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生物样品中维生素A的13C富集分析：气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法

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DOI：

10.3791/68571

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2025年11月14日

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1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison

本文内容

摘要

本文描述了用于示踪研究的血清、母乳和肝脏样品中视黄醇及视黄酯的13C富集度分析方法。采用高效液相色谱法纯化并定量视黄醇浓度，采用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法（GC-C-IRMS）分析纯化后的提取物。

摘要

维生素A对健康至关重要，但评估维生素A的营养状况具有挑战性。血液中循环的维生素A受到稳态调控，通常不能反映维生素A缺乏或过量的情况。13C标记的维生素A可用于追踪并定量全身维生素A储存量，并提供有关药代动力学和代谢的额外信息。本方案描述了使用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法（GC-C-IRMS）从血清、母乳和组织样本中提取、纯化并测定 13C-维生素A同位素富集度的方法。采用GC-C-IRMS分析可提供高灵敏度和高精确度的富集值，尤其适用于13C富集度接近天然丰度水平的样品。这使得研究设计更加灵活，可使用较小剂量的示踪剂并进行长期药代动力学采样。简而言之，在0.4至1 mL血清中加入乙醇以沉淀蛋白质，加入C-23 β-apo-胡萝卜醇作为内标物，再用正己烷提取类视黄醇。提取物随后用甲醇重悬，并通过高效液相色谱（HPLC）进行纯化。将类视黄醇组分再次用正己烷重悬后注入GC-C-IRMS系统。原子百分比（At%）以二氧化碳为参照直接计算，并通过元素分析仪使用蔗糖标准品进行校准。其他已通过GC-C-IRMS分析的组织类型包括经皂化处理后的母乳和肝脏。固相萃取技术可用于辅助这些或其他复杂基质的纯化。此外，可将元素分析仪连接至IRMS，用于分析食品样品中的总13C含量。

引言

维生素A（VA）是一种必需微量营养素，对视觉、免疫功能、细胞分化和代谢调节至关重要。由于维生素A缺乏或过量均会损害健康，因此优化其营养状况仍是全球公共卫生面临的一大挑战。准确评估维生素A的营养状态对于指导临床或人群干预措施的研究至关重要。然而，仅依靠血清视黄醇浓度作为生物标志物和诊断工具并不可靠，因为该指标在机体总储存量（TBS）较宽范围内受到稳态调控，且易受炎症及其他营养素缺乏的影响1,2。

同位素标记示踪剂通过视黄醇同位素稀释（RID）试验，极大地推动了维生素A（VA）研究的发展，使得能够对总体维生素A储量（TBSs）进行定量评估3,4,5。在RID方法中，给予富集13C或2H的维生素A示踪剂，待其在体内储存池中达到平衡后，采用质谱法（MS）测定血清（或血浆）中示踪剂与天然视黄醇（tracee）的比值（TTR）。结合有关维生素A代谢的特定假设，应用同位素稀释方程即可计算出TBSs5,6。

多种色谱与质谱联用技术可用于测定血清视黄醇的TTR（例如，GC-MS、LC-MS、LC-MS/MS）。分析精度对于准确估算RID至关重要，因为总身体储量（TBS）与TTR成反比。当使用高度标记的示踪剂和相对较高剂量的示踪剂时，LC-MS/MS非常适合高通量应用。典型的LC-MS/MS方法报告的视黄醇批内相对标准偏差（RSD）为3-6%，批间相对标准偏差<8%7，但关于TTR准确性和精密度的数据仍有限。相比之下，气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法（GCC-IRMS）在13C-视黄醇富集度测定方面具有极高的精度，典型的13C/12C同位素丰度RSD约为0.02-0.058,9。这使得在富集度较低的样品中也能精确测定示踪剂浓度。在RID应用中使用IRMS技术，可在使用更少示踪剂质量和更少标记原子的情况下获得足够的分析信号，从而降低示踪剂剂量相关的成本。

