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方法文章

患者特异性诱导多能干细胞衍生的角膜类器官用于研究与无虹膜症相关的角膜疾病

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DOI：

10.3791/68556

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2026年7月28日

 ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Izmir International Biomedicine and Genome Institute, Dokuz Eylül University, 3Department of Medical Biology and Genetics, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University

本文内容

摘要

我们描述了一种从无虹膜症患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）生成角膜类器官的实验方案，从而建立用于研究角膜疾病患者特异性的模型。这些类器官模拟了角膜关键的结构和功能特征，提供了一种可靠的 体外 研究疾病机制、测试潜在疗法以及推进眼前段疾病个性化再生治疗策略的平台。

摘要

无虹膜症是一种罕见的先天性眼部疾病，其特征是虹膜部分或完全缺失，常伴有角膜混浊和角膜缘干细胞缺乏。导致该病的遗传突变主要影响PAX6基因，从而破坏角膜的发育和功能。除虹膜缺陷外，最常见的 ocular 特征包括眼球震颤、黄斑发育不全、白内障、青光眼以及无虹膜相关性角膜病变（AAK）。尽管体内模型为研究无虹膜症的病理机制提供了重要见解，但来源于患者的体外模型对于探究疾病机制和评估潜在治疗方法至关重要。在本研究中，我们建立了一种利用患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）构建的体外 AAK 模型。我们的方案通过将iPSCs逐步分化为自组装三维类器官中的角膜上皮样细胞，模拟了天然角膜的微环境。通过优化分化培养条件，我们成功生成了包含不同角膜细胞群体的角膜类器官，重现了人角膜的关键结构和功能特征。

引言

角膜是一种无血管的透明组织，构成眼球的最外层，主要由三层结构组成：外层的上皮层、含有富含胶原蛋白的细胞外基质并分布有角膜基质细胞的基质层，以及内皮细胞层1。角膜在视觉中起着关键作用，既保护眼内结构，又具有屈光功能。

无虹膜症是一种罕见的先天性全眼球疾病，主要由配对盒基因6（PAX6）的杂合突变引起，该基因是眼发育的主要调控因子，其特征为虹膜部分或完全缺失2。除了虹膜发育不全或缺失外，大多数患者会逐渐出现一系列角膜异常，统称为无虹膜相关性角膜病变（AAK），包括上皮缺损、角膜缘干细胞功能障碍、基质改变以及进行性角膜混浊，最终导致视力受损。约78%–90%的无虹膜症患者会出现AAK，且病情随时间推移而加重3。本研究旨在建立一种详细且可重复的实验方案，利用无虹膜症患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）体外生成角膜类器官，以模拟与疾病相关的角膜病变。虽然动物模型和ex vivo研究已为无虹膜症的发病机制提供了重要见解，但物种特异性差异以及患者组织获取受限，限制了其转化应用价值。

由人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的类器官已成为模拟人类发育和疾病的强大体外（in vitro）系统4,5。角膜类器官尤其能够生成三维组织样结构，相较于缺乏空间结构、生理性的细胞间相互作用以及微环境复杂性的传统二维单层培养，其更接近天然角膜结构，包括分层的上皮组织、基质-上皮相互作用以及细胞外基质沉积4,5。已有多种分化策略被报道可用于从iPSC生成类似角膜的组织，包括基于SEAM的方法和以眼源性祖细胞驱动的方法6。这些方法通常包括初始的眼部谱系诱导阶段，随后从异质性的眼源性祖细胞群体中逐步进行组织特化与筛选。构建角膜类器官为研究角膜组织中存在的不同类型细胞提供了可能7,8。此外，来自无虹膜症患者iPSC的角膜类器官可用于研究该疾病的遗传背景，并为无虹膜症的研究提供了独特的机会。

在本实验方案中，野生型和无虹膜症来源的iPSC细胞系均采用相同的多阶段分化策略，在长期（数周）培养过程中依次暴露于分化培养基（DM）、视网膜分化培养基（RDM）和角膜分化培养基（CDM）中。其中一个关键实验步骤是从贴壁培养转为悬浮培养，此过程中保留选定的角膜样区域，以促进上皮细胞的自我组织化。

