方法文章

保留原始肿瘤特征的患者来源胶质瘤细胞分离与长期培养的优化流程

DOI：

10.3791/68566

⸱

2025年7月8日

 , 
1Beijing Institute for Brain Research, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Chinese Institute for Brain Research

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究提出了一种建立患者来源的胶质瘤细胞系（PDGCs）的标准操作流程，以确保其遗传和表型的稳定性。利用基底膜基质提取物辅助的贴壁培养体系可促进细胞生长并提高均一性，使这些模型在药物筛选和胶质母细胞瘤（GBM）研究中具有重要价值。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性的原发性脑肿瘤，具有高度异质性和对标准治疗的耐药性。传统的胶质瘤细胞系往往无法保留患者特异性的遗传和表型特征，限制了其转化研究的价值。为解决这一问题，我们采用无血清神经干细胞培养体系建立了50株患者来源的胶质瘤细胞系（PDGCs）。本实验方案详细描述了从GBM患者获取肿瘤样本后的收集、处理及长期培养流程，以确保关键分子特征的保留。我们的方法包括酶解组织解离、红细胞裂解以及基底膜基质提取物辅助的贴壁培养，可提高细胞存活率并便于高通量药物筛选。通过对PDGCs进行全基因组测序、转录组测序和免疫荧光染色分析，证实这些细胞系保留了常见的GBM遗传改变以及神经干细胞和前体细胞标志物。此外，这些细胞在异种移植模型中表现出致瘤潜能。通过优化培养条件，本方案为构建具有生物学相关性的GBM模型提供了标准化框架，有助于推动治疗策略的发现和机制研究。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，起源于发生基因突变的神经干细胞或前体细胞1。世界卫生组织根据其病理和分子特征将胶质瘤分为1至4级，从低级别到高级别不等2。胶质母细胞瘤（GBM）是一种4级胶质瘤，约占所有胶质瘤的57%，占所有原发性中枢神经系统恶性肿瘤的48%3。GBM患者的预后较差，中位生存时间不足2年，5年生存率仅为5.4%4。标准治疗方案包括最大程度的安全切除，随后进行放疗和替莫唑胺化疗5。尽管采取了这些治疗手段，但由于GBM具有侵袭性生长特性以及对治疗的固有耐药性，目前仍无法治愈，因此迫切需要开发新的治疗方法。

研究人员通常使用人源肿瘤细胞系作为研究癌症发生和治疗机制的模型。然而，在含血清培养基中长期传代培养的经典胶质瘤细胞系 体外 与患者肿瘤相比，在表型特征和基因谱型方面表现出显著改变6,7,8因此，基于这些细胞系的临床前筛选模型往往无法识别出能在临床环境中有效转化的治疗靶点和分子。胶质母细胞瘤（GBM）的治疗效果还受到肿瘤异质性和可塑性的进一步影响。9这种异质性不仅体现在转录组亚型（例如，前神经型、间质型）上，还体现在组成细胞的多种发育状态中。10胶质母细胞瘤利用神经发育机制，并包含胶质母细胞瘤干细胞（GSC）亚群，这些亚群驱动肿瘤增殖，且对放射治疗和化学治疗表现出更强的耐受性11,12. 采用无血清神经干细胞培养基培养患者来源的胶质瘤细胞，可有效保留原始肿瘤的突变谱和基因表达模式，同时维持部分胶质瘤干细胞特性8.

与神经球培养模型相比，基于基底膜基质提取物的贴壁培养可促进更稳定和快速的细胞生长，因此更适合用于化学和遗传筛选13。利用该方法，我们建立了50株患者来源的胶质母细胞瘤（GBM）细胞系，并通过全基因组测序、转录组测序以及FDA药物库筛选对其进行表征，以探索潜在的治疗策略。该资源推动了胶质瘤研究的发展，详细结果已在我们先前的研究中发表14。本文中，我们描述了建立患者来源的胶质瘤细胞系（PDGCs）所采用的方法学。

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方案

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本方案使用通过医院合作获得的患者来源的胶质瘤组织和血液样本。所有采样程序和实验方案均已获得首都医科大学北京天坛医院伦理委员会的批准（批准号：KY 2020-093-02 和 KY 2014-021-02）。患者在手术前签署知情同意书，所有身份信息在样本转移至实验室前均进行匿名化处理。研究人员在实施本方案前，必须获得所在机构伦理委员会的批准，并取得患者的知情同意。

