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活体成像表征雄性减数分裂前期着丝粒的运动 拟南芥

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DOI：

10.3791/68569

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2025年10月24日

 ,  ,  , 
1Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Institute Jean-Pierre Bourgin for Plant Sciences (IJPB), 78000, Versailles, France

本文内容

摘要

减数分裂前期染色体的运动是一种尚不完全清楚的现象，但对孢子形成至关重要。本实验方案描述了一种在拟南芥（Arabidopsis thaliana）雄性花粉母细胞中获取、分析和量化着丝粒在减数分裂前期运动的方法。

摘要

减数分裂是一种细胞分裂过程，对有性生殖至关重要。在减数分裂前期，来自母本和父本的同源染色体相互识别并配对，这一过程由染色体在核质中的快速运动所促进。减数分裂前期的染色体运动依赖于染色体与核膜的连接，以及通过核膜传递至染色体的细胞质作用力。在植物中，由于花药内部的雄性减数分裂细胞可及性有限且结构脆弱，使得活体成像与染色体运动分析在技术上具有挑战性。事实上，这些运动速度极快，对其进行分析需要确定最佳的图像采集条件。本文介绍了一种高效的方法，用于捕捉植物雄性减数分裂前期的快速染色体运动 拟南芥 被描述, 通过追踪荧光标记的着丝粒运动，在延时成像电影中观察染色体动态。该方法基于花药解剖及共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的三维、实时成像。每7秒采集一次减数分裂的z轴层扫图像，可获得足够分辨率以重建和分析标记着丝粒的运动轨迹。所获取的数据经后续处理，实现对染色体运动的定量分析。基于这些数据构建模型，对于理解快速染色体运动的机制至关重要，包括驱动该过程的作用力性质与强度。

引言

减数分裂是一种基本的生物学过程，可确保遗传物质从一代忠实传递到下一代。减数分裂过程包括连续进行的两次细胞分裂，即减数分裂I和减数分裂II。减数分裂I之前经历一个漫长的前期，在此期间同源染色体相互识别并配对。在这一延长的前期中，发生多种生物学事件。除了同源染色体的配对外，这些染色体还经历一种称为联会的过程。联会涉及一种称为联会复合体的蛋白质复合物的形成，该复合物沿染色体长度方向连接同源染色体。联会复合体促进同源重组，随后导致同源染色体之间遗传物质的交换以及交叉结构的形成。这些交叉结构在同源染色体之间建立物理连接，有助于它们的正确排列和均衡分离1,2。

在同源染色体识别过程中，快速前期染色体运动（RPMs）被认为发挥着关键作用。在多种模式物种中开展的研究表明，在细线期，染色体会附着于核膜（NE）上，并通过核膜与细胞质中的细胞骨架相连。 通过 LINC（细胞核骨架与细胞骨架连接蛋白）复合物3细胞质中产生的力通过LINC复合体传递至染色体，从而驱动染色体移动。

研究染色体动态运动（RPMs）对于理解减数分裂的基本机制至关重要，特别是同源染色体识别过程中的机制。然而，研究这些运动需要特定的活体成像实验。目前大多数在A. thaliana中进行的活体成像研究集中于体细胞组织和营养器官，这些研究旨在阐明细胞如何发育形成器官4，并在分生组织5和根部6中已有开展。最近，少数研究团队已开发出可在数天时间内实时观察A. thaliana花发育过程（包括减数分裂）的技术7,8。然而，这些实验方案对大量样本的处理可能要求较高，且建立过程复杂困难。

本文介绍了一种对拟南芥（A. thaliana）减数分裂过程中染色体动态进行活细胞成像与分析的详细实验方案。通过共聚焦显微镜结合染色体荧光标记以及简便的样品制备技术，可在短时间内以高空间和时间分辨率捕捉染色体的运动过程。该方案详细说明了用于成像的植物组织制备方法、成像参数的优化以最小化光毒性并最大化图像质量，以及图像处理与数据分析流程。该方法可实现对减数分裂过程中着丝粒动态的精确定量，这对于理解成功配子形成背后的染色体行为至关重要。这一知识在农业领域具有直接应用价值，尤其有助于通过研究影响育性和遗传多样性的染色体配对与重组过程，改进作物育种项目。