尽管该方法能够可重复地生成适用于比较性疾病建模的类角膜上皮结构，但并未完全重现复杂的 体内 神经支配或完整的角膜缘微环境结构等特征，在评估该方法的适用性时应予以考虑。

在此背景下，我们描述了一种标准化的方案，用于从携带与无虹膜症相关的PAX6突变的患者来源诱导性多能干细胞（iPSCs）生成角膜类器官。重要的是，该分化策略在野生型和无虹膜症来源的细胞系之间并未进行修改；相反，在整体统一的实验框架下，疾病特异性表型源自患者特异性的遗传背景。

总体而言，该方法为研究角膜发育及与无虹膜症相关的疾病机制提供了一个稳健且可重复的平台，并可能为未来的机制性研究和转化研究奠定基础。

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方案

所有操作均按照伦理委员会的指南进行。本研究已在人类多能干细胞注册库（Human Pluripotent Stem Cell Registry, hPSCreg）数据库中注册，伦理批准文件编号为法国高等教育、研究与创新部（Ministère de l'Enseignement Supérieur, de la Recherche et de l'Innovation, MESRI；IE-2018-967）9。诱导多能干细胞（iPSCs） 的编号分别为AAKIPSi001-A（AAK1）、AAKIPSi002-A（AAK2）、AAKIPSi003-A（AAK3）以及来自健康供体的WT。此外，哈切特佩大学（Hacettepe University）伦理委员会已批准本研究的使用，批准文号为16969557-1213。本研究中使用的人类细胞系在获取时需获得国家监管机构的授权。该授权是在一个由其中一位作者参与的联合项目框架下获得的。尽管本论文不直接属于该联合项目，但所使用的生物材料是在该项目的伦理框架内获取并获得授权的。因此，引用该大学的批准文件以确保完全的监管透明性是恰当的。本方案中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息均列于材料表中。所有实验操作均在层流生物安全柜（BSL-2）内进行，以维持无菌环境。该设置可确保研究中使用的所有材料和设备均得到充分灭菌，从而最大限度地降低污染风险，并保证实验结果的完整性。