本论文概述了一种利用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法（GC-C-IRMS）分析血液、母乳和组织中13C-视黄醇的方法。根据所检测的生物样本类型，使用GC-C-IRMS分析13C标记的视黄醇时，首先需采用若干潜在提取方法之一，以分离包含标记视黄醇在内的非极性化合物。对于血清样本，采用液-液萃取法，加入乙醇和正己烷后收集正己烷相。若检测母乳样本，则先用氢氧化钾进行皂化处理，随后进行与血清样本类似的液-液萃取。此外，这些母乳样本还需使用固相萃取小柱进行纯化，以减少残留的其他脂质含量。若从组织（例如肝脏）中提取，则需将样本与无水硫酸钠研磨以去除水分，再用二氯甲烷提取，并过滤至容量瓶或圆底烧瓶中进行旋转蒸发。取部分提取物干燥后重悬于乙醇中，进行皂化处理，并采用与母乳样本相同的方法进行提取。上述各类样本所得的非极性溶液均在氮气下干燥，然后重新溶解于甲醇中，用于高效液相色谱法（HPLC）的纯化与定量分析。

IRMS 的灵敏度能够测定样本富集度较低的样品中的富集情况，例如用于长期数学建模研究的药代动力学样品，或用于精确追踪维生素A（VA）代谢的肝外组织样品。已有研究提出采用单剂量、配对的同位素稀释（RID）检测方法，在干预前后评估理论受试者的 VA 营养状况以判断干预效果10，若该方法在人体中得到验证，可能成为一种有前景的手段。IRMS 能够检测接近天然富集水平的 VA 示踪剂，从而允许较长的随访周期，并在采样方案上提供更大的灵活性。

母乳已被证明是评估维生素A（VA）营养状况的一种侵入性较小的替代采样方法1。母乳中的视黄醇可作为RID试验的采样来源，并在赞比亚VA储存水平较低的女性中显示出与血清来源的RID值高度相关11。对于组织和母乳样本，固相萃取技术可用于在复杂基质中对这些样本进行纯化。同位素比值质谱法（IRMS）也可用于区分VA的食物来源，并通过血清视黄醇中天然13C丰度的变化来确定膳食相对贡献9,12,13。元素分析仪也可与IRMS联用，用于分析食物样本的总13C含量，并将其与VA的富集程度进行比较。

使用13C标记时，必须了解基线13C视黄醇富集水平，因为自然界中存在13C（约占总碳的1.1%），且个体及人群所摄入维生素A来源不同，其含量可能有所差异。因此，为获得个体水平的最佳准确性，建议采集基线血液样本。对于人群评估，可利用同一人群组中随机选取的亚组或独立个体生成基于人群的估计值14。