1. 样品处理前的准备

  1. 通过高压灭菌对剪刀、镊子及其他器械进行灭菌。
  2. 通过混合以下组分制备PDGC培养基：47.5 mL DMEM/F12、500 µL N2、1 mL B27、500 µL 100x 青霉素/链霉素、250 µL 100x 谷氨酰胺替代物、100 µL 2.5 M HEPES、100 µL 30% 葡萄糖、50 µL 50 mM β-巯基乙醇、1.5 mL 1 µg/mL 表皮生长因子（EGF）和 1.5 mL 1 µg/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
  3. 通过将8.29 g氯化铵、1 g碳酸氢钾和37 mg EDTA溶于水中，然后定容至1 L，制备1x红细胞裂解缓冲液（ACK）。
  4. 将灭菌器械、PBS缓冲液、废液容器、离心管及其他耗材放入生物安全柜中，并进行30分钟紫外消毒。
  5. 将液氮置于保温容器中。

2. 患者样本采集

注意：所有组织采集操作均须在严格无菌条件下进行，以防止后续细胞培养受到细菌污染。整个操作流程中均须保持无菌技术。

  1. 在术前采集血液样本，并从患者脑部切除肿瘤组织。对于体积较大且高度浸润性的肿瘤，当难以区分肿瘤与周围正常组织时，应在保留重要功能脑区的前提下，尽可能扩大肿瘤周围组织的切除范围。分离出约 500–2,000 mm3 的肿瘤核心组织，放入含有 10 mL 低温保存液的 15 mL 离心管中。
  2. 密封样本管，置于冰盒中，并迅速运送至实验室进行处理。
    注意：确保样本采集至处理的时间在 4 °C 条件下不超过 6 小时。在样本采集过程中，应仔细剔除烧灼组织及肿瘤坏死区域。手术中使用电刀可能导致组织切面被灼伤，从而影响细胞在培养中的存活能力。

3. 血液样本处理

  1. 将血液样本管在 1,000 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上层血浆层。
  2. 将剩余的白细胞和红细胞层转移至 50 mL 离心管中，加入 10 mL 1× ACK 溶液，在室温下孵育 5 分钟以裂解红细胞。
  3. 加入 40 mL PBS 终止裂解反应，轻轻混匀后在 1,000 × g 条件下离心 10 分钟。
  4. 弃去上清液，加入 3 mL 1× ACK 溶液，在室温下孵育 5 分钟，进行第二次红细胞裂解步骤。
  5. 加入 12 mL PBS 终止裂解反应，轻轻混匀后在 1,000 × g 条件下离心 10 分钟。
  6. 弃去上清液，将外周血单个核细胞（PBMC）沉淀重悬于 1 mL PBS 中，转移至 1.5 mL 离心管，于 510 × g 条件下离心 10 分钟。
  7. 弃去上清液，将 PBMC 沉淀用液氮速冻后，于 -80 °C 保存。

4. 肿瘤组织处理

  1. 从样本管中移除组织保存液，并用 PBS 清洗组织，以去除可见的血凝块和坏死组织。对剩余组织进行第二次 PBS 清洗。
  2. 切取最完整的组织部分，在 4 °C 条件下用 4% 多聚甲醛（PFA）固定过夜。
    注意：固定后组织大小约为 10 mm。若样本较小，可跳过此步骤。
  3. 切取 2–4 小块组织，转移至 1.5 mL 离心管中，液氮速冻后于 -80 °C 保存。
    注意：小块组织的大小通常为 5–10 mm，具体取决于测序所需的 DNA 和 RNA 量。
  4. 将剩余的肿瘤组织放入 1.5 mL 离心管中，在冰上用剪刀剪碎成细糊状。
  5. 加入 1–3 mL 细胞解离溶液，将剪碎的组织转移至消化管中，使用组织解离仪在 37 °C 消化 16 分钟。
  6. 加入 3 倍体积的 PBS 终止消化反应，将细胞悬液转移至带有 70 µm 细胞筛的离心管中。用小棒轻轻研磨组织，使其通过筛网，以最大化细胞收集效率。在 510 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。
  7. 加入 1–3 mL 1× ACK 溶液，在室温孵育 5 分钟以裂解红细胞。加入 4 倍体积的 PBS 终止裂解反应，轻轻混匀后在 510 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。
  8. 将细胞重悬于 PDGC 培养基中，取部分细胞悬液接种至培养皿中，置于 37 °C 缺氧培养箱中培养。其余细胞用含 10% DMSO 的培养基冷冻保存。
    注意：通常对于大小约为 10–20 mm 的组织样本，我们将约 1/3 至 1/10 的细胞悬液接种至含 3 mL 培养基的 6 cm 培养皿中，剩余细胞根据细胞产量分装至 2–4 支冻存管中进行冻存。
  9. 将基底膜基质提取物按 1:100 比例加入预冷的 PBS 中，加入培养板后在摇床培养箱中室温孵育 2 小时进行包被。接种 PDGC 培养基前弃去 PBS。
    注意：后续所有细胞传代和培养均应使用经基底膜基质提取物包被的培养板。
  10. 培养 2 天后，将细胞转移至经基底膜基质提取物包被的培养板中，以促进细胞贴壁和生长。

