我们描述了一种从无虹膜症患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）生成角膜类器官的实验方案，从而建立用于研究角膜疾病患者特异性的模型。这些类器官模拟了角膜关键的结构和功能特征，提供了一种可靠的 体外 研究疾病机制、测试潜在疗法以及推进眼前段疾病个性化再生治疗策略的平台。
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我们描述了一种从无虹膜症患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）生成角膜类器官的实验方案，从而建立用于研究角膜疾病患者特异性的模型。这些类器官模拟了角膜关键的结构和功能特征，提供了一种可靠的 体外 研究疾病机制、测试潜在疗法以及推进眼前段疾病个性化再生治疗策略的平台。
无虹膜症是一种罕见的先天性眼部疾病，其特征是虹膜部分或完全缺失，常伴有角膜混浊和角膜缘干细胞缺乏。导致该病的遗传突变主要影响PAX6基因，从而破坏角膜的发育和功能。除虹膜缺陷外，最常见的 ocular 特征包括眼球震颤、黄斑发育不全、白内障、青光眼以及无虹膜相关性角膜病变（AAK）。尽管体内模型为研究无虹膜症的病理机制提供了重要见解，但来源于患者的体外模型对于探究疾病机制和评估潜在治疗方法至关重要。在本研究中，我们建立了一种利用患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）构建的体外 AAK 模型。我们的方案通过将iPSCs逐步分化为自组装三维类器官中的角膜上皮样细胞，模拟了天然角膜的微环境。通过优化分化培养条件，我们成功生成了包含不同角膜细胞群体的角膜类器官，重现了人角膜的关键结构和功能特征。
角膜是一种无血管的透明组织，构成眼球的最外层，主要由三层结构组成：外层的上皮层、含有富含胶原蛋白的细胞外基质并分布有角膜基质细胞的基质层，以及内皮细胞层1。角膜在视觉中起着关键作用，既保护眼内结构，又具有屈光功能。
无虹膜症是一种罕见的先天性全眼球疾病，主要由配对盒基因6（PAX6）的杂合突变引起，该基因是眼发育的主要调控因子，其特征为虹膜部分或完全缺失2。除了虹膜发育不全或缺失外，大多数患者会逐渐出现一系列角膜异常，统称为无虹膜相关性角膜病变（AAK），包括上皮缺损、角膜缘干细胞功能障碍、基质改变以及进行性角膜混浊，最终导致视力受损。约78%–90%的无虹膜症患者会出现AAK，且病情随时间推移而加重3。本研究旨在建立一种详细且可重复的实验方案，利用无虹膜症患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）体外生成角膜类器官，以模拟与疾病相关的角膜病变。虽然动物模型和ex vivo研究已为无虹膜症的发病机制提供了重要见解，但物种特异性差异以及患者组织获取受限，限制了其转化应用价值。
由人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的类器官已成为模拟人类发育和疾病的强大体外（in vitro）系统
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所有操作均按照伦理委员会的指南进行。本研究已在人类多能干细胞注册库（Human Pluripotent Stem Cell Registry, hPSCreg）数据库中注册，伦理批准文件编号为法国高等教育、研究与创新部（Ministère de l'Enseignement Supérieur, de la Recherche et de l'Innovation, MESRI；IE-2018-967）9。诱导多能干细胞（iPSCs） 的编号分别为AAKIPSi001-A（AAK1）、AAKIPSi002-A（AAK2）、AAKIPSi003-A（AAK3）以及来自健康供体的WT。此外，哈切特佩大学（Hacettepe University）伦理委员会已批准本研究的使用，批准文号为16969557-1213。本研究中使用的人类细胞系在获取时需获得国家监管机构的授权。该授权是在一个由其中一位作者参与的联合项目框架下获得的。尽管本论文不直接属于该联合项目，但所使用的生物材料是在该项目的伦理框架内获取并获得授权的。因此，引用该大学的批准文件以确保完全的监管透明性是恰当的。本方案中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息均列于材料表中。所有实验操作均在层流生物安全柜（BSL-2）内进行，以维持无菌环境。该设置可确保研究中使用的所有材料和设备均得到充分灭菌，从而最大限度地降低污染风险，并保证实验结果的完整性。
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人类诱导多能干细胞（hiPSCs）的干性
为评估实验中使用的人诱导多能干细胞（iPSCs）的干性，我们进行了明场成像、免疫染色和定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析。我们检测了关键多能性标志物的表达，包括OCT3/4、SOX2和NANOG，这些是维持人类多能干细胞多能性与自我更新能力所需的核心转录因子11。
明场成像显示典型的多能干细胞形态，表现为边界清晰的紧密集落（图 2A）。免疫荧光染色显示蛋白在细胞核中强烈定位 OCT3/4 和 NANOG 在对照组和患者来源的iPSCs中（图2B），与未分化多能状态一致。qRT-PCR 分析显示高水平表达 SOX2 和 OCT3/4, 各组间无显著差异，表.......