方案

1. 从生物样品中提取视黄醇

注意：所有样品处理和提取步骤均在黄光或紫外光过滤光源下进行，以尽量减少降解。

  1. 血清提取
    1. 用移液器将1 mL血清（或尽可能多的量）转移至13 x 100 mm（或类似尺寸）玻璃试管中。记录所用血清体积。
      ​注意：建议使用正向置换移液器。
    2. 加入1.5倍体积的200度乙醇。
    3. 加入25 µL内标物，例如C-23 β-apo-类胡萝卜醇（由全-trans 视黄醛合成，abs = 0.9）9。盖紧样品管，涡旋混合15秒。
    4. 加入1 mL己烷，涡旋混合15秒，室温下离心2分钟（约1,300 × g）。
    5. 使用巴斯德移液管，小心吸取上层己烷相，转移至新的玻璃试管（12 x 75 mm或13 x 100 mm）中。
    6. 重复步骤1.1.4和1.1.5两次，将三次己烷提取液汇集至第二支试管中。将合并的己烷提取液置于温和的氮气流下吹干。
    7. 向干燥样品中加入100 µL甲醇，并立即盖紧管盖。轻轻摇动使溶液沿管壁上下流动，然后涡旋混合15秒。
    8. 将样品置于-80 °C冰箱中至少5分钟。
      ​注意：此步骤后样品可在-80 °C长期保存，直至次日使用。
  2. 母乳样品提取
    1. 完全解冻乳汁样品，轻柔颠倒混匀数次以确保样品均匀。取0.5–1.5 mL（常规为1.0 mL）乳汁样品，加入10 mL玻璃螺口离心管中，记录所用体积。
    2. 加入1.5倍体积的200度乙醇（含0.1%丁基化羟基甲苯，w:v），涡旋混合15秒。
    3. 加入25 µL内标物，例如C-23 β-apo-类胡萝卜醇（由全-trans 视黄醛合成，abs = 0.9）15。盖紧样品管，涡旋混合。
    4. 加入与起始乳汁体积相等的50:50氢氧化钾水溶液（按w:v配制，例如50 g KOH溶于50 mL水中），涡旋混合15秒。
      ​注意：KOH:水溶液应使用塑料容器（如HDPE）配制。
    5. 将样品在45 °C水浴中皂化1小时，每15分钟短暂涡旋混匀一次。
    6. 加入与起始乳汁体积相等的冷去离子水或反渗透水。
    7. 加入1 mL己烷，涡旋混合15秒，室温下离心2分钟（约1,300 × g）。
    8. 使用巴斯德移液管，小心吸取上层己烷相转移至新的玻璃试管（12 x 75 mm或13 x 100 mm）中。
    9. 重复步骤1.2.7和1.2.8两次，将己烷提取液汇集至第二支试管中。
    10. 对每个样品进行固相萃取（SPE）；首先将所需SPE小柱（PE 500 mg/3 mL，-NH2型）连接至真空 manifold 上。
    11. 用3 × 2 mL己烷依次通过每根SPE小柱进行活化，注意始终保持溶剂液面高于填料顶部。将己烷收集至16 x 75 mm玻璃管中，并妥善处理废液。
    12. 将样品加载至SPE小柱中，开启真空抽吸至溶剂液面略高于填料顶部。然后以与步骤1.2.11相同的方式，用3 × 2 mL己烷冲洗每根小柱。弃去废液，更换为已标记样品编号的新玻璃收集管。
    13. 用3 × 2 mL二氯甲烷洗脱视黄醇组分，并收集该洗脱液。
    14. 在氮气流下将洗脱液吹干，用100 µL甲醇（质谱级）复溶。涡旋混合样品，并使溶剂充分润洗管壁各处。离心20–30秒。
    15. 将样品置于-80 °C冰箱中至少5分钟。
      ​注意：此步骤后样品可在-80 °C长期保存，直至次日使用。
  3. 肝脏样品提取
    1. 取直径8 cm的玻璃漏斗，将一张15 cm Whatman #1滤纸折叠成圆锥形并放入漏斗中。在漏斗下方放置一个50 mL容量瓶。
    2. 解冻组织，称取0.5 g（或尽可能多的量），记录所用组织重量。
    3. 将样品转移至研钵中，加入约5 g无水硫酸钠进行研磨。
    4. 加入250 µL内标物，例如C-2315。
      ​注意：不应使用维生素A的酯化形式（如视黄醇乙酸酯、视黄醇丁酸酯），因为样品后续将进行皂化处理，会导致内标物与内源性视黄醇无法区分。
    5. 在通风橱中，向研钵中的研磨后肝组织样品加入10–15 mL二氯甲烷，用研杵轻轻混合。
    6. 将二氯甲烷溶液经滤纸过滤至容量瓶中。
    7. 重复步骤1.3.5和1.3.6两次，确保容量瓶中总体积低于刻度线。
    8. 使用巴斯德移液管，以二氯甲烷冲洗研钵中残留物进入漏斗。继续用巴斯德移液管向漏斗中添加二氯甲烷，直至容量瓶中溶液体积达到刻度线。盖紧容量瓶，用手固定瓶塞后反复倒置数次以混匀。
    9. 取约10 mL二氯甲烷提取液转移至25 mL锥形瓶中。从中转移5 mL溶液至10 mL带螺口盖的玻璃离心管中，在温和氮气流下吹干样品。
    10. 用2 mL乙醇（含0.1%丁基化羟基甲苯）复溶样品，涡旋混匀。
    11. 加入0.8 mL 50:50（w:v）氢氧化钾水溶液，涡旋混合15秒。
    12. 将样品在45 °C水浴中皂化1小时，每15分钟短暂涡旋混匀一次。
    13. 加入0.1 mL冷去离子水或反渗透水。
    14. 加入1 mL己烷，涡旋混合15秒，离心2分钟（约1,300 × g）。
    15. 使用巴斯德移液管，小心吸取上层己烷相转移至新的玻璃试管（12 x 75 mm或13 x 100 mm）中。
    16. 重复步骤1.3.14和1.3.15两次，将己烷提取液汇集至第二支试管中。
    17. 将合并的己烷提取液在氮气流下吹干，用100 µL甲醇（质谱级）复溶。涡旋混匀样品，并使溶剂充分润洗管壁各处。离心20–30秒，将样品置于-80 °C冰箱中至少5分钟。
      注意：此步骤后样品可在-80 °C长期保存，直至次日使用。

