N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导兴奋性毒性条件下视网膜神经节细胞解剖学特征的检测

摘要

本文描述了一种基于基因定向的碱性磷酸酶（AP）标记方法，用于研究在NMDA诱导的兴奋性毒性下小鼠视网膜的解剖特征和表型变化。结合多种视网膜神经节细胞（RGC）亚型特异性报告基因小鼠品系，我们在整个退变过程中揭示了濒死RGC中新的表型特征。

摘要

视网膜神经节细胞（RGCs）是视网膜的输出神经元，负责将视觉信息传递至大脑。在成熟的小鼠视网膜中，已根据基因组学、形态学和功能特征鉴定出超过40种RGC类型。RGC的退变是多种致盲性视网膜疾病（如青光眼和外伤性视神经病变）的典型特征。深入理解不同疾病条件下RGC退变、存活及抗损伤能力背后的细胞与分子机制，对于开发有效的治疗干预手段至关重要。 为了研究RGC的退变过程，我们采用了一种简单而强大的技术，该技术此前已广泛应用于视网膜发育研究中，用于分析RGC的形态及其在中枢的投射。本文中，我们将该方法应用于评估NMDA诱导的兴奋性毒性条件下RGC的解剖学表型。该方法能够随时间推移可视化大量退变中的RGC，使我们得以描绘退变事件的发生顺序，识别濒死RGC的标志性表型，并区分对NMDA诱导损伤具有抵抗性的RGC。

引言

创伤性脑损伤（TBI）是一种导致脑部神经元受损的突发性损伤。在重度TBI中，例如由车祸、运动碰撞或爆炸引起的冲击伤，机械力可能破坏细胞结构，引发炎症、氧化应激、兴奋性毒性，最终导致神经元死亡^1,2。

视网膜是中枢神经系统（CNS）中最易接近的部分，已被用作研究兴奋性毒性分子机制以及开发治疗干预策略的创伤性脑损伤（TBI）模型系统^3,4,5。用于TBI研究的最相关的视网膜模型包括视神经 crush 模型和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导的视网膜兴奋性毒性模型。在NMDA诱导的兴奋性毒性视网膜模型中，视网膜神经节细胞（RGCs）被确定为最易受损伤的视网膜神经元类型，因为RGCs以谷氨酸作为主要的兴奋性神经递质，并通过多种类型的谷氨酸受体（包括AMPA受体（AMPARs）、KAPA受体（KAPARs）和NMDA受体）来触发动作电位⁶。除了RGCs外，其他视网膜细胞和神经回路也可能受到NMDA处理的影响^7,8

方案

所有动物实验均遵循美国公共卫生服务部关于实验动物人道护理和使用的政策，并经休斯顿德克萨斯大学麦戈文医学院机构动物护理和使用委员会批准。溶液的成分列于材料表中。

1. 他莫昔芬注射

1. 将30 mg他莫昔芬与30 μL乙醇混合。在低于沸点的水中加热1 mL葵花籽油及他莫昔芬/乙醇混合物。
2. 待他莫昔芬在乙醇中完全溶解后，迅速向该溶液中加入1 mL预热的葵花籽油。用移液器充分混匀。
3. 选用2至6个月龄、性别不限的小鼠。使用胰岛素注射器，按100 μg/g体重剂量经腹腔注射他莫昔芬溶液。根据小鼠品系确定他莫昔芬注射次数。本方案中，连续四天每日注射一次。
   注意：由于他莫昔芬溶液与高密度油混合，使用带可拆卸针头的注射器操作较为困难。因此，建议选用针头固定的胰岛素注射器进行他莫昔芬注射。
4. 将小鼠饲养于独立通风笼具中，每笼不超过5只，直至进行NMDA注射。

2. 将NMDA溶液注射到小鼠眼睛中

1. 在无菌1×PBS中配制20 mM的NMDA溶液。使用连接35G针头的纳米注射器，以100%乙醇清洗20次，再用无菌超纯水额外清洗20次。用1 μL NMDA溶液填充纳米注射器。
2. 通过腹腔注射给予小鼠....

结果

向玻璃体注射NMDA可诱导视网膜神经节细胞（RGC）死亡，传统上通过组织学染色或使用RGC标志物的免疫荧光（IF）染色来检测。在本实验条件下，采用针对泛RGC标志物RBPMS的传统IF方法，我们证实，在注射NMDA后1周，RGC数量减少了约65%（图2E-G）。先前的研究发现，表达Tbr2的RGC确实是内在光敏性视网膜神经节细胞（ipRGC）^34,35。通过对Tbr2^CreER2; Rosa^iAP小鼠视网膜进行碱性磷酸酶（AP）染色，我们观察到仅少量表达Tbr2的RGC存活，而大多数表达Tbr2的RGC和无长突细胞（ACs）在注射后1周已消失（比较 图2A、B）^34,.......

讨论

在本研究中，我们利用一种基因定向的稀疏AP标记系统，并结合多种基因改造的小鼠品系，检测了NMDA诱导的多种RGC和AC亚型中的退行性事件，发现了若干特征性表型^29,31,39。最显著的表型是NMDA注射视网膜中RGCs和ACs数量显著减少（图2A-D），这与以往使用细胞类型特异性报告基因小鼠品系或全RGC标记物进行免疫荧光染色的研究结果一致（图2E-F）。我们先前发现，表达Tbr2的RGC本质上即为ipRGCs^34,35,40。尽管许多先前的研究表明ipRGCs对NMDA损伤更具抵抗.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5% 红霉素眼膏	Bausch+Lomb	24208-910-55
0.5% 盐酸丙帕他卡因	Bausch+Lomb	24208-730-06
10% 中性缓冲福尔马林	VWR	89370-094
10 cm 培养皿	Corning	430167
10x PBS	Fisher Scientific	BP399	用水稀释制备 1x PBS，并进行高压灭菌。
2.0 ml 离心管	VWR	525-1136
30 号注射针头	EXELINT International	26437
30 mm 培养皿	Falcon	35208
苯甲醇	Acros Organics	447000010
苯甲酸苄酯	Acros Organics	105860010
硝酸纤维素膜滤器	Cytiva	7188-002
盖玻片	Electron Microscopy Sciences	72204-01
双面胶带	Scotch	597020
乙醇	Decon Labs	2716	碱性磷酸酶染色后脱水时避免使用 Fisher Bioreagents（货号：BP2818），该试剂会导致视网膜变形。
镊子	TED PELLA	505
加热垫	Theratherm	710298-001
胰岛素注射器	BD	329424
氯胺酮	Dechra	17033010110
显微镜	Zeiss	Axio Imager 2
指甲油	Electron Microscopy Sciences	72180
Nanofil 注射器	World Precision Instruments	NANOFIL
Nanofil 针头	World Precision Instruments	NF25BL
NBT/BICP 试剂盒	Invitrogen	N6547
NMDA	Sigma-Aldrich	M3262
画笔	Kingart	6650
载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
体视显微镜	Motic	DM143
葵花籽油	Sigma-Aldrich	S5007
他莫昔芬	Sigma-Aldrich	T5648	将他莫昔芬溶液储存于 4 °C 避光盒中，一周内使用完毕。
Vanna 剪刀	Fine Science Tools	15000-00
水浴锅	Lab-Line	18052
赛拉嗪	Dechra	17033-0099-05	商品名：Rompun