减数分裂前期染色体的运动是一种尚不完全清楚的现象，但对孢子形成至关重要。本实验方案描述了一种在拟南芥（Arabidopsis thaliana）雄性花粉母细胞中获取、分析和量化着丝粒在减数分裂前期运动的方法。
减数分裂前期染色体的运动是一种尚不完全清楚的现象，但对孢子形成至关重要。本实验方案描述了一种在拟南芥（Arabidopsis thaliana）雄性花粉母细胞中获取、分析和量化着丝粒在减数分裂前期运动的方法。
减数分裂是一种细胞分裂过程，对有性生殖至关重要。在减数分裂前期，来自母本和父本的同源染色体相互识别并配对，这一过程由染色体在核质中的快速运动所促进。减数分裂前期的染色体运动依赖于染色体与核膜的连接，以及通过核膜传递至染色体的细胞质作用力。在植物中，由于花药内部的雄性减数分裂细胞可及性有限且结构脆弱，使得活体成像与染色体运动分析在技术上具有挑战性。事实上，这些运动速度极快，对其进行分析需要确定最佳的图像采集条件。本文介绍了一种高效的方法，用于捕捉植物雄性减数分裂前期的快速染色体运动 拟南芥 被描述, 通过追踪荧光标记的着丝粒运动，在延时成像电影中观察染色体动态。该方法基于花药解剖及共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的三维、实时成像。每7秒采集一次减数分裂的z轴层扫图像，可获得足够分辨率以重建和分析标记着丝粒的运动轨迹。所获取的数据经后续处理，实现对染色体运动的定量分析。基于这些数据构建模型，对于理解快速染色体运动的机制至关重要，包括驱动该过程的作用力性质与强度。
减数分裂是一种基本的生物学过程，可确保遗传物质从一代忠实传递到下一代。减数分裂过程包括连续进行的两次细胞分裂，即减数分裂I和减数分裂II。减数分裂I之前经历一个漫长的前期，在此期间同源染色体相互识别并配对。在这一延长的前期中，发生多种生物学事件。除了同源染色体的配对外，这些染色体还经历一种称为联会的过程。联会涉及一种称为联会复合体的蛋白质复合物的形成，该复合物沿染色体长度方向连接同源染色体。联会复合体促进同源重组，随后导致同源染色体之间遗传物质的交换以及交叉结构的形成。这些交叉结构在同源染色体之间建立物理连接，有助于它们的正确排列和均衡分离1,2。
在同源染色体识别过程中，快速前期染色体运动（RPMs）被认为发挥着关键作用。在多种模式物种中开展的研究表明，在细线期，染色体会附着于核膜（NE）上，并通过核膜与细胞质中的细胞骨架相连。 通过 LINC（细胞核骨架与细胞骨架连接蛋白）复合物3细胞质中产生的力通过LINC复合体传递至染色体，从而驱动染色体移动。
研究染色体动态运动（RPMs）对于理解减数分裂的基本机制至关重要，特别是同源染色体识别过程中的机制。然而，研究这些运动需要特定的活体成像实验。目前大多数在A. thaliana
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本实验方案使用表达 GFP-CENH3 和 NUP54-RFP 转基因的转基因拟南芥（A. thaliana）植株9,10。CENH3 标记物可用于追踪着丝粒的运动，NUP54 标记物可标记核孔，从而有助于区分细胞核。也可使用其他标记物，但所用标记物必须具有抗光漂白性，因为样品在实验过程中会持续受到光照。为确保标记物不发生光漂白，应在相同的激光条件和图像采集参数下进行实验，并确认信号在图像采集期间保持稳定。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 植物生长与培养
2. 花药解剖与玻片制备
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已建立一种快速方案，用于观察拟南芥（Arabidopsis thaliana）减数分裂前期染色体的动态运动，该方法可实现多次时间序列成像，从而支持大规模数据集的分析。根据所述方案，对表达GFP标记（用于可视化着丝粒）和RFP标记（用于可视化细胞核）的花粉母细胞进行持续4分钟的成像观察。
本方案中所使用的采集参数已优化，以实现着丝粒足够的空间和时间分辨率，从而能够准确追踪其运动。这些参数还经过优化以最小化光漂白，确保在整个采集过程中信号强度稳定。对一个处于偶线期/粗线期花药中的三个小孢子母细胞的分析，实现了对22个着丝粒运动的追踪。该数目低于细胞预期的着丝粒总数（3 × 10个着丝粒），原因在于着丝粒在偶线期会与其同源物配对，且部分着丝粒可能短暂聚集，导致无法区分。本研究中仅分析了有限的数据集，以聚焦于方法学方面的内容；然而，其他数据已在别处进行详细分析10。