2. 使用高效液相色谱法进行样品纯化和定量

  1. 使用C18色谱柱（5 µm，4.6 x 250 mm）并设置UV-Vis检测器至325 nm，准备高效液相色谱系统1。
  2. 通过分别量取乙腈和水的体积，将水倒入乙腈中，配制92:8的乙腈-水流动相。对混合溶液进行真空过滤以去除溶解的气体。
  3. 开启高效液相色谱系统1，如有需要，执行溶剂冲洗程序，然后将流速设定为1 mL/min，持续至少15分钟，以充分平衡系统。
  4. 将标准品注入高效液相色谱系统。
    1. 为定量视黄醇浓度，注入25 µL的C-23内标溶液，并重复记录3次，以便与样品比较。
    2. 注入视黄醇标准品，以确定所用系统的准确保留时间，用于指导馏分收集和视黄醇定量。
  5. 准备高效液相色谱系统2（组件与系统1相同）。若使用同一台高效液相色谱系统完成两个步骤，则需将初次纯化所用色谱柱更换为另一根相同的色谱柱，以尽量减少样品中化合物的潜在残留。
  6. 对系统2，将甲醇进行真空过滤，冲洗高效液相色谱流动相，然后以0.7 mL/min流速运行20分钟以平衡系统。
  7. 从-80 °C冰箱中逐个取出样品，在室温下以1,300 × g离心30秒。
  8. 将全部样品注入高效液相色谱系统，避免注入任何沉淀物质。若需定量视黄醇，则开始记录信号。
  9. 当溶剂通过检测器时，将视黄醇峰收集至小玻璃管（12 x 75 mm或13 x 100 mm）中。为最大化纯度，仅收集峰的中部区域，通常为吸光度值大于0.1吸光单位的部分（图1），具体范围可根据样品中视黄醇浓度进行调整。等待C-23峰洗脱完毕后停止记录。
  10. 在温和的氮气流下将样品干燥。
  11. 向干燥后的样品中加入100 µL甲醇（质谱级），立即加盖。轻轻旋转试管使溶液沿管壁上下混合，然后涡旋振荡15秒。将样品置于-80 °C冰箱中至少5分钟。
    注：此步骤的样品可在-80 °C条件下保存至次日。
  12. 从-80 °C冰箱中逐个取出样品，以1,300 × g离心30秒。
  13. 将全部样品注入高效液相色谱系统2，避免注入任何沉淀物质。
  14. 当视黄醇峰洗脱时，将通过检测器的溶剂收集至带锥形底的小玻璃小瓶（<1 mL）中，并将样品小瓶轻轻滑入12 x 75 mm试管内。
  15. 开启真空浓缩仪，使冷凝器冷却20分钟。
  16. 将样品对称放置于转盘中，将加热设置为“无”，真空设置为05.1，关闭盖子后按下运行。
    注：样品通常需要10–20分钟才能完全干燥。为确保气相色谱分析的准确性，必须完全去除样品中的甲醇。
  17. 干燥后，将高效液相色谱小瓶转移至带螺旋盖的4 mL棕色小瓶中，用4–7 µL正己烷重新溶解样品。
    ​注：通常使用7 µL，但在纯化过程中若确定样品浓度较低，则应减少体积。肝脏样品浓度可能更高，因此应使用较大体积重新溶解。目标浓度应控制在75 ng/µL至400 ng/µL之间。
  18. 根据样品浓度，向GC-C-IRMS中注入1–5 µL样品，以获得足够信号，确保注入的视黄醇量约为75 ng。