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方案

本实验方案使用表达 GFP-CENH3 和 NUP54-RFP 转基因的转基因拟南芥（A. thaliana）植株9,10。CENH3 标记物可用于追踪着丝粒的运动，NUP54 标记物可标记核孔，从而有助于区分细胞核。也可使用其他标记物，但所用标记物必须具有抗光漂白性，因为样品在实验过程中会持续受到光照。为确保标记物不发生光漂白，应在相同的激光条件和图像采集参数下进行实验，并确认信号在图像采集期间保持稳定。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 植物生长与培养

  1. 在温室中将种子直接播种于花盆内。
  2. 将花盆置于温室中，条件设置为：16小时光照/8小时黑暗，20 °C，70%湿度。
  3. 让植株在温室中生长约4周，直至发育至具有5至6个花茎的阶段（见图1A）。

2. 花药解剖与玻片制备

  1. 准备一块载玻片，在其中心放置一个垫片（双面胶，直径为 9 mm 的通孔，深度为 0.12 mm），注意去除每侧的保护膜。该垫片用于承载样品，并在载玻片与盖玻片之间形成空间。
  2. 将 8 µL 自来水滴加至垫片中心。
  3. 使用镊子从主茎之一上夹取一个花序（见图 1B）（不要使用新生茎上的小型花序）。
  4. 将花序置于配有标尺的体视显微镜下的新载玻片上。选择长度约为 0.5 mm 的花蕾（图 1C）。
  5. 使用锋利的细针轻轻打开花蕾，分开萼片和花瓣，仅保留花药。注意不要损伤花药，也不要使其干燥。
  6. 将花药束小心转移至垫片腔内的水中。为避免脱水，应在去除萼片和花瓣后立即进行此操作。
  7. 在垫片腔内放入多个花药束。
  8. 用盖玻片覆盖载玻片，避免产生气泡。为此，先在盖玻片上加入 8 µL 水，然后小心地将带有水滴的盖玻片翻转，使其覆盖在垫片腔上。确保花药束完全浸没在总共 16 µL 的水中，且盖玻片与垫片紧密粘合（见图 1D；图 2）。

3. 共聚焦显微镜延时观察——成像设置

注意：成像参数的设置方式取决于所使用的共聚焦系统。有关成像参数的更多考虑，请参见讨论部分。图像使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和20倍水浸物镜获取。由于生物样品置于水中，使用水浸物镜可实现更佳的折射率匹配。

  1. 通过在 488 nm 激发 GFP，并使用混合探测器在 494 nm 至 547 nm 范围内检测来设置显微镜。
    注意：混合探测器的偏移增益设置为 100。RFP 在 561 nm 激发，并使用混合探测器在 584 nm 至 629 nm 范围内检测。混合探测器的偏移增益设置为 130。扫描速度为 400 Hz，扫描方式为双向。应用 2 次线平均。两个通道同时采集以最小化采集时间。488 nm 激光器的激光功率设置为 15%，561 nm 激光器的激光功率设置为 30%。
  2. 使用明场照明定位花药。
  3. 利用明场通道，根据细胞形态确定减数分裂阶段。
    注意：观察 RPMs 需要处于偶线期或粗线期的细胞。沿 Z 轴调整焦距可估算细胞的三维形态。在细线期，小孢子母细胞呈现明显的方形，核仁位于细胞核中央，易于识别。在偶线期和粗线期，小孢子母细胞开始呈现梯形，核仁向核膜迁移。至双线期，小孢子母细胞呈现完全圆形的形态10。
  4. 在软件中观察花药。RFP 信号也是判断细胞减数分裂阶段的良好指标。
    注意：处于偶线期/粗线期的小孢子母细胞中，NUP54 标记呈新月形，对应于这些时期核膜（NE）特定区域的核孔聚集（图 3A）。如有必要，旋转花药使其呈水平方向（见 图 3）。
  5. 设定图像大小为 400 像素 × 150 像素，数字放大倍数为 4，并将花药置于图像中央。
  6. 定义待成像样品的厚度，以尽可能获取更多的完整小孢子母细胞。然而，为最小化采集时间，需限制 Z 切片的数量。对于 15 µm 的厚度，设置 16 个 Z 切片。Z-堆栈的步长为 1.04 µm。
  7. 为实现连续采集，在时间部分将时间间隔设为零。使用上述显微镜及参数，16 个切片的采集时间约为 6–8 秒。最小采集时长为 2 分钟，但可延长至 20 分钟。
  8. 开始采集。