5. 细胞培养与传代

  1. 细胞贴壁于培养板后，去除未贴壁细胞，并每2-3天更换或补充一次培养基。
    注意：不同细胞的贴壁能力存在差异。即使在存在基底膜基质提取物的情况下，仍可能有少量细胞无法贴壁，例如BNI7-11需要持续悬浮培养。此外，某些细胞呈现半贴壁生长模式，如BNI20。因此，必须仔细观察细胞状态。对于非贴壁细胞，可观察到悬浮细胞数量增加。若细胞聚集体呈深色棉絮状，且随时间无明显变化，则通常无法实现长期扩增。
  2. 当细胞达到汇合状态时，加入细胞解离液使细胞脱离。用3倍体积的PBS终止解离反应，并在250 × g 条件下离心3分钟。按1:2至1:4的比例传代。将剩余细胞用含10% DMSO的培养基冷冻保存。
  3. 持续传代至少10-20代以建立稳定的细胞系。
    1. 每次传代时拍摄细胞形态图像并记录传代次数。对初始细胞冻存样本应明确标注详细信息（例如传代次数）。
    2. 细胞系稳定后，收集2-3管细胞沉淀（每管300,000-1,000,000个细胞），于-80 °C保存。

6. 后续实验操作

  1. 对于PFA固定的样本，在过夜固定后，通过一系列浓度递增的乙醇溶液进行脱水处理：依次浸入60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇，以及两次更换的100%乙醇，每次处理40分钟。随后，将样本在二甲苯中进行透明处理，更换两次，每次40分钟，然后用石蜡溶液浸润两次，每次40分钟。最后，将脱水和浸润后的样本包埋于石蜡块中，用于后续切片和染色15。
  2. 对于保存在-80 °C的PBMC沉淀、肿瘤组织或肿瘤细胞样本，提取DNA和RNA，用于开展包括全基因组测序、外显子组测序、批量RNA测序和单细胞RNA测序在内的多种组学研究，根据需要选择相应方法。
  3. 使用稳定的PDGC细胞系进行小鼠异种移植模型构建、高通量药物筛选、机制研究及其他相关实验。
    1. 为建立PDGC的颅内原位异种移植模型，将细胞解离并计数后，重悬于基底膜基质提取物与冰上预冷的PBS按1:1比例混合的溶液中，终浓度为100,000个细胞/µL。使用微量注射器和标准立体定位仪，将5 µL细胞悬液立体定向注射至6–8周龄免疫缺陷小鼠的左侧纹状体。以颅骨前囟为参考点，设定注射坐标如下：前后方向（AP）+0.5 mm，内外侧方向（ML）-1.9 mm，背腹方向（DV）-3.6 mm。
    2. 构建表达荧光素酶的PDGC细胞，并建立颅内 异种移植模型，用于 肿瘤生长的生物发光成像。
      1. 将荧光素酶-tdTomato报告基因包装至慢病毒颗粒中，随后用包装好的慢病毒感染PDGC细胞，以建立稳定表达16。
      2. 感染后，通过流式细胞术分选tdTomato阳性细胞，获得稳定表达荧光素酶的细胞群体。
      3. 成像前，使用15 mg/mL的D-荧光素溶液，按10 µL/g体重剂量经腹腔注射D-荧光素。用异氟烷麻醉小鼠，并在注射D-荧光素后等待10分钟。将小鼠放入生物发光成像系统中，成像时将曝光时间设为自动模式17。