3. 使用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法进行样品分析

  1. 使用色谱柱（100% 二甲基聚硅氧烷，非极性，15 m，0.25 mm 内径，0.25 µm 膜厚）准备气相色谱仪（GC），并设置氦气流速为 1.2 mL/min。
  2. 执行系统检查，确保无泄漏，且同位素比质谱仪（IRMS）离子源正确聚焦于质量数 44、45 和 46。
    每天首次进样前注入 2 µL 浓度为 75 ng/µL 的 13C 富集视黄醇标准品，以确定保留时间并验证系统性能。
  3. 在采集软件中加载仪器方法，输入样品的名称，然后点击运行样品。GC-C-IRMS 系统将自动执行进样前的系统设置程序。当气相色谱仪前面板上的绿色准备进样指示灯亮起时，将预定体积的样品注入程序升温汽化（PTV）进样口，取出进样针后按下开始按钮。
  4. 将 PTV 进样口设置为PTV 无分流模式，并将保护柱置于进样口衬管顶部，以模拟柱上进样。设定进样程序起始温度为 50 °C，保持 1.05 分钟，以 14.5 °C/s 的速率升至 200 °C，保持 1 分钟，再以 14.5 °C/s 升至 300 °C，随后在 50 mL/min 氦气分流流速下保持 4 分钟以清洗进样口，最后降温至 50 °C，准备下一次进样。
  5. 设定 GC 柱温箱程序：初始温度 50 °C，保持 1 分钟，以 30 °C/min 升至 150 °C，再以 15 °C/min 升至 265 °C，然后以 40 °C/min 升至 295 °C，保持 2.50 分钟后降温至 50 °C，准备下一次进样。
  6. 确保每个色谱图开始时包含三脉冲高纯度 CO2（纯度 99.999%），并以蔗糖标准物质（IAEA-CH-6）进行校准。在采集软件中查看分析结果。
  7. 每次进样后，检查每个色谱图，确认视黄醇峰存在且积分正确。尽可能使用软件自动积分视黄醇峰，以减少手动积分可能引入的偏差。采用标准的起始和终止斜率检测设置（20 mV/s）。
    注意：若峰幅低于或等于 200 mV，则过小，无法提供准确的 13C 比值测定结果。
  8. 将色谱图数据导出至电子表格程序。应包含以下关键数据类别：样品名称、峰保留时间、质量数 45 处的峰幅值以及 AT%。
    注意：导出的数据可通过预设的导出方法进行定义。δ 值有助于结果解读，但在计算中并非必需。

4. 维生素A总储存量及肝脏浓度的计算

  1. 视黄醇同位素稀释方程
    注意：一些研究者所采用的优选同位素平衡方程及相应符号表示法，是基于国际纯粹与应用化学联合会的建议。16我们注意到，一些研究团队采用的符号系统试图保留历史上在RID方程中使用的因子。我们还注意到，这些因子及其支持性文献可能因研究设计、实验模型和分析结果的不同，而在更直接适用于TBS计算或肝脏VA浓度计算方面存在差异。
    1. 使用同位素丰度测定血清视黄醇结合蛋白中的视黄醇 13CO的C2 根据以下方程式燃烧后：
       TTR formula, static equilibrium equation, mathematical representation, physics calculation.    
      其中，F 为同位素丰度（也称为同位素物质的量分数，简称x示踪剂量（F）的）a），基线时的血清视黄醇（Fb），以及给药后与体内储存池混合后的血清视黄醇（Fc混合期通常为14至21天，适用于人类研究，但具体时长可能根据研究设计的不同而缩短或延长。
    2. 使用RID方程根据以下基础方程计算VA TBS。
      Vitamin A TBS calculation formula, static equilibrium, absorption factors, chemical equation.
      何处
      TTR formula, static equilibrium equation, mathematical representation, physics calculation.
      注意：用于吸收和储存的因素包括 i) 剂量储存 平衡时的吸收剂量（剂量吸收）在健康个体中通常估计为75%至90%。若存在炎症，该估计值可能降低。ii) 剂量滞留；常数：e-ktk = ln(2)/视黄醇半衰期；儿童为32至136天；成人140天）；t = 给药后天数（通常为14–21天）； 血清/肝脏示踪剂分布TTR血清 / TTR肝脏；混合期摄入维生素A时为0.65–0.9；若使用低示踪剂剂量、控制维生素A摄入并采用空腹采样，则为0.9–1.0。
      Pharmacokinetics formula, VATBS= dose × absorption × retention × TTR ratio, equation diagram.
    3. 根据肝脏重量和维生素A总储存量（VA TBS）在肝脏中所占比例的额外假设，计算肝脏维生素A浓度。
      Liver vitamin A concentration equation, formula for TBS measurement in biochemical analysis.
      何处
      Liver weight equation showing relationship with body weight, mathematical formula.
      肝脏与体重比通常被估算为特定年龄的常数：婴儿：4-4.2%；儿童：3%；成人：2.4%；肝脏中总储存量（TBS）的维生素A比例随维生素A营养状况而变化。以往使用的估算值为：维生素A边缘或缺乏状态：0.5；维生素A充足状态：0.8-0.9。