4. 图像分析——着丝粒运动追踪

注意：重建着丝粒运动需要能够追踪三维运动的图像分析软件。该软件将根据所定义的参数，在每次采集时间点为荧光信号分配一个对象。随后，追踪工具会自动分析移动对象并生成谱系轨迹图。

  1. 图像预处理
    1. 为了便于运动分析，需在图像采集后进行图像处理。例如，可采用自适应信息提取方法（反卷积算法）来揭示精细结构和细节，从而提高图像质量。
  2. 全视野着丝粒追踪
    1. 追踪图像中所有着丝粒：使用 斑点模块自动追踪随时间变化的斑点。 
    2. 选择信号通道，本例中为绿色通道。设定XY方向直径为1 µm，以匹配GFP-CENH3标记的着丝粒。目标检测将识别图像中的所有对象（图3B）。
    3. 根据控制窗口底部的图表，依据信号强度调整检测质量。
    4. 采用自回归运动追踪算法绘制轨迹（图3C）。可视化所有轨迹有助于轻松区分花粉母细胞与体细胞组织（视频1）。
  3. 单个花粉母细胞中的着丝粒追踪
    注意：使用三维可视化软件检查细胞核及轨迹，仅分析在采集过程中完整且未被裁剪的细胞核。对被裁剪的花粉母细胞进行分析将导致错误数据。
    1. 自动着丝粒追踪
      注意：在分析单个细胞核时，需从头重新开始该过程。
      1. 使用斑点模块在选定的细胞核上追踪随时间变化的斑点，通过选择仅分割感兴趣区域选项定义相应的感兴趣区域（ROI），并进行斑点追踪（随时间变化）。 
      2. 选择一个在三维空间及时间序列中均完整包含细胞核的感兴趣区域（图4A）。
      3. 使用与整个花药分析相同的参数进行着丝粒检测（图4B）和追踪（图4C）。
      4. 在谱系图（图4F）中显示所有轨迹。可删除位于分析目标花粉母细胞之外的轨迹（图4C）。选中这些轨迹后，使用键盘上的删除键将其移除。这些轨迹可通过软件的三维查看器轻松识别。
    2. 手动着丝粒追踪校正
      注意：大多数情况下，由于追踪软件无法区分距离过近的着丝粒，因此需要手动校正轨迹。
      1. 使用编辑模式删除或添加对象。确保新对象被添加至正确的焦平面。 
      2. 在三维空间中仔细、全面地分析细胞后，于编辑轨迹模式下使用谱系图手动连接新对象。图4E、G分别展示了校正后的轨迹在花粉母细胞图像和线性图上的呈现。视频2展示了校正后单个花粉母细胞的运动轨迹。
      3. 导出数据
        1. 将追踪数据导出为电子表格程序格式，以便进行后续的数据处理与分析。这些文件包含由软件追踪生成的测量数据表。
        2. 确保导出的电子表格文件包含以下变量：时间（Time），记录每次测量的时间点；轨迹ID（track ID），唯一标识每条轨迹；位移变化量Delta X、Y、Z，表示每个时间点在三个维度上的位置变化；以及位置X、Y、Z，记录每个对象在空间中的绝对坐标。

5. 数据分析

注意：本部分描述了在 RStudio12 中运行 R11 脚本进行数据分析的工作流程。这些脚本可从 Data INRAE 仓储库获取，地址为：10.57745/V1NNFI。所有图表均使用 ggplot213 生成，以可视化计算得到的各项指标。脚本按顺序执行以下步骤：首先运行 meiomove-sub-config.R 脚本，以初始化 R 环境、加载所需库并定义全局变量。该脚本的链接为： https://doi.org/10.57745/V1NNFI

