本文描述了一种基于基因定向的碱性磷酸酶(AP)标记方法,用于研究在NMDA诱导的兴奋性毒性下小鼠视网膜的解剖特征和表型变化。结合多种视网膜神经节细胞(RGC)亚型特异性报告基因小鼠品系,我们在整个退变过程中揭示了濒死RGC中新的表型特征。
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本文描述了一种基于基因定向的碱性磷酸酶(AP)标记方法,用于研究在NMDA诱导的兴奋性毒性下小鼠视网膜的解剖特征和表型变化。结合多种视网膜神经节细胞(RGC)亚型特异性报告基因小鼠品系,我们在整个退变过程中揭示了濒死RGC中新的表型特征。
视网膜神经节细胞(RGCs)是视网膜的输出神经元,负责将视觉信息传递至大脑。在成熟的小鼠视网膜中,已根据基因组学、形态学和功能特征鉴定出超过40种RGC类型。RGC的退变是多种致盲性视网膜疾病(如青光眼和外伤性视神经病变)的典型特征。深入理解不同疾病条件下RGC退变、存活及抗损伤能力背后的细胞与分子机制,对于开发有效的治疗干预手段至关重要。 为了研究RGC的退变过程,我们采用了一种简单而强大的技术,该技术此前已广泛应用于视网膜发育研究中,用于分析RGC的形态及其在中枢的投射。本文中,我们将该方法应用于评估NMDA诱导的兴奋性毒性条件下RGC的解剖学表型。该方法能够随时间推移可视化大量退变中的RGC,使我们得以描绘退变事件的发生顺序,识别濒死RGC的标志性表型,并区分对NMDA诱导损伤具有抵抗性的RGC。
创伤性脑损伤(TBI)是一种导致脑部神经元受损的突发性损伤。在重度TBI中,例如由车祸、运动碰撞或爆炸引起的冲击伤,机械力可能破坏细胞结构,引发炎症、氧化应激、兴奋性毒性,最终导致神经元死亡1,2。
视网膜是中枢神经系统(CNS)中最易接近的部分,已被用作研究兴奋性毒性分子机制以及开发治疗干预策略的创伤性脑损伤(TBI)模型系统3,4,5。用于TBI研究的最相关的视网膜模型包括视神经 crush 模型和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的视网膜兴奋性毒性模型。在NMDA诱导的兴奋性毒性视网膜模型中,视网膜神经节细胞(RGCs)被确定为最易受损伤的视网膜神经元类型,因为RGCs以谷氨酸作为主要的兴奋性神经递质,并通过多种类型的谷氨酸受体(包括AMPA受体(AMPARs)、KAPA受体(KAPARs)和NMDA受体)来触发动作电位6。除了RGCs外,其他视网膜细胞和神经回路也可能受到NMDA处理的影响7,8,9。玻璃体内注射NMDA会导致NMDA受体持续开放,从而引起过量钙离子内流进入细胞,导致神经元过度兴奋和钙稳态失衡10,11,12,13。
NMDA受体是由三个亚基组成的异源复合物:GluN1、GluN2和GluN314,15,16,17,18。GluN1由Grin1基因编码,由于Grin1的可变剪接,在小鼠中存在八种亚型。GluN2有四种不同的亚基(a-d),分别由四个独立的基因Grin2a-2d编码。GluN3有两种不同的亚基(a和b),分别由Grin3a和Grin3b编码。根据单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据19,20,Grin1在大多数视网膜神经节细胞(RGC)亚型中高表达(图1A),在少数无长突细胞(AC)亚型中呈弱至中等水平表达(图1B)。Grin2a在较少的RGC和AC亚型中富集,而Grin2b在大多数RGC和许多AC亚型中呈中等水平表达(图1A、B)。Grin2c、Grin2d和Grin3b在RGC和AC中的表达水平极低(图1A、B)。Grin3a的表达可见于少数RGC亚型,并在少数AC中呈弱表达(图1A、B)。除了NMDA受体的作用外,通过钙通透性AMPAR介导的钙内流所引发的兴奋性毒性已在多种疾病模型中被报道21。NMDA受体亚基的表达模式可能为解释为何NMDA诱导的兴奋性毒性主要靶向RGC和AC提供线索9,10,14,22,23。
评估NMDA诱导的视网膜表型的传统方法包括使用苏木精和伊红(H&E)染色检测组织学异常、TUNEL法检测细胞死亡,以及利用细胞类型特异性生物标志物进行免疫荧光(IF)染色8,10,24,25,26。在细胞水平上,共聚焦成像和染料填充技术已被用于研究NMDA诱导视网膜模型中视网膜神经节细胞(RGCs)死亡过程的事件序列。这些方法为了解死亡RGCs的亚细胞结构提供了重要见解,并有助于鉴定在NMDA损伤下仍能存活的耐受性RGC类型27,28。
本研究采用基因激活型碱性磷酸酶(AP)染色法,研究NMDA诱导的兴奋性毒性条件下小鼠视网膜神经元的解剖特征和表型29,30,31。选择该方法的原因在于其操作简便、成本低廉,并能够全面展示整个视网膜中各类神经元亚型的解剖学特征,因而非常适合进行宏观评估和大规模比较分析。该方法为不同基因标记的视网膜神经元在整体及亚细胞水平上对NMDA的反应提供了新的见解。我们预计该策略可广泛应用于评估多种影响神经元结构和突触组织的疾病模型中的形态学变化4,26,32,33。
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所有动物实验均遵循美国公共卫生服务部关于实验动物人道护理和使用的政策,并经休斯顿德克萨斯大学麦戈文医学院机构动物护理和使用委员会批准。溶液的成分列于材料表中。
1. 他莫昔芬注射
2. 将NMDA溶液注射到小鼠眼睛中
3. 组织采集与碱性磷酸酶(AP)染色