1. 人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源的角膜类器官的生成

  1. 在无饲养层条件培养基中维持和初始培养无虹膜症患者来源的人诱导性多能干细胞（AAK1、AAK2、AAK3）10（图1）
    1. 提前准备以下步骤：在6孔板中用1 mL冰上保存的细胞外基质（ECM）溶液（浓度为0.1 mg/mL）包被一个孔。此包被过程必须在冰上操作，以防止ECM凝固，并在37 °C下孵育至少30分钟，遵循制造商说明，确保基底正确制备。
    2. 解冻一份冷冻保存的1 × 106个hiPSC（WT、AAK1、AAK2、AAK3）分装样品。不要完全解冻冷冻细胞；相反，让冻存管中的细胞悬液解冻至大约一半体积仍处于冻结状态即可。
    3. 立即将部分解冻的细胞悬液转移至含有10 µM Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂的1 mL室温（RT）完全维持培养基中，该培养基已预先分装于15 mL离心管中。转移过程中不得使用任何移液器。
    4. 以300 × g离心5分钟，弃去上清液。
    5. 随后将细胞重悬于1 mL含10 µM ROCK 抑制剂的完全维持培养基中。
    6. 使用台盼蓝排斥法测定细胞密度。用血细胞计数板在台盼蓝染色后计数细胞。简要步骤如下：将20 µL细胞悬液与20 µL 0.4%台盼蓝按1:1混合，再加入60 µL PBS，最终形成原始细胞悬液1:5的稀释液。取10 µL该混合液加入血细胞计数板计数室。计数四个大方格中存活的（台盼蓝阴性）细胞。计算每个大方格的平均细胞数，乘以5（细胞悬液稀释倍数）和10,000，以确定最终细胞浓度（细胞/mL）。
      ​细胞/mL =（每方格平均细胞数）× 5 × 104
    7. 将细胞接种至6孔板中预先包被ECM的孔中，确保每孔细胞密度为2 × 104 个细胞/cm2。
    8. 使用10倍放大倍率的相差显微镜观察细胞形态和贴壁情况。然后将6孔板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育，以确保最佳生长环境。
      注：ROCK 抑制剂仅在传代或解冻细胞时过夜使用。日常换液时，应沿孔壁轻柔加入培养基。避免将完全维持培养基在水浴中预热；使用前应在室温下平衡15分钟。
  2. 自发分化阶段（第0–2天）
    1. 通过混合以下成分制备分化培养基（DM）：8% KnockOut血清替代物（KSR）、1×非必需氨基酸（NEAA）、1× Glutamax、1×青霉素-链霉素和DMEM/F-12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12 Ham）。
    2. 当hiPSC培养物达到约70%–80%汇合度时，为诱导自发分化8，轻柔吸除并完全弃去原有培养基，随后每日更换为每孔1 mL新鲜DM，直至第3天，此时根据实验时间表启动视网膜分化阶段。
  3. 视网膜分化阶段（第3–47天）
    ​注：使用视网膜分化培养基（RDM）进行长期培养，以促进异质性眼祖细胞群体的形成。
    1. 通过混合以下成分制备视网膜分化培养基（RDM）：8% KSR、1× NEAA、1× Glutamax、2% B27、1×青霉素-链霉素和DMEM/F-12。
    2. 经过2天自发分化后，每日更新培养基，小心吸除DM并替换为每孔1 mL新鲜RDM。此过程持续共30天。
      注：在此30天期间，预计细胞密度将显著增加。必须对每个孔不同区域的细胞密度进行显微镜观察。为防止细胞脱落，应避免洗涤操作，换液时需格外小心。应沿孔壁加入培养基 。使用前将培养基在室温下平衡15分钟。
    3. 至第32天，细胞达到明显汇合状态，并形成多层2.5D聚集体。此时，使用1000 µL移液枪头轻轻刮取整个孔，启动向悬浮培养的过渡。在此过程中，将细胞层破碎为小细胞簇。
      ​注：尽管所有细胞均从培养表面释放，但优先收集多层2.5D聚集体并转移至悬浮培养（补充图1），因为其富集可促进比单个细胞或单层碎片更快的自组装及更大类器官的形成。
    4. 刮取后立即收集所得细胞簇，并转移至含有RDM的低吸附6孔培养板中，以建立悬浮培养条件。
    5. 继续悬浮培养15天，每日更换培养基，每孔加入2 mL新鲜RDM。在悬浮培养的前两天，避免换液以防止小细胞簇丢失。在悬浮培养期间，细胞逐渐自组织，形成三维透明的角膜样结构，需定期使用4倍和10倍放大倍率的相差显微镜进行监测。
  4. 角膜分化阶段（第48–90天）
    1. 通过混合以下成分制备角膜分化培养基（CDM）：8% KOSR、1× NEAA、1× Glutamax、1× N2-MAX、1×胰岛素-转铁蛋白-硒、5 ng/mL FGF2、10 ng/mL EGF和DMEM/F-12。
    2. 在低吸附板中进行初始15天（第32–47天）悬浮培养（37 °C，5% CO₂）后，于第47天将RDM更换为CDM，同时维持聚集体处于悬浮状态。每隔一天更换一次CDM，每孔2 mL ，确保类器官始终完全浸没在培养基中。在此期间，透明的、气泡状的角膜原基（CP）结构将逐步出现。
    3. 继续在CDM中进行悬浮培养至第90天，以促进透明CP区域与更不透明组织区之间的进一步成熟和空间分离。
    4. 在第90天，当需要进行针对CP的下游分析时，使用灭菌镊子和精细镊子机械分离透明的CP区域与不透明的组织区。
      ​注：仅当分析特别需要富含CP的结构时，才进行CP区域的机械分离。若其他组织区或整体类器官结构是研究重点，则可保持类器官完整，以保留其结构异质性。
    5. 根据实验目的，继续在CDM中对分离的CP结构或完整类器官进行悬浮培养。