结果

图2（图1）提供了在325 nm处监测的示例血清样品色谱图，对应方案第2部分。根据所使用的具体系统和色谱柱，视黄醇的典型保留时间为4–6分钟，内标物为6–8分钟。绿色阴影区域表示视黄醇组分的目标收集范围，以尽量减少杂质。视黄醇从血清中的提取效率通常≥85%，而皂化后的母乳和组织样品的提取效率较低，平均约为70–80%。在HPLC纯化过程中，可能会在主要的全反式峰之前或之后不久洗脱出少量视黄醇顺式异构体。在图1所示样品中未观察到明显的顺式异构体，但在参考文献17的补充图1中可能观察到。通常，在第二次HPLC纯化（未显示）或GC分离过程中（图2），会进一步分离出另一种异构体。

第3个方案部分的标准品、血清样本和空白样本的气相色谱-同位素比值质谱（GC-C-IRMS）色谱图示例如下（图2）9。每个样本均包含参考CO2峰，其13C富集度以国际原子能机构蔗糖标准物质（IAEA-CH-6）进行校准。

实验性同位素比值质谱（IRMS）测定同位素丰度的精密度（CV%） 13C/总C值：1）参考CO2的稳定性为0.012，线性为0.031（每项n = 10）；2）视黄醇标准品的日间稳定性为0.036，日内线性为0.022（每项n = 4）；3）实验组在沙鼠中包括基线及八个饮食处理组，C/总C值为0.073 ± 0.061（共9组，n = 46）9.

以下是使用方法4的RID方程，根据给药后14天测定的血清GC-C-IRMS数据计算TBS和肝脏VA浓度的示例：

研究参与者特征：

年龄：4 岁
体重：16.0 kg
Fa（2 个碳标记加上天然丰度）：0.11
Fb：0.010757
Fc：0.011057
施用的示踪剂剂量：1.0 µmol
给药后时间：14 天
VA 半衰期：32 天
吸收率：0.8
血清/肝脏中 TTR 比值（饮食未控制）：0.9
肝脏中 TBS 组分比例：0.8

计算：

TTR = (Fc-Fb)/(Fa-Fc)
TTR = (0.0110568 - 0.010757) / (0.11 - 0.0110568) = 0.0030300213
1/TTR = 1 / 0.0030300213 = 330.03

剂量保留率 = e-kt ，半衰期为32天，采样时间为14天
k = ln(2)/36 = 0.693147181 / 36 = 0.021660849
t = 14
e-kt = e-0.02166 × 14 = 0.738413073

药代动力学公式，VATBS = 剂量 × 吸收率 × 滞留率 × TTR 比值，方程示意图。

TBS = 1 × 330.03 × 0.8 × 0.738413073 × 0.9 = 175 µmol

用于计算肝脏维生素A浓度：
肝脏重量（g）= 1,000 × 体重（kg）× 3%（儿童估算值）
肝脏重量 = 1,000 × 16.0 × 0.03 = 480 g
肝脏维生素A浓度计算公式，用于生化分析中TBS测量的公式。
肝脏VA浓度 = (175 / 480) × 0.8 = 0.29 µmol/g