  1. 读取与选择数据
    注意：所使用的脚本存储为：meiomove-sub-loader.R。"
    1. 收集所有包含追踪数据的独立 Excel 文件，并将它们合并为一个整合文件。
    2. 将合并后的文件保存为TSV格式（制表符分隔值），以确保与后续数据处理步骤的兼容性。
    3. 通过随时间累积位移值来计算 x、y、z 坐标位置，以确保准确重建每个被追踪物体的空间轨迹。此步骤用于补偿导出 XYZ 位置不正确的软件缺陷。
  2. 数据清洗
    注意：所使用的脚本存储为：meiomove-sub-clean.R。"
    1. 移除短轨迹，即持续时间少于50 s的轨迹。这些轨迹包含的数据点不足以进行有意义的分析，可能引入噪声或导致不准确结果。
    2. 识别并删除位置（X, Y, Z）随时间保持不变的轨迹，因为这些轨迹可能代表伪影或与分析无关的静态结构。
    3. 过滤掉缺失的位移值（NA 项），以确保数据完整性，并避免后续步骤中出现计算错误。
    4. 检测并删除图像分析软件获得的位移值与重新计算值存在显著差异的轨迹，以确保追踪数据的一致性和可靠性。
  3. 纠正减数分裂细胞漂移
    注意：所使用的脚本也保存为：meiomove-sub-clean.R。"
    1. 通过区分减数分裂和体细胞的着丝粒来校正采集过程中可能发生的漂移。此步骤可确保所观察到的运动反映的是生物学过程，而非实验假象。
    2. 通过调整减数分裂细胞相对于体细胞的位置来应用漂移校正，其中体细胞作为稳定的参考。
  4. 输出生成
    注意：所使用的脚本存储为：meiomove-sub-metrics.R。"
    1. 计算每个时间步的瞬时速度，以追踪运动速度随时间的变化情况。
    2. 计算转向角，该参数表示连续时间步长之间运动方向的变化，可揭示轨迹的运动模式。结果将保存为：results/dataframes/metrics-by-step.tsv（输出 1）。
    3. 使用 celltrackR 计算迁移扩展比率14，用于量化追踪对象相对于其起始位置的移动距离，以反映其探索行为。结果保存为：results/dataframes/metrics-celltrackr.tsv（输出 2）。
    4. 计算每条独立轨迹的平均速度，以总结整个观察期内的运动特征。计算每条轨迹的平均转向角，以分析整体运动方向性和行为模式。结果保存为：results/dataframes/metrics-by-id.tsv（输出3）。
    5. 在每个时间步长中确定每条细胞轨迹的质心位置。质心是一个给定花粉母细胞中着丝粒位置的平均值。
    6. 计算每个时间步的质心大小，该值用于衡量着丝粒围绕其平均位置的空间离散程度。质心大小随时间的变化反映了着丝粒轨迹在整体上的一致性。结果存储于：results/dataframes/metrics-by-cell.tsv（输出4）。
    7. 计算速度互相关性以分析不同追踪对象运动动态之间的关系，揭示潜在的协调行为。结果存储为：results/dataframes/metrics-correlations.tsv（输出 5）。
    8. 计算每条轨迹的均方位移（MSD），这是一个关键指标，用于量化着丝粒在给定时间间隔（时间滞后）内移动的平均平方距离  以表征运动类型。
      注意：通过分析均方位移（MSD）随时间延迟增加的变化趋势，可以推断运动主要是扩散性的还是受限的，从而揭示其潜在的动力学行为。结果保存为：results/dataframes/metrics-msd.tsv（输出 6）。

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结果

已建立一种快速方案，用于观察拟南芥（Arabidopsis thaliana）减数分裂前期染色体的动态运动，该方法可实现多次时间序列成像，从而支持大规模数据集的分析。根据所述方案，对表达GFP标记（用于可视化着丝粒）和RFP标记（用于可视化细胞核）的花粉母细胞进行持续4分钟的成像观察。