2. 角膜类器官的表征

  1. 类器官的形态学与结构评估
    1. 使用明场显微镜在4倍和10倍放大倍数下定期观察角膜类器官。在规定的时间点评估其大小、透明度和整体形态，并通过图像采集记录结构变化。
  2. 基于免疫荧光的表征
    1. 角膜类器官固定
      1. 固定前准备4%多聚甲醛（PFA）和30%蔗糖溶液。用灭菌的刮勺从培养物中取出角膜类器官，转移至含有4% PFA的1.5 mL离心管中，在室温下孵育20分钟。
      2. 孵育后，小心弃去管中的PFA，避免损伤角膜类器官。向管中加入1 mL 30%蔗糖溶液，并置于4 °C冰箱中。24小时后，准备并标记5 mL离心管和液氮，用于OCT包埋。
      3. 小心弃去管中的蔗糖溶液，将类器官转移至无菌刮勺中。使用20 µL移液器小心吸除类器官表面多余的蔗糖溶液。
      4. 将OCT包埋剂倒入5 mL离心管盖中，将类器官放入OCT中。使用另一个无菌刮勺将类器官转移至含有OCT的管盖内。
      5. 添加OCT以完全覆盖角膜类器官表面。用针头刺破OCT中的气泡，以获得清晰的类器官切片。
      6. 盖紧5 mL离心管盖，用镊子夹住并浸入液氮中。将样本储存于-20 °C直至切片。
      7. 使用冷冻切片机将样本切成5 µm厚度 ，切片后继续储存在-20 °C直至染色。保持切片厚度和组织方向的一致性，以确保染色结果可重复。
    2. 免疫荧光染色
      1. 为进行免疫荧光染色，将载玻片用PBS-T（0.3% Triton X-100）在室温下清洗3次，每次10分钟。
      2. 用纸巾擦干载玻片，并用PAP笔在组织周围画圈。加入适量封闭液，完全覆盖组织切片（通常每张载玻片100–200 µL，具体体积取决于PAP笔画出的区域），在室温下孵育1小时。
      3. 吸除封闭液，再次用PAP笔画圈。向载玻片上加入150 μL一抗溶液（PAX6、p63、OCT3/4、NANOG、Na+/K+-ATPase、AQP1、CK3、CK5、CK14、CK19、N-cad、KERA、COLIV，稀释比例见材料表），在室温下孵育1小时。
      4. 用PBS-T（0.3% Triton X-100）在室温下清洗2次，每次10分钟。再次用PAP笔画圈。
      5. 向载玻片上加入150 μL二抗溶液（Anti Rabbit-488、Anti Mouse-594，稀释比例见材料表），在避光条件下室温孵育2小时。再用PBS-T（0.3% Triton-X）在室温下清洗2次，每次10分钟。清洗载玻片后用DAPI封片剂封片。
      6. 对于未分化的iPSCs，在固定后进行封闭和通透处理，并按照相同方案进行染色。使用 荧光显微镜或共聚焦显微镜在4倍和10倍放大倍数下观察染色样本。

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结果

人类诱导多能干细胞（hiPSCs）的干性

为评估实验中使用的人诱导多能干细胞（iPSCs）的干性，我们进行了明场成像、免疫染色和定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析。我们检测了关键多能性标志物的表达，包括OCT3/4、SOX2和NANOG，这些是维持人类多能干细胞多能性与自我更新能力所需的核心转录因子11。

明场成像显示典型的多能干细胞形态，表现为边界清晰的紧密集落（图 2A）。免疫荧光染色显示蛋白在细胞核中强烈定位 OCT3/4 和 NANOG 在对照组和患者来源的iPSCs中（图2B），与未分化多能状态一致。qRT-PCR 分析显示高水平表达 SOX2 和 OCT3/4, 各组间无显著差异，表...

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讨论

对照类器官与无虹膜症患者来源类器官之间的比较分析揭示了上皮分层缺陷、细胞外基质沉积异常以及PAX6基因表达失调9。

来自不同无虹膜症患者样本的诱导多能干细胞（iPSCs）的生长速率存在差异，具体表现为AAK1、AAK2和AAK3细胞系之间的不同，这可能反映了潜在的遗传异质性，主要由PAX6基因突变引起，可能导致细胞重编程效率和干细胞行为的差异，从而体现每位患者独特的细胞特征17。这些生长速率的差异可为无虹膜症的疾病机制提供有价值的见解，并指导个体化治疗策略的开发9。

这种由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的角膜类器官系统可作为患者特异性的模型，用于研究与无虹膜症相关的病理生理机制，并为高通量药物筛选和基因编辑方法提供平台。通过弥合传统细胞培养与动物模型之间的差距，该研究为针对无虹膜症患者角膜异常的个体化治疗策略的开发奠定了基础

