保留原始肿瘤特征的患者来源胶质瘤细胞分离与长期培养的优化流程

摘要

本研究提出了一种建立患者来源的胶质瘤细胞系（PDGCs）的标准操作流程，以确保其遗传和表型的稳定性。利用基底膜基质提取物辅助的贴壁培养体系可促进细胞生长并提高均一性，使这些模型在药物筛选和胶质母细胞瘤（GBM）研究中具有重要价值。

摘要

胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性的原发性脑肿瘤，具有高度异质性和对标准治疗的耐药性。传统的胶质瘤细胞系往往无法保留患者特异性的遗传和表型特征，限制了其转化研究的价值。为解决这一问题，我们采用无血清神经干细胞培养体系建立了50株患者来源的胶质瘤细胞系（PDGCs）。本实验方案详细描述了从GBM患者获取肿瘤样本后的收集、处理及长期培养流程，以确保关键分子特征的保留。我们的方法包括酶解组织解离、红细胞裂解以及基底膜基质提取物辅助的贴壁培养，可提高细胞存活率并便于高通量药物筛选。通过对PDGCs进行全基因组测序、转录组测序和免疫荧光染色分析，证实这些细胞系保留了常见的GBM遗传改变以及神经干细胞和前体细胞标志物。此外，这些细胞在异种移植模型中表现出致瘤潜能。通过优化培养条件，本方案为构建具有生物学相关性的GBM模型提供了标准化框架，有助于推动治疗策略的发现和机制研究。

引言

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，起源于发生基因突变的神经干细胞或前体细胞¹。世界卫生组织根据其病理和分子特征将胶质瘤分为1至4级，从低级别到高级别不等²。胶质母细胞瘤（GBM）是一种4级胶质瘤，约占所有胶质瘤的57%，占所有原发性中枢神经系统恶性肿瘤的48%³。GBM患者的预后较差，中位生存时间不足2年，5年生存率仅为5.4%⁴。标准治疗方案包括最大程度的安全切除，随后进行放疗和替莫唑胺化疗⁵。尽管采取了这些治疗手段，但由于GBM具有侵袭性生长特性以及对治疗的固有耐药性，目前仍无法治愈，因此迫切需要开发新的治疗方法。

研究人员通常使用人源肿瘤细胞系作为研究癌症发生和治疗机制的模型。然而，在含血清培养基中长期传代培养的经典胶质瘤细胞系 体外 与患者肿瘤相比，在表型特征和基因谱型方面表现出显著改变^6,7,8因此，基于这些细胞系的临床前筛选模型往往无法识别出能在临床环境中有效转化的治疗靶点和分子。胶质母细胞瘤（GBM）的治疗效果还受到肿瘤异质性....

方案

本方案使用通过医院合作获得的患者来源的胶质瘤组织和血液样本。所有采样程序和实验方案均已获得首都医科大学北京天坛医院伦理委员会的批准（批准号：KY 2020-093-02 和 KY 2014-021-02）。患者在手术前签署知情同意书，所有身份信息在样本转移至实验室前均进行匿名化处理。研究人员在实施本方案前，必须获得所在机构伦理委员会的批准，并取得患者的知情同意。

1. 样品处理前的准备

1. 通过高压灭菌对剪刀、镊子及其他器械进行灭菌。
2. 通过混合以下组分制备PDGC培养基：47.5 mL DMEM/F12、500 µL N2、1 mL B27、500 µL 100x 青霉素/链霉素、250 µL 100x 谷氨酰胺替代物、100 µL 2.5 M HEPES、100 µL 30% 葡萄糖、50 µL 50 mM β-巯基乙醇、1.5 mL 1 µg/mL 表皮生长因子（EGF）和 1.5 mL 1 µg/mL 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
3. 通过将8.29 g氯化铵、1 g碳酸氢钾和37 mg EDTA溶于水中，然后定容至1 L，制备1x红细胞裂解缓冲液（ACK）。
4. 将灭菌器械、PBS缓冲液、废液容器、离心管及其他耗材放入生物安全柜中，并进行30分钟紫外消毒。
5. 将液氮置于保温容器中。