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结果

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图1 展示了本实验方案的完整工作流程。患者样本包括外周血和肿瘤组织核心部分。血液样本经离心去除血浆后，再经过两轮ACK裂解，以获得外周血单个核细胞（PBMCs），用于测序分析的对照。肿瘤样本先用PBS洗涤以去除血凝块和坏死区域，随后被处理成小片段。多份组织碎片被冷冻保存，用于后续的DNA/RNA提取和测序；另一份完整组织则用PFA固定并石蜡包埋，用于组织学分析。剩余的肿瘤组织在冰上充分剪碎至均匀状态，再通过酶消化和机械解离制成单细胞悬液。经ACK处理去除红细胞后，细胞在无血清的PDGC培养基中培养，添加EGF和bFGF。不同的PDGC细胞表现出各自独特的形态特征，且与转录组亚型无关（图2）。长期传代的PDGC细胞可用于基于测序的比较分析、异种移植模型构建、药物筛选以及机制研究。

免疫荧光证实PDGCs表达神经干细胞/前体细胞标志物Nestin和SOX2（图3A）。在超低吸附培养板中，PDGCs形成随时间逐...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

胶质母细胞瘤（GBM）的异质性给治疗带来了重大挑战。传统的GBM细胞系在含血清培养基中长期培养后，往往形成均质的遗传背景，并失去患者肿瘤的特征，从而限制了其转化研究价值。优化GBM的培养条件并标准化患者样本处理流程，对于在研究中最大化利用有限的临床资源至关重要。建立一个全面的GBM细胞模型体系将有助于加深对GBM异质性的理解，并改进治疗策略。

本方案详细介绍了胶质母细胞瘤（GBM）患者样本的处理流程以及原代肿瘤来源胶质细胞（PDGC）的培养方法。肿瘤样本质量对成功建立原代细胞培养至关重要。手术取样和实验室操作过程中必须严格遵守无菌技术，并在术后尽快处理样本以维持细胞活力。在我们的初步研究中，从86例GBM样本中成功建立了28株PDGC细胞系（成功率约为30%）。高级别GBM样本相较于低级别胶质瘤更易获得可长期传代的细胞系，后者即使采用相同方案，成功率也显著较低。标准化的样本分类与保存方法有助于对GBM分子机制开展大规模多组学分析。

通常，RNA 提取需要 10–20 mg 组织，而 DNA 提取则需要约 30 mg 组织。此外...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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本工作由国家重点研发计划（#2022YFA1103900，项目负责人：J.C.）、昌平实验室以及中国医学科学院医学与健康科技创新工程（CIFMS）（#2024-I2M-3-022，项目负责人：J.C.）资助。J.C. 还获得了中国脑科学研究院的额外资助。图1 使用 https://BioRender.com 上的工具绘制。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
70 μm 细胞筛Falcon352350
Accutase 细胞解离液BioLegend423201
氯化铵Aladdin60-92-4
Sox2 抗体MerckmilliporeAB5603
含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂BeyotimeP0131
Nestin 抗体NOVUSNB100-1604
不含维生素的 B27 添加剂Gibco12587010
BD FACSAria Fusion 流式细胞仪BD Biosciences/
细胞培养皿NEST705001
D-荧光素钾盐InvitrogenL2916
DMEM/F12 培养基GibcoC11330500BT
DMSO国药集团30072418
EDTABBI Life SciencesA600107-0500
葡萄糖生工生物A50991-0500
GlutaMAXGibco35050-061谷氨酰胺替代物
苏木精-伊红染色试剂盒SolarbioG1120
HEPESBeyotimeST090
人 bFGFOrigeneTP750002
人 EGFNovoproteinC029-500μg
HypoThermosol FRSBiolife Solutions101104低温保存培养基
异氟烷RWD Life ScienceR510-22-10
IVIS Lumina XR III PerkinElmer/生物发光成像系统
MatrigelCorning356231基底膜基质提取物
微量注射器Hamilton80300
N2 添加剂Gibco17502048
Nunclon Sphera 6 孔板Thermo Scientific174932超低吸附培养板
多聚甲醛生工生物A500684-0500
PBS 缓冲液SolarbioP1010-100*2L
青霉素/链霉素SolarbioP8420/S8290
碳酸氢钾生工生物A501195-0500
RWD 组织解离仪RWD Life ScienceDSC-410
标准立体定位仪RWD Life Science68801
组织样本处理管RWD Life ScienceSCT-100
β-巯基乙醇SigmaM3148-100mL

参考文献

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