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致谢

本研究由土耳其科学技术研究理事会（TÜBİTAK 121N276）和欧洲罕见病联合计划资助，并得到欧盟（“地平线2020”ERA主席计划，RareBoost项目资助编号：952346）的部分支持。A.C.K. 受土耳其高等教育委员会（YÖK）100/2000博士奖学金和土耳其科学技术研究理事会-科学与技术研究委员会（TÜBİTAK-BİDEB）2211A奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 mL 血清移液管ZA BioteknoLabselect SP-003-10
15 mL 圆底离心管 Labselect CT-002-15A
2 mL 血清移液管Labselect Labselect SP-003-2
5 mL 血清移液管CleanteksBiofil GSP010005
50 mL 圆底离心管Golden Gate CT-002-50
50 mL 血清移液管BIOFILLGSP020050
抗小鼠 594Jackson Immuno715-585-150稀释范围：1:100 - 1:800
抗兔 488 Jackson Immuno711-545-152稀释范围：1:100 - 1:800
台式蒸汽灭菌器 VAPOUR-Line liteVWR chemicalsVAPOUR-Lineeco 25
B27 添加剂GIBCO12587010含维生素 A
台式离心机Eppendorf5702
倒置显微镜 DMI1OlympusCKX41
II 级生物安全柜ThermoSafe 2020
牛血清白蛋白 (BSA)Sigma-AldrichA8806
CellBanker 1Worthington IndustriesLABS-20K
盖玻片 24 mm × 50 mmISOLAB280
包埋剂 OCTFisher Healthcare30226281
冻存管BioSigmaN403522
DAPINEOFROXX 1322
DAPINEOFROXX 15390.5 µg/mL
DMEM/F12 培养基GIBCO 31330-038
杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS)Gibco141901441×
EGFGIBCOPHG0311
100% 乙醇Sigma64-17-5
70% 乙醇Sigma64-17-5乙醇稀释液
细胞外基质 (ECM)Corning354277无 LDEV
FGF2GIBCOPHG0024
GlutaMaxGIBCO35050061
GoTaq Master MixPromegaM7123
培养箱Memmert INCO 153 med44043
胰岛素-硒-转铁蛋白GIBCO41400045
无血清胎牛替代物 (KOSR)GIBCO10828028
切片机 RM2235LeicaRM2235
封片剂abcamab104135
mTSER 培养基STEMCELL85850
多孔培养板 (6 孔)CORNING   3516
N2 添加剂R&DAR003
非必需氨基酸 (NEAA)LONZABE13-114E
P20、P200 和 P1000 移液器GilsonF167350
石蜡VWR chemicals10048502
多聚甲醛 Sigma-AldrichF8775
一抗 Aquaporin mAbabcamab9566稀释范围：1:50–1:200
一抗 CK14Santa Cruz Biotechnology sc-53253稀释范围：1:50–1:500
一抗 CK19ProteinTech14965-1-AP稀释范围：1:150–1:600
一抗 CK3NOVUSNBP2-91997 0.1 mL稀释范围：1:50–1:200
一抗 CK5Thermo MA517057稀释范围：1:200–1:1000
一抗 IV 型胶原蛋白abcamab6586稀释范围：1:100–1:500
一抗 KeratocanBiossbs-11054R稀释范围：1:50–1:200
一抗 Na/K-ATP酶Santa Cruz Biotechnologysc-21712稀释范围：1:50–1:500
一抗 N-钙黏蛋白abcamab76011稀释范围：1:50–1:500
一抗 p63SANTACRUZ   sc-25268稀释范围：1:50–1:500
一抗 Pax6NovusNBP2-44576稀释范围：1:50–1:200
RNA 提取试剂盒Macherey–Nagel 740984.50
ROCK 抑制剂 (Y-27632)TOCRIS1254
载玻片StarFrostMBB-0302-55A带粘附层，磨砂
不锈钢镊子 5 号Sigma F6521-1EA
不锈钢无菌手术刀 21 号Swann-Morton1033060
OneScript Plus cDNA 合成试剂盒 Applied Biological MaterialsG236
Triton-X100NEOFROXX 8500
TRIzol 试剂Thermo15596026
台盼蓝GIBCO15250061
超低吸附 (ULA) 6 孔板  Corning3471
水浴锅NüveNb9

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