显示视黄醇和内标峰的色谱图，表明化合物的分离。
图1：人血清样品的高效液相色谱图。 使用系统1进行高效液相色谱分析，流动相为等度洗脱的90:10甲醇:水（MeOH:H2O），检测波长为325 nm。视黄醇峰的吸光度值约为0.1（绿色阴影区域）。在本步骤中，可选用内标C-23 β-阿朴胡萝卜醇对血清视黄醇浓度进行定量。 请点击此处查看该图的放大版本。

色谱结果、强度与时间关系图、峰分析、化学分离过程。
图2：GC-C-IRMS 色谱图展示视黄醇 13C/12C 的测定结果。 GC-C-IRMS 色谱图显示了（A）视黄醇标准品、（B）从血清中纯化的视黄醇以及（C）空白进样的结果，改编自 Gannon 等人9。三条信号轨迹分别对应质量数 44（对应 12C16O2）、45（对应 13C16O2 或 12C16O17O）和 46（主要对应 12C16O18O，用于校正质量数 45 中 17O 的贡献）。200 秒前的三个宽峰为 CO2 参比峰，已通过蔗糖 13C 参考物质进行校准。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

采用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法（GC-C-IRMS）测定视黄醇中13C富集度的方法，可为评估膳食干预18、维生素A代谢动力学建模19,20,21、临床研究或结合相对剂量响应法（RID）以改进维生素A营养状况评估的人群研究22提供有价值的数据。

在此检测中，从生物样品中纯化的视黄醇在温度梯度条件下由高纯度氦气（>99.99999% 纯度）携带通过气相色谱柱，从而与样品中残留的杂质分离。视黄醇被燃烧生成 CO2 和水，水被去除后，CO2 被导入同位素比值质谱仪（IRMS），测定其质量数为 44、45 和 46 的信号强度，并相对于 CO2 气体标准品计算 δ 值和原子百分比过剩值（AT%），该气体标准品还使用蔗糖标准物质（IAEA-CH-6）进行额外校准。

在制备注射用视黄醇的过程中，所提取的视黄醇必须具有极高的纯度，以获得可重复的同位素比值，并最大限度延长分析平台在彻底清洗之间的使用寿命。用于提取的溶剂应采用可获得的最高纯度等级，通常为质谱级（MS级）。所有玻璃器皿，如提取管、巴斯德吸管和高效液相色谱（HPLC）进样瓶，均应使用全新的，因为这些器皿难以彻底清洗干净以满足质谱分析的要求。应使用玻璃试管和吸管而非塑料制品，以尽量减少提取物中塑化剂的引入，避免其在气相色谱柱和燃烧柱上积聚。

根据具体的研究设计和采样来源，可对本示例分析流程进行相应调整。例如，可针对视黄醇纯化优化一台高效液相色谱（HPLC）系统。根据我们的经验，这需要在流动相中加入水，并且可能需要采用流动相梯度洗脱，或在进样至气相色谱-燃烧-同位素比值质谱（GC-C-IRMS）前延长样品干燥时间。我们发现，使用两台配备短等度洗脱方法的HPLC系统，可在满足分析要求的同时，在GC-C-IRMS上获得清晰的信号（图2）。采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）可能为视黄醇同位素稀释（RID）样品提供更简化的分析流程7。然而，GC-C-IRMS具有明显的优势，包括能够使用更低的剂量和同位素标记量、在更长的时间点定量示踪剂，以及分析富集度较低的样品。

该方法的局限性包括需要多种仪器、熟练的技术操作，以及由于样品制备时间较长而导致的样品通量受限。通过采用具有自动馏分收集功能的高效液相色谱仪（HPLC），可缩短每个样品所需的人员操作时间，因为HPLC纯化步骤采用等度洗脱方法，能够获得稳定的分析物保留时间。该方法可进一步优化为仅使用一次HPLC纯化步骤。我们目前并行使用两套系统，以提高通量，并在样品用正己烷复溶并注入气相色谱-燃烧-同位素比值质谱仪（GC-C-IRMS）之前促进样品干燥。