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向玻璃体注射NMDA可诱导视网膜神经节细胞(RGC)死亡,传统上通过组织学染色或使用RGC标志物的免疫荧光(IF)染色来检测。在本实验条件下,采用针对泛RGC标志物RBPMS的传统IF方法,我们证实,在注射NMDA后1周,RGC数量减少了约65%(图2E-G)。先前的研究发现,表达Tbr2的RGC确实是内在光敏性视网膜神经节细胞(ipRGC)34,35。通过对Tbr2CreER2; RosaiAP小鼠视网膜进行碱性磷酸酶(AP)染色,我们观察到仅少量表达Tbr2的RGC存活,而大多数表达Tbr2的RGC和无长突细胞(ACs)在注射后1周已消失(比较 图2A、B)34,...
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在本研究中,我们利用一种基因定向的稀疏AP标记系统,并结合多种基因改造的小鼠品系,检测了NMDA诱导的多种RGC和AC亚型中的退行性事件,发现了若干特征性表型29,31,39。最显著的表型是NMDA注射视网膜中RGCs和ACs数量显著减少(图2A-D),这与以往使用细胞类型特异性报告基因小鼠品系或全RGC标记物进行免疫荧光染色的研究结果一致(图2E-F)。我们先前发现,表达Tbr2的RGC本质上即为ipRGCs34,35,40。尽管许多先前的研究表明ipRGCs对NMDA损伤更具抵抗...
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作者声明无竞争利益。
本研究获得了美国国立卫生研究院-国立眼科研究所向 C.A.M. 提供的资助(项目编号:EY024376),以及国立眼科研究所视觉核心资助 P30EY028102(德克萨斯大学健康科学中心,UTHealth)的部分支持。我们还感谢 Stephen Lasher 捐赠基金(德克萨斯大学健康科学中心)和 Raye White 捐赠基金(德克萨斯大学健康科学中心)提供的财政支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5% 红霉素眼膏 | Bausch+Lomb | 24208-910-55 | |
| 0.5% 盐酸丙帕他卡因 | Bausch+Lomb | 24208-730-06 | |
| 10% 中性缓冲福尔马林 | VWR | 89370-094 | |
| 10 cm 培养皿 | Corning | 430167 | |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399 | 用水稀释制备 1x PBS,并进行高压灭菌。 |
| 2.0 ml 离心管 | VWR | 525-1136 | |
| 30 号注射针头 | EXELINT International | 26437 | |
| 30 mm 培养皿 | Falcon | 35208 | |
| 苯甲醇 | Acros Organics | 447000010 | |
| 苯甲酸苄酯 | Acros Organics | 105860010 | |
| 硝酸纤维素膜滤器 | Cytiva | 7188-002 | |
| 盖玻片 | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
| 双面胶带 | Scotch | 597020 | |
| 乙醇 | Decon Labs | 2716 | 碱性磷酸酶染色后脱水时避免使用 Fisher Bioreagents(货号:BP2818),该试剂会导致视网膜变形。 |
| 镊子 | TED PELLA | 505 | |
| 加热垫 | Theratherm | 710298-001 | |
| 胰岛素注射器 | BD | 329424 | |
| 氯胺酮 | Dechra | 17033010110 | |
| 显微镜 | Zeiss | Axio Imager 2 | |
| 指甲油 | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Nanofil 注射器 | World Precision Instruments | NANOFIL | |
| Nanofil 针头 | World Precision Instruments | NF25BL | |
| NBT/BICP 试剂盒 | Invitrogen | N6547 | |
| NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| 画笔 | Kingart | 6650 | |
| 载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 体视显微镜 | Motic | DM143 | |
| 葵花籽油 | Sigma-Aldrich | S5007 | |
| 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 | 将他莫昔芬溶液储存于 4 °C 避光盒中,一周内使用完毕。 |
| Vanna 剪刀 | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| 水浴锅 | Lab-Line | 18052 | |
| 赛拉嗪 | Dechra | 17033-0099-05 | 商品名:Rompun |
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