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对照类器官与无虹膜症患者来源类器官之间的比较分析揭示了上皮分层缺陷、细胞外基质沉积异常以及PAX6基因表达失调9。
来自不同无虹膜症患者样本的诱导多能干细胞（iPSCs）的生长速率存在差异，具体表现为AAK1、AAK2和AAK3细胞系之间的不同，这可能反映了潜在的遗传异质性，主要由PAX6基因突变引起，可能导致细胞重编程效率和干细胞行为的差异，从而体现每位患者独特的细胞特征17。这些生长速率的差异可为无虹膜症的疾病机制提供有价值的见解，并指导个体化治疗策略的开发9。
这种由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的角膜类器官系统可作为患者特异性的模型，用于研究与无虹膜症相关的病理生理机制，并为高通量药物筛选和基因编辑方法提供平台。通过弥合传统细胞培养与动物模型之间的差距，该研究为针对无虹膜症患者角膜异常的个体化治疗策略的开发奠定了基础
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本研究由土耳其科学技术研究理事会（TÜBİTAK 121N276）和欧洲罕见病联合计划资助，并得到欧盟（“地平线2020”ERA主席计划，RareBoost项目资助编号：952346）的部分支持。A.C.K. 受土耳其高等教育委员会（YÖK）100/2000博士奖学金和土耳其科学技术研究理事会-科学与技术研究委员会（TÜBİTAK-BİDEB）2211A奖学金的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 血清移液管 | ZA Biotekno | Labselect SP-003-10 | |
| 15 mL 圆底离心管 | Labselect | CT-002-15A | |
| 2 mL 血清移液管 | Labselect | Labselect SP-003-2 | |
| 5 mL 血清移液管 | Cleanteks | Biofil GSP010005 | |
| 50 mL 圆底离心管 | Golden Gate | CT-002-50 | |
| 50 mL 血清移液管 | BIOFILL | GSP020050 | |
| 抗小鼠 594 | Jackson Immuno | 715-585-150 | 稀释范围：1:100 - 1:800 |
| 抗兔 488 | Jackson Immuno | 711-545-152 | 稀释范围：1:100 - 1:800 |
| 台式蒸汽灭菌器 VAPOUR-Line lite | VWR chemicals | VAPOUR-Lineeco 25 | |
| B27 添加剂 | GIBCO | 12587010 | 含维生素 A |
| 台式离心机 | Eppendorf | 5702 | |
| 倒置显微镜 DMI1 | Olympus | CKX41 | |
| II 级生物安全柜 | Thermo | Safe 2020 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| CellBanker 1 | Worthington Industries | LABS-20K | |
| 盖玻片 24 mm × 50 mm | ISOLAB | 280 | |
| 包埋剂 OCT | Fisher Healthcare | 30226281 | |
| 冻存管 | BioSigma | N403522 | |
| DAPI | NEOFROXX | 1322 | |
| DAPI | NEOFROXX | 1539 | 0.5 µg/mL |
| DMEM/F12 培养基 | GIBCO | 31330-038 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS) | Gibco | 14190144 | 1× |
| EGF | GIBCO | PHG0311 | |
| 100% 乙醇 | Sigma | 64-17-5 | |
| 70% 乙醇 | Sigma | 64-17-5 | 乙醇稀释液 |
| 细胞外基质 (ECM) | Corning | 354277 | 无 LDEV |
| FGF2 | GIBCO | PHG0024 | |
| GlutaMax | GIBCO | 35050061 | |
| GoTaq Master Mix | Promega | M7123 | |
| 培养箱 | Memmert INCO 153 med | 44043 | |
| 胰岛素-硒-转铁蛋白 | GIBCO | 41400045 | |
| 无血清胎牛替代物 (KOSR) | GIBCO | 10828028 | |
| 切片机 RM2235 | Leica | RM2235 | |
| 封片剂 | abcam | ab104135 | |
| mTSER 培养基 | STEMCELL | 85850 | |
| 多孔培养板 (6 孔) | CORNING | 3516 | |
| N2 添加剂 | R&D | AR003 | |
| 非必需氨基酸 (NEAA) | LONZA | BE13-114E | |
| P20、P200 和 P1000 移液器 | Gilson | F167350 | |
| 石蜡 | VWR chemicals | 10048502 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 一抗 Aquaporin mAb | abcam | ab9566 | 稀释范围：1:50–1:200 |
| 一抗 CK14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 稀释范围：1:50–1:500 |
| 一抗 CK19 | ProteinTech | 14965-1-AP | 稀释范围：1:150–1:600 |
| 一抗 CK3 | NOVUS | NBP2-91997 0.1 mL | 稀释范围：1:50–1:200 |
| 一抗 CK5 | Thermo | MA517057 | 稀释范围：1:200–1:1000 |
| 一抗 IV 型胶原蛋白 | abcam | ab6586 | 稀释范围：1:100–1:500 |
| 一抗 Keratocan | Bioss | bs-11054R | 稀释范围：1:50–1:200 |
| 一抗 Na/K-ATP酶 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21712 | 稀释范围：1:50–1:500 |
| 一抗 N-钙黏蛋白 | abcam | ab76011 | 稀释范围：1:50–1:500 |
| 一抗 p63 | SANTACRUZ | sc-25268 | 稀释范围：1:50–1:500 |
| 一抗 Pax6 | Novus | NBP2-44576 | 稀释范围：1:50–1:200 |
| RNA 提取试剂盒 | Macherey–Nagel | 740984.50 | |
| ROCK 抑制剂 (Y-27632) | TOCRIS | 1254 | |
| 载玻片 | StarFrost | MBB-0302-55A | 带粘附层，磨砂 |
| 不锈钢镊子 5 号 | Sigma | F6521-1EA | |
| 不锈钢无菌手术刀 21 号 | Swann-Morton | 1033060 | |
| OneScript Plus cDNA 合成试剂盒 | Applied Biological Materials | G236 | |
| Triton-X100 | NEOFROXX | 8500 | |
| TRIzol 试剂 | Thermo | 15596026 | |
| 台盼蓝 | GIBCO | 15250061 | |
| 超低吸附 (ULA) 6 孔板 | Corning | 3471 | |
| 水浴锅 | Nüve | Nb9 |
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