结果

图1 展示了本实验方案的完整工作流程。患者样本包括外周血和肿瘤组织核心部分。血液样本经离心去除血浆后，再经过两轮ACK裂解，以获得外周血单个核细胞（PBMCs），用于后续测序分析的对照。肿瘤样本先用PBS洗涤以去除血凝块和坏死区域，随后被处理成小片段。多份组织碎片被冷冻保存，用于后续的DNA/RNA提取和测序；另一份完整组织则用PFA固定并进行石蜡包埋，用于组织学分析。剩余的肿瘤组织在冰上充分剪碎至均匀状态，然后通过酶消化和机械解离获得单细胞悬液。经ACK处理去除红细胞后，细胞被接种于无血清的PDGC培养基中，并添加EGF和bFGF进行培养。不同PDGC细胞系表现出各自独特的形态特征，且与转录组亚型无关（图2）。长期传代的PDGC细胞可用于基于测序的比较分析、异种移植模型构建、药物筛选以及机制研究。

免疫荧光证实，PDGCs 表达神经干细胞/前体细胞标志物 Nestin 和 SOX2（图 3A）。在超低吸.......

讨论

胶质母细胞瘤（GBM）的异质性给治疗带来了重大挑战。传统的GBM细胞系在含血清培养基中长期培养后，往往形成均质的遗传背景，并失去患者肿瘤的特征，从而限制了其转化研究价值。优化GBM的培养条件并标准化患者样本处理流程，对于在研究中最大化利用有限的临床资源至关重要。建立一个全面的GBM细胞模型体系将有助于加深对GBM异质性的理解，并改进治疗策略。

本方案详细介绍了胶质母细胞瘤（GBM）患者样本的处理流程以及原代肿瘤来源胶质细胞（PDGC）的培养方法。肿瘤样本质量对成功建立原代细胞培养至关重要。手术取样和实验室操作过程中必须严格遵守无菌技术，并在术后尽快处理样本以维持细胞活力。在我们的初步研究中，从86例GBM样本中成功建立了28株PDGC细胞系（成功率约为30%）。高级别GBM样本相较于低级别胶质瘤更易获得可长期传代的细胞系，后者即使采用相同方案，成功率也显著较低。标准化的样本分类与保存方法有助于对GBM分子机制开展大规模多组学分析。

通常，RNA 提取需要 10–20 mg 组织，而 DNA 提取则需要约 30 mg 组织。此外.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70 μm 细胞筛	Falcon	352350
Accutase 细胞解离液	BioLegend	423201
氯化铵	Aladdin	60-92-4
Sox2 抗体	Merckmillipore	AB5603
含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂	Beyotime	P0131
Nestin 抗体	NOVUS	NB100-1604
不含维生素的 B27 添加剂	Gibco	12587010
BD FACSAria Fusion 流式细胞仪	BD Biosciences	/
细胞培养皿	NEST	705001
D-荧光素钾盐	Invitrogen	L2916
DMEM/F12 培养基	Gibco	C11330500BT
DMSO	国药集团	30072418
EDTA	BBI Life Sciences	A600107-0500
葡萄糖	生工生物	A50991-0500
GlutaMAX	Gibco	35050-061	谷氨酰胺替代物
苏木精-伊红染色试剂盒	Solarbio	G1120
HEPES	Beyotime	ST090
人 bFGF	Origene	TP750002
人 EGF	Novoprotein	C029-500μg
HypoThermosol FRS	Biolife Solutions	101104	低温保存培养基
异氟烷	RWD Life Science	R510-22-10
IVIS Lumina XR III	PerkinElmer	/	生物发光成像系统
Matrigel	Corning	356231	基底膜基质提取物
微量注射器	Hamilton	80300
N2 添加剂	Gibco	17502048
Nunclon Sphera 6 孔板	Thermo Scientific	174932	超低吸附培养板
多聚甲醛	生工生物	A500684-0500
PBS 缓冲液	Solarbio	P1010-100*2L
青霉素/链霉素	Solarbio	P8420/S8290
碳酸氢钾	生工生物	A501195-0500
RWD 组织解离仪	RWD Life Science	DSC-410
标准立体定位仪	RWD Life Science	68801
组织样本处理管	RWD Life Science	SCT-100
β-巯基乙醇	Sigma	M3148-100mL