尽管气相色谱-同位素比值质谱法（GC-C-IRMS）在测定同位素比值方面极为灵敏，但其需要更多的总样品视黄醇质量以获得足够的视黄醇信号。样品需求量取决于样品体积和样品中维生素A（VA）的浓度。通常，目标为75 ng视黄醇以获得较强的峰信号，同时允许气相色谱传输和燃烧效率存在一定的波动。在实际操作中，在最佳运行条件下，我们已成功使用低至25 ng的进样量获得足够的信号。这相当于体积较小（约0.4 mL）、视黄醇浓度较低（约0.5 µmol/L）的血清样品，并且在提取和纯化过程中仅有少量损失。在相对剂量反应（RID）方法的分析开发中，一项重要改进是改用程序升温汽化（PTV）进样器。较低的起始温度可防止携带样品的正己烷过快膨胀，从而实现模拟柱上进样的效果。直接进样至色谱柱可使视黄醇信号最大化，但缺点是峰形略差且需要更频繁的维护。

母乳已被提议作为RID检测中血清样本的替代物。这一方法已在赞比亚哺乳期妇女中得到验证，这些妇女的维生素A储存水平普遍较低11。然而，该方法尚未在维生素A摄入量较高的女性群体中得到验证，例如在高收入国家或那些通过多种途径摄入维生素A的人群（包括膳食摄入、食物强化和补充剂）中的女性。

母乳维生素A评估相较于其他维生素A营养状况生化指标具有多项优势。母乳采集通常比采血更为简便，因为无需专业采血人员，且母乳采集通常被认为对受试者侵入性更小23。使用随机母乳样本十分便捷，仅需5 mL乳汁。此外，样本无需立即处理，从而缩短了样本处理时间，尤其适用于现场环境。然而，完整母乳样本的采集必须标准化，因为乳汁中脂肪和视黄醇的浓度在后乳中高于前乳，且乳脂和视黄醇浓度通常随一天中的时间以及距上次哺乳的间隔时间而变化1,24。对于随机样本，视黄醇浓度最好以每克乳脂中的含量表示。乳脂含量应尽可能在采集后立即采用奶油浓度法（creamatocrit method）测定25。样本应避光保存。用于高效液相色谱（HPLC）分析的分装样本（通常为1至5 mL）需在采集时即刻准备，因为乳汁在冻融后不再均匀。

在两种主要情况下，可能实现并有必要测定肝脏中维生素A（VA）的13C富集度。最常见的情况是在动物实验中使用13C标记的视黄醇，并采集肝脏组织。此时，计算所得的VA总储存量（TBS）将与通过高效液相色谱（HPLC）/超高效液相色谱（UPLC）测定的肝脏VA浓度进行比较，而肝脏储存库中13C的富集程度还可用于评估示踪剂在循环系统中的分布情况，相对于长期储存库的分布特征。此外，在某些特殊情况下，有可能获得已知情同意并服用了标记剂量维生素A的人类受试者的肝活检样本26,27。这些样本对于验证和测试13C-视黄醇的混匀情况同样具有重要价值。肝脏样本的处理首先需称取一定量组织，与无水硫酸钠研磨，以吸收水分并破坏组织结构。随后用50 mL二氯甲烷通过滤纸进行提取。取部分提取液在氮气下吹干，加入含0.1%丁基化羟基甲苯（作为抗氧化剂）的乙醇复溶。样本经皂化处理后，采用与母乳样本相同的流程进行提取。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH-R01 DC019357）和国际原子能机构协调研究项目（E43035）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
可溯源至VPDB-LSVEC标准的13C参考物质（蔗糖）国际原子能机构IAEA-CH-6 美国国家标准与技术研究院名称：RM 8542
乙腈（HPLC级）费希尔科技UN1648
乙醇（纯度200 proof，无水，≥99.5%）西格玛459836
玻璃巴斯德吸管任意品牌
玻璃试管任意品牌
氦气（研究级，纯度>99.9995%）任意品牌
己烷西格玛178918
甲醇（质谱级）VWRMSPP-A-456
陶瓷研钵和研杵任意品牌
正排量移液器 3-25 µL吉尔森FD10002
正排量移液器 10-100 µL吉尔森FD10004
正排量移液器 50-250 µL吉尔森FD10005
正排量移液器 100-1000 µL吉尔森FD10006
氢氧化钾费希尔科技UN1813
定性滤纸 #1，150 mm沃特曼1001-150
分液漏斗任意品牌
无水硫酸钠费希尔科技S415-212
容量瓶（50 mL）任意品牌

参考文献

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