需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

原位 基于MTT的冷冻切片成像技术检测肝细胞癌组织中的代谢活跃细胞

325 次观看

⸱

DOI：

10.3791/68575

⸱

2025年10月31日

 ,  ,  ,  , 
1Gastroenterology Department, First Hospital of Quanzhou Affiliated to Fujian Medical University, 2Medical School, Huaqiao University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种基于 MTT 的冷冻切片成像简易方案，用于检测肝细胞癌组织中具有代谢活性的细胞。该方法也可用于检测其他组织中的活性细胞 原位 在其他组织或器官中。

摘要

越来越多的证据（包括先前的研究）表明，肝细胞癌（HCC）组织中存在一类具有更强代谢活性和应激抵抗能力的细胞亚群。这类细胞是肿瘤进展和治疗耐药的关键驱动因素。然而，现有的方法对于 原位 活细胞检测通常会破坏组织完整性、改变细胞活性，或在技术上具有较高难度。本研究提出了一种新型、简便且非破坏性的方法 原位 通过线粒体依赖性的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）还原为不溶性甲臜结晶，检测肝细胞癌组织中代谢活跃的细胞。通过优化组织碎片大小（1 × 1 × 0.2 cm）3），培养条件（20% FBS、1 mg/mL MTT、3小时孵育并间歇性摇动）以及冷冻切片参数（20 µm厚度、4% PFA固定、DAPI复染），可在5小时内实现HCC活细胞的空间定位。该经济高效的方案无需特殊设备，且能保持组织结构完整性，从而可在组织表层区域实现高活力及耐应激细胞簇的空间识别。其局限性包括超过6小时后细胞活力持续下降，以及切片过程中晶体移位问题，可通过补充FBS和控制冷冻过程予以缓解。该方法为治疗耐受性亚群的单细胞分离提供了实用平台，有助于推进肝细胞癌（HCC）微环境研究。

引言

肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的第三大原因，其特征是高度异质性和高复发率1。这种空间和时间上的异质性导致肿瘤组织中的某些细胞群体在代谢、增殖、进展、应激耐受和耐药性方面比其他细胞更活跃。原位检测HCC组织中的活细胞具有重要的临床和生物学意义，因为这些细胞包含了正在增殖的亚克隆、治疗耐受的细胞群体以及启动转移的细胞。这些活细胞可能成为肿瘤复发、免疫逃逸和治疗失败的关键驱动因素2。

然而，目前的空间分析技术（例如，空间转录组学）需要专用仪器，且成本较高，而传统的整体分析方法往往忽略了活细胞的空间异质性及其与基质成分的动态相互作用3例如，切除后残留的存活肝细胞癌细胞表现出独特的代谢特征，而这些特征无法在解离的细胞系统中被真实重现4因此，推进空间分辨检测技术对于揭示活肿瘤细胞与其微环境之间的功能互作至关重要，最终将为精准治疗策略提供依据。尽管本课题组已采用流式细胞术或免疫组织化学（IHC）等传统方法检测肝细胞癌（HCC）中的活细胞，但这些方法需要对组织进行解离或固定，从而导致空间信息丢失，阻碍了对细胞间相互作用的分析。5,6因此，开发非破坏性、高分辨率的技术对于 原位 检测活细胞对于阐明肝细胞癌耐药机制和指导精准治疗至关重要。

快速检测并显示肝细胞癌组织中的活细胞 原位 无需破坏性处理，已建立一种基于3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）的简易组织培养方法。简而言之，取新鲜的薄片肝细胞癌组织（约1 × 1 × 0.2 cm）3) 首先在含有20%胎牛血清（FBS）和MTT（1 mg/mL）的DMEM培养基中培养3小时。随后，经4%多聚甲醛（PFA）固定并使用含DAPI的封片剂封片后，将OCT包埋的冷冻组织切片（厚度20 µm）置于明场或紫外光下进行显微观察。活细胞将呈现紫色、紫红色或紫黑色。采用本方案，我们成功在5小时内检测到肝细胞癌（HCC）组织中的活细胞。该方法可保持组织三维微结构，适用于后续多组学分析，且操作简便，具有时间和成本优势。然而，该方法也存在一定局限性。洗涤、切片和培养等多步骤操作可能引起组织结构变形和细胞凋亡，尤其在本研究中代谢活性较高的HCC组织中更为明显。此外，冷冻切片厚度增加会影响显微观察的清晰度和平整度。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有实验均按照《赫尔辛基宣言》进行，并经泉州第一医院伦理委员会批准（编号：FJMU IACUC2021257）。肝细胞癌组织由福建医科大学附属泉州第一医院在患者知情同意的情况下手术切除并收集。本实验需采取标准防护措施，包括穿戴实验服、一次性口罩和手套。