本方案中所使用的采集参数已优化，以实现着丝粒足够的空间和时间分辨率，从而能够准确追踪其运动。这些参数还经过优化以最小化光漂白，确保在整个采集过程中信号强度稳定。对一个处于偶线期/粗线期花药中的三个小孢子母细胞的分析，实现了对22个着丝粒运动的追踪。该数目低于细胞预期的着丝粒总数（3 × 10个着丝粒），原因在于着丝粒在偶线期会与其同源物配对，且部分着丝粒可能短暂聚集，导致无法区分。本研究中仅分析了有限的数据集，以聚焦于方法学方面的内容；然而，其他数据已在别处进行详细分析10。

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讨论

本方案可实现 体内 减数分裂前期着丝粒运动的成像与分析 拟南芥本方案可使用直立或倒置共聚焦显微镜实施，因此大多数配备共聚焦技术的实验室均可开展。尽管共聚焦系统在扫描速度、灵敏度、探测器以及波长分离能力方面存在差异，但均可通过调整采集参数以获得具有良好时间分辨率和空间分辨率的图像。荧光蛋白的选择也可根据需要进行调整10，但这些标记物必须能够耐受强烈且持续的激光照射。用于追踪染色体（在此情况下为着丝粒）的标记物必须具有更强的抗光漂白能力。然而，也可使用针对基因组其他区域的特异性荧光标记物，例如端粒、特定基因座或核仁组织区（NOR），如在小鼠中所示，可追踪对应于着丝粒周围区域的端粒15另一个标记也可替换为例如联会标记（ZYP1蛋白），从而实现对前期的精确分期。或者，如同在芽殖酵母中所进行的实验，可使用不同颜色的标记来追踪同源位点的移动16.

本文分析的数据基于4分钟的采集时长。然而，该技术也可用于更长时间的采集...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得益于让-皮埃尔·布尔金研究所植物观测站技术平台PO-Plants和PO-Cyto的支持。本研究由法国国家研究局（ANR）资助（MeioMove项目 ANR-21CE12-0042：M.G.、P.A.、L.C.、S.L.，以及DYSCORD项目 ANR-23-CE20-0036-02，M.G.、L.C.）。让-皮埃尔·布尔金研究所还获得了萨克雷植物科学（Saclay Plant Sciences）的支持（ANR-17-EUR0007）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
繁殖基质TREF (Jiffy)101820/02227861
共聚焦显微镜LeicaTCS SP8 AOBS (声光分束器)
共聚焦软件LeicaLAS X 3.5.0.18371 软件
盖玻片Paul Marienfeld GmbH10705222x22 No1,5H
镊子Ideal-Tek4.SA.0高精度镊子
GFP:CENH3Ravi et al. 2010本实验所用拟南芥种子
ggplot2 ggplot2：用于数据分析的优雅图形  参考文献13https://ggplot2.tidyverse.org
针具手柄Hammacher环形针手柄，长度 170 mm
ImarisOxford instrumentsImaris 9.7.2图像分析 - "Spot" 模块
物镜LeicaHC PL APO CS2 20×/0.75 IMM
LightningLeica自适应去卷积从共聚焦数据中自动智能提取信息
光源VEGELEDApollo LL252-Gen2
针Watkins&DoncasterE3 针 .0124"(0.31mm) x 25mm
NUP54:RFPCromer et al. 2024本实验所用拟南芥种子
花盆TEKU (POPPELMANN)VDF 7x7x6.5 cm
RR Core 团队R：用于统计计算的语言和环境。R 统计计算基金会，奥地利维也纳。   参考文献 参考文献11https://www.R-project.org/  
RstudioPosit 团队 RStudio：R 的集成开发环境。Posit Software, PBC, 波士顿, 马萨诸塞州。参考文献12http://www.posit.co/
载玻片KNITTEL GLASS10000326x76x1.0mm
间隔垫片Thermo-fisherSecure-Seal 间隔垫片，8 孔，直径 9 mm，深度 0.12 mm将每个垫片单独切割
体视显微镜NikonSMZ800

参考文献

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