吸光度变化。胶囊的测量持续至480天。在-20 °C和4 °C条件下，胶囊在九个月内保持稳定（图4）。

采用方法学比较，将一次性结核菌素注射器与Rainin正位移移液器（作为参考标准）进行对比。Rainin正位移移液器使用水进行校准，并根据当地温度和气压进行修正，随后使用三种吸头各重复三次，测定在200 µL设定下向已去皮重的称量舟中分配的目标油体积。分配操作由10名经验水平不同的技术人员执行。每名技术人员对八支注射器各重复三次进行测试，并与移液器参考值进行比较。移液器吸头侧面用纸巾擦拭，并以一定角度将油液排入称量舟中，确保最大限度释放油液。在整个操作过程中，技术人员对所分配油液的质量结果保持盲态；油液质量由另一名技术人员记录。该过程使用八支结核菌素注射器（例如Norm-Ject）重复进行，分配200 µL大豆油。

采用 R 统计软件拟合方差分量模型（FitVCA）22（图 5）。所测量的变异因素包括操作技术人员、同一技术人员使用的不同注射器以及重复测量误差。与移液器输送体积相比，注射器输送体积的标准化均值（95% 可信区间）为 0.996（0.912，1.08）。重复测量误差的方差占总方差的 64.8%，表明同一注射器内重复测量是变异性的主要来源。来自操作技术人员以及同一技术人员所用不同注射器的方差百分比则低得多，分别占 22.9% 和 12.3%。

根据技术人员的经验将其分为两组（n = 5/组）进行亚组分析。两组之间的平均标准化注射器给药量相似，但经验较丰富的技术人员的95%置信区间更窄，分别为1.001（0.939，1.063）和0.998（0.900，1.100）。在经验较丰富的技术人员中，大部分变异来源于同一技术人员不同注射器之间的差异（57.0%）和重复误差（42.9%）；而在经验较少的技术人员中，大部分变异来源于技术人员之间的差异（32.7%）和重复误差（67.2%）。

分子的化学结构图；静态平衡，研究，教育，有机化学。
图1：视黄醇的结构，碳原子已编号。 通常在14和15位引入13C，以便用于气相色谱-燃烧-质谱分析。请点击此处查看此图的放大版本。

化学合成路径示意图；多步反应：NaH、LiAlH4、MnO2、同位素标记。
图2：在采用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法分析血清或母乳样本时，用于视黄醇同位素稀释试验的14,15-13C2-视黄基乙酸酯的合成路线图。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于生化分析或液体处理技术样品制备的注射器和移液器。
图3：在示踪剂研究中用于给药的1 mL无死体积尖端结核菌素注射器和250 µL正向置换移液器。 请点击此处查看该图的放大版本。

在325 nm处的吸光度随时间变化的曲线图；温度对稳定性的影响；数据分析图。
图4：不同储存条件下胶囊中醋酸视黄酯的降解曲线。 储存条件分别为-20 °C、4 °C、20 °C（避光室温）、20 °C（室温）下暴露于标准荧光灯光照，以及37 °C。请点击此处查看该图的放大版本。

一次性注射器变异分析图；标准化质量与操作人员的关系，显示均值和置信区间。
图 5：10 名在评估过程中对结果设盲的操作人员使用 1 mL 结核菌素注射器与 250 µL 正排量移液器进行给药剂量的变异组分分析。数值为注射器分配的油质量（200 µL），并以正排量移液器为基准进行标准化。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图S1：采用超高压液相色谱法对14,15-13C-视黄醇乙酸酯进行最终纯度检测的示例。 相应的光谱具有以下特征 顺式/反式 维生素的不同形式。UPLC 条件为：流动相 A 为乙腈:水:异丙醇 = 70:25:5，含 10 mM 乙酸铵；流动相 B 为乙腈:异丙醇 = 75:25。色谱柱为 Acquity UPLC BEH C18。 1.7 µM，2.1 x 100 mm色谱柱。将色谱柱温度设定为 29 °C，流速为0.4 mL/min。梯度洗脱程序起始于100%溶剂A，保持5.0 min，随后在7 min内线性过渡至98%溶剂B，保持8 min，再于1 min内返回至100%溶剂A，最后平衡4 min。 请点击此处下载此文件。

讨论

尽管市面上有氘代和13C标记的视黄醇乙酸酯供应，但文献中已报道了多种适用于熟练有机化学家的视黄醇合成路线。我们选择了一条适用于氘代视黄醇乙酸酯的合成路径，并进行了适当调整，以在视黄醇骨架中引入13C标记，上述内容已概述该方案。14,15-13C2-视黄醇乙酸酯的合成通过七步反应完成，起始原料为市售的β-紫罗兰酮。β-紫罗兰酮是一种天然存在的植物成分，是玫瑰等香味的贡献物质之一。合成路线中最关键的步骤是C18四烯酮的形成。该中间体化合物的纯度必须至少达到90%，后续反应才能获得较高的产率。