1. 组织制备

  1. 将一个无菌的 9 cm 培养皿置于冰上，加入 30 mL 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。
  2. 立即将手术切除的人肝细胞癌（HCC）组织转移至 PBS 中。
  3. 轻轻晃动培养皿 5 秒，以去除血液污染物，使用无菌移液管吸除 PBS。
    注意：重复此步骤三次。
  4. 将组织转移至培养皿的皿盖上。
    注意：组织易于黏附在未润湿的培养皿皿盖上，便于后续操作。
  5. 使用无菌手术刀（11 号）将组织切成约 1 × 1 × 0.2 cm3 的小块。
    注意：组织块的长和宽可适当调整，但厚度应小于 0.2 cm。
  6. 将组织块转移至另一个装有 30 mL 冰冷 PBS 的新鲜 9 cm 培养皿中。
  7. 轻轻晃动培养皿 5 秒，以去除血液污染物，使用无菌移液管吸除 PBS。
    注意：重复步骤 1.7 三次。将一个组织块在 PBS 中煮沸（95 °C，10 分钟）作为阴性对照。所有操作均需在无菌条件下进行。

2. 组织培养

  1. 向6孔板的每孔中加入1.8 mL完全培养基DMEM（预热至37 °C），其中含葡萄糖（终浓度 = 4.5 g/L）和L-谷氨酰胺（终浓度 = 2 mM）。然后，向6孔板的每孔中加入0.6 mL FBS（终浓度 = 20% v/v）和0.6 mL MTT储备液（终浓度 = 1 mg/mL）。
  2. 使用无菌镊子将组织碎片转移至各孔中。
  3. 将6孔板放入培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。
    注意：每30分钟轻轻摇晃培养板3秒。当组织碎片表面变为紫色或紫黑色时，即可终止孵育。

3. 终止与固定

  1. 吸去 MTT 培养基，用预冷的生理盐水洗涤组织碎片。
    注意：重复五次。
  2. 向 6 孔板的每个孔中加入 2 mL 4% 中性缓冲福尔马林（NBF）。
  3. 将培养板置于 4 °C 冰箱中固定 1 小时。

4. 冷冻切片

  1. 用干净的吸水纸轻轻吸去组织碎片表面的液体。
  2. 将组织放入盛有OCT包埋剂的冷冻模具中。
    注意：确保组织完全被OCT包埋剂覆盖。
  3. 在-80 °C的低温冰箱中冷冻组织20分钟。
  4. 将冷冻组织块置于-20 °C的恒冷切片机夹头上。
  5. 在-20 °C下切片至组织表面暴露，每次切片厚度为100 µm。
    注意：组织表面呈现类似紫色的着色。
  6. 使用带粘附涂层的载玻片收集厚度为20 µm的切片。
    注意：组织切片应呈现紫色、紫红色或紫黑色的色调。
  7. 在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定切片2分钟。
  8. 用PBS轻轻冲洗载玻片1分钟。
    注意：重复此步骤三次。

5. 封片

  1. 加入1滴含DAPI的溶液（终浓度：1 µg/mL） 封片剂
  2. 用盖玻片覆盖。
  3. 用指甲油密封边缘。
    注意：若不立即进行显微镜观察，边缘密封的载玻片可于4 °C避光保存。

6. 显微镜检查

  1. 使用明场显微镜，在20×放大倍数下通过明场观察呈紫色、紫红色或深紫色的甲臜沉积物（活细胞）。
  2. 使用荧光显微镜，在紫外光照射下检测蓝色DAPI信号（细胞核）。
  3. 合并明场与荧光通道，以实现空间定位关联。
    注：此处使用的软件为NIS Element F（版本4.00.06）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本研究成功检测了肝细胞癌组织中具有代谢活性的细胞，且未破坏组织结构。首先，明场图像（图1A) 显示，组织表面呈现出密集的细胞覆盖以及细胞在载玻片上的多层堆叠，证实了肝细胞癌（HCC）组织在培养和处理过程中保持了完整的结构完整性。值得注意的是，表层区域的细胞簇显示出明显的紫红色甲臜沉积物，提示存活细胞群体中存在线粒体活性。其次，DAPI 核复染可清晰识别荧光图像中细胞的位置与轮廓。图1B）。这些图像还显示切片中细胞核完整且分布均匀，证实了本方案对细胞结构的良好保存效果。第三，将明场图像（图1A）及其相应的荧光图像（图1B），我们可以通过甲臜阳性细胞（紫红色）与DAPI阳性细胞核（蓝色）的精确定位共定位，更轻松、准确地识别和区分活细胞，从而实现 原位 组织内活细胞的定位图1C).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