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本方案可实现 体内 减数分裂前期着丝粒运动的成像与分析 拟南芥本方案可使用直立或倒置共聚焦显微镜实施，因此大多数配备共聚焦技术的实验室均可开展。尽管共聚焦系统在扫描速度、灵敏度、探测器以及波长分离能力方面存在差异，但均可通过调整采集参数以获得具有良好时间分辨率和空间分辨率的图像。荧光蛋白的选择也可根据需要进行调整10，但这些标记物必须能够耐受强烈且持续的激光照射。用于追踪染色体（在此情况下为着丝粒）的标记物必须具有更强的抗光漂白能力。然而，也可使用针对基因组其他区域的特异性荧光标记物，例如端粒、特定基因座或核仁组织区（NOR），如在小鼠中所示，可追踪对应于着丝粒周围区域的端粒15另一个标记也可替换为例如联会标记（ZYP1蛋白），从而实现对前期的精确分期。或者，如同在芽殖酵母中所进行的实验，可使用不同颜色的标记来追踪同源位点的移动16.
本文分析的数据基于4分钟的采集时长。然而，该技术也可用于更长时间的采集.......
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作者声明无利益冲突。
本工作得益于让-皮埃尔·布尔金研究所植物观测站技术平台PO-Plants和PO-Cyto的支持。本研究由法国国家研究局（ANR）资助（MeioMove项目 ANR-21CE12-0042：M.G.、P.A.、L.C.、S.L.，以及DYSCORD项目 ANR-23-CE20-0036-02，M.G.、L.C.）。让-皮埃尔·布尔金研究所还获得了萨克雷植物科学（Saclay Plant Sciences）的支持（ANR-17-EUR0007）。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 繁殖基质 | TREF (Jiffy) | 101820/02227861 | |
| 共聚焦显微镜 | Leica | TCS SP8 AOBS (声光分束器) | |
| 共聚焦软件 | Leica | LAS X 3.5.0.18371 软件 | |
| 盖玻片 | Paul Marienfeld GmbH | 107052 | 22x22 No1,5H |
| 镊子 | Ideal-Tek | 4.SA.0 | 高精度镊子 |
| GFP:CENH3 | Ravi et al. 2010 | 本实验所用拟南芥种子 | |
| ggplot2 | ggplot2：用于数据分析的优雅图形 参考文献13 | https://ggplot2.tidyverse.org | |
| 针具手柄 | Hammacher | 环形针手柄，长度 170 mm | |
| Imaris | Oxford instruments | Imaris 9.7.2 | 图像分析 - "Spot" 模块 |
| 物镜 | Leica | HC PL APO CS2 20×/0.75 IMM | |
| Lightning | Leica | 自适应去卷积 | 从共聚焦数据中自动智能提取信息 |
| 光源 | VEGELED | Apollo LL252-Gen2 | |
| 针 | Watkins&Doncaster | E3 针 .0124"(0.31mm) x 25mm | |
| NUP54:RFP | Cromer et al. 2024 | 本实验所用拟南芥种子 | |
| 花盆 | TEKU (POPPELMANN) | VDF 7x7x6.5 cm | |
| R | R Core 团队 | R：用于统计计算的语言和环境。R 统计计算基金会，奥地利维也纳。 参考文献 参考文献11 | https://www.R-project.org/ |
| Rstudio | Posit 团队 | RStudio：R 的集成开发环境。Posit Software, PBC, 波士顿, 马萨诸塞州。参考文献12 | http://www.posit.co/ |
| 载玻片 | KNITTEL GLASS | 100003 | 26x76x1.0mm |
| 间隔垫片 | Thermo-fisher | Secure-Seal 间隔垫片，8 孔，直径 9 mm，深度 0.12 mm | 将每个垫片单独切割 |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ800 |
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