采用改良的Wittig-Horner方法，使用市售的13C2-三乙基膦酰乙酸酯进行标记。标记化合物用于RID试验，以测定总身体储存量（TBS）并估算视黄醇转化率（TLR）。该方法利用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法（GCCIRMS）分析从服用生理剂量标记化合物的个体血清或母乳中纯化的视黄醇。最常见的给药剂量为儿童1 µmole，成人2 µmole。尽管GCCIRMS分析对同位素富集度具有高灵敏度，但血清分析需要至少400 µL血清，以获得足够的视黄醇质量用于进样至气相色谱。

碳-13 呼气试验（13C-RID）已被用于临床研究23,24以及非洲儿童群体25，未来计划将其推广应用于基于人群的研究。我们通过胶囊和注射器进行了实验，以评估这些改进形式是否适用于人群研究。胶囊必须保持直立，否则会发生泄漏；我们很快放弃了将其储存在常规棕色药瓶中用于野外工作的设想。胶囊在冰箱和冷冻条件下仅能稳定保存约 9 个月。通过生产密封胶囊，可能减少储存期间与空气的微量接触，从而提高稳定性。在推广应用前，应由使用方对胶囊的使用进行测试和验证。

最终的油溶液在室温下可稳定保存约2个月，但一旦开始降解，降解过程会迅速进行。对于RID检测而言，不存在可接受的部分活性，因为给药量将用于总血液量（TBS）的计算。在野外使用时，最好将溶液置于冰袋中，并在给药完成后尽快重新冷冻。建议每日仅取出略多于所需剂量的量，其余部分保持冷冻状态。由于油本身含有抗氧化剂，反复冻融不会影响这些溶液的稳定性。油溶液比血液样本更稳定，但在不使用时仍需始终避光并冷冻保存。

使用250 µL Rainin正向置换移液器或1 mL结核菌素注射器进行给药。空气置换移液器不适用于溶解在油中的剂量。本实验室已对这两种方法进行了实验性比较（见代表性结果）。使用移液器或注射器给药的操作相似，但存在一些差异。Rainin正向置换移液器推荐用于科研或临床研究，而注射器可用于基于人群的研究。建议使用尖端死体积较小的注射器以最大程度提高剂量的精确性（例如Norm-Ject）。

RID 试验的计算包括给药剂量的量，给药剂量的误差与总脑脊液（TBS）估计结果的误差成正比。在使用结核菌素注射器与正位移移液器的比较中，注射器平均标准化递送量接近 1，表明注射器可为人群研究提供准确的剂量递送。95% 置信限约为目标递送剂量的 ± 8%。相比经验较少的技术人员（± 10%），先前使用注射器经验更丰富的技术人员具有更窄的 95% 置信区间（± 6%）以及更低的技术人员间方差贡献。这表明在实际应用前，应先进行培训方案并使用载体油进行验证。这些结果值得在每个希望使用一次性结核菌素注射器作为经济高效且节省时间的给药方式以开展基于人群研究中的剂量-反应和 RID 试验的实验室中进一步验证。

在使用RID试验进行研究和临床研究时，我们选择正向置换移液器以最大限度地提高个体水平的准确性，因为其报告的准确性和精确度均≤1%。相比之下，改良的相对剂量反应试验为定性试验，无需根据给予的剂量进行计算1。因此，我们建议在基于人群的调查中使用注射器进行该试验，并将剂量溶解于约0.7 mL的载体中。

相对剂量反应（RID）试验是一种用于定量测定视黄醇结合蛋白（TBS）并估算维生素A利用率（TLR）的敏感方法，后者是评估维生素A营养状况的参考标准。该方法已广泛应用于多项研究，采用氘或13C标记技术进行。当前及未来的研究将进一步在临床环境和人群亚组调查中应用RID试验。对于这些应用场景而言，给药方案的简化将至关重要。

披露

作者与本文内容无利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH-R01 DC019357）和国际原子能机构协调研究项目（E43035）资助。我们感谢威斯康星大学麦迪逊分校统计咨询组的Nicholas Keuler在一次性注射器方法比较分析中提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸酐Sigma Aldrich242845
丙酮Sigma Aldrich179124
氧化铝Sigma Aldrich199974
烧杯任意任意玻璃器皿供应商 
β-紫罗兰酮Sigma AldrichW259500
乙醚Sigma Aldrich673811
玻璃巴斯德吸管任意任意玻璃器皿供应商 
己烷Sigma178918
标记的磷酸三乙酯乙酸酯Sigma Aldrich293202
氢化铝锂溶液Acros Organics199511000
二氧化锰Sidma Aldrich310700
正排量移液器Rainin17008579
醋酸视黄酯Sigma AldrichR4632
分液漏斗任意任意玻璃器皿供应商 
硅胶Sigma Aldrich1.07734
氢化钠Aldrich223441
氢氧化钠Fisher ScientificS318-100
分光光度计任意扫描型推荐使用双光束型
三乙胺Sigma Aldrich471283
磷酸三乙酯乙酸酯AldrichT61301
结核菌素注射器Norm-Ject19G334
植物油大豆油杂货店
容量瓶（25 mL）任意任意玻璃器皿供应商 

参考文献

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