当前的方法学 原位 活细胞检测仍面临多方面的局限性。免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）虽广泛用于鉴定增殖标志物或凋亡相关蛋白，但因甲醛固定导致细胞膜完整性被破坏，存在明显缺陷。7此外，抗体在较厚组织切片中的渗透效果不理想8荧光活力探针（如Calcein-AM）虽能有效标记酯酶活性的活细胞 离体在缺氧的肝细胞癌区域，由于酶活性改变以及向坏死区域的非特异性扩散，其特异性降低9激光捕获显微切割（LCM）能够精确分离存活的细胞簇，但通量较低且会丢失空间位置信息，限制了其在细胞间通讯动态研究中的应用10新兴技术如多光子显微镜可实现深层组织成像，但成本高昂，且在长时间成像过程中会引发光毒性，从而人为干扰细胞活力11基于纳米颗粒的探针可靶向肝细胞癌特异性表面标志物，从而提高信号特异性，但其应用仍面临诸多挑战，例如被库普弗细胞非特异性摄取以及可能诱发氧化应激，进而干扰细胞活力的准...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由厦门市科学技术局（编号：3502Z20227197）和福建医科大学科研启动基金（2021QH1240）资助。感谢华侨大学的Xianying Zhang、Jingjing Zhou和Shaocong Weng提供的技术支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
-80 °C 冰箱（立式）Thermo Fisher ScientificTSX60086V
超净工作台（垂直层流）AIRTECHSW-CJ-1FD
CO2 培养箱（165 L）Thermo Fisher ScientificHeracell VIOS 160i（例如：51030400 / 51033559）
盖玻片（24×50 mm，#1.5）CITOGLAS (Citotest)0341-3610
培养皿（90 mm）NEST752001（示例）
含 DAPI 的封片剂BeyotimeP0131（5 mL/25 mL）
DMEM（高糖，含丙酮酸钠）Invitrogen (Gibco)11995-065
FBS（经认证，美国来源）Invitrogen (Gibco)A3160501
荧光显微镜NikonECLIPSE Ti2 系列
冷冻切片机（恒冷切片机）LeicaCM1950
载玻片（普通，25×75 mm）CITOGLAS (Citotest)0317-0001
MTT 试剂（粉末）BeyotimeST316
透明指甲油Beyotime—
中性缓冲福尔马林（NBF）Beyotime—
OCT 包埋剂SAKURA (Sakura Finetek)4583
光学显微镜（ upright）NikonECLIPSE Ci 系列（例如：Ci-L）
PBS（500 mL）BeyotimeC0221A
4% 多聚甲醛 PBS 溶液（固定液）BeyotimeP0099
移液器吸头（1 mL，低吸附）KIRGENKG1313-L
移液器吸头（200 µL）Axygen (Corning)T-200-Y（散装）/ T-200-Y-R-S（盒装，无菌）
单通道移液器Thermo Fisher ScientificFinnpipette F2（按量程对应货号）
手术刀HYSTIC型号各异（例如，供应商编号 100022208326）
镊子HYSTIC型号各异

参考文献

  1. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  2. Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  3. Calderaro, J., Couchy, G., Imbeaud, S. Histological subtypes of hepatocellular carcinoma are related to gene mutations and molecular tumour classification. J Hepatol. 67 (4), 727-738 (2017).
  4. Finn, R. S., Qin, S., Ikeda, M. Atezolizumab plus Bevacizumab in unresectable hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 384 (20), 1894-1905 (2020).
  5. Lin, C. C., Zhou, J. P., Liu, Y. P. The silencing of Pokemon attenuates the proliferation of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo by inhibiting the PI3K/Akt pathway. PLoS One. 7 (12), e51916(2012).
  6. He, J. The lactate receptor HCAR1 drives the recruitment of immunosuppressive PMN-MDSCs in colorectal cancer. Nat Immunol. 26 (3), 391-403 (2025).
  7. Zhou, H. G., Guo, M. Y., Li, J. Y. Hypoxia-triggered self-assembly of ultrasmall iron oxide nanoparticles to amplify the imaging signal of a tumor. J Am Chem Soc. 143 (4), 1846-1853 (2021).
  8. Baker, A. M., Huang, W. N., Wang, X. M. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nat Commun. 8 (1), 1998(2017).
  9. Morrison, J. K. Single-cell transcriptomics reveals conserved cell identities and fibrogenic phenotypes in zebrafish and human liver. Hepatol Commun. 6 (7), 1711-1724 (2022).
  10. Qi, L., Liang, J. Y., Li, Z. W. Deep learning-derived spatial organization features on histology images predicts prognosis in colorectal liver metastasis patients after hepatectomy. iScience. 26 (10), 107702(2023).
  11. Aizarani, N., Saviano, A. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  12. Tasdogan, A., Faubert, B., Ramesh, V. Metabolic heterogeneity confers differences in melanoma metastatic potential. Nature. 577 (7788), 115-120 (2020).
  13. Guo, D. Z. Single-cell tumor heterogeneity landscape of hepatocellular carcinoma: Unraveling the pro-metastatic subtype and its interaction loop with fibroblasts. Mol Cancer. 23 (1), 157(2024).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

MTT
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。