在此，我们介绍一种基于 MTT 的冷冻切片成像简易方案，用于检测肝细胞癌组织中具有代谢活性的细胞。该方法也可用于检测其他组织中的活性细胞 原位 在其他组织或器官中。
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方法文章
* These authors contributed equally
在此，我们介绍一种基于 MTT 的冷冻切片成像简易方案，用于检测肝细胞癌组织中具有代谢活性的细胞。该方法也可用于检测其他组织中的活性细胞 原位 在其他组织或器官中。
越来越多的证据（包括先前的研究）表明，肝细胞癌（HCC）组织中存在一类具有更强代谢活性和应激抵抗能力的细胞亚群。这类细胞是肿瘤进展和治疗耐药的关键驱动因素。然而，现有的方法对于 原位 活细胞检测通常会破坏组织完整性、改变细胞活性，或在技术上具有较高难度。本研究提出了一种新型、简便且非破坏性的方法 原位 通过线粒体依赖性的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）还原为不溶性甲臜结晶，检测肝细胞癌组织中代谢活跃的细胞。通过优化组织碎片大小（1 × 1 × 0.2 cm）3），培养条件（20% FBS、1 mg/mL MTT、3小时孵育并间歇性摇动）以及冷冻切片参数（20 µm厚度、4% PFA固定、DAPI复染），可在5小时内实现HCC活细胞的空间定位。该经济高效的方案无需特殊设备，且能保持组织结构完整性，从而可在组织表层区域实现高活力及耐应激细胞簇的空间识别。其局限性包括超过6小时后细胞活力持续下降，以及切片过程中晶体移位问题，可通过补充FBS和控制冷冻过程予以缓解。该方法为治疗耐受性亚群的单细胞分离提供了实用平台，有助于推进肝细胞癌（HCC）微环境研究。
肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的第三大原因，其特征是高度异质性和高复发率1。这种空间和时间上的异质性导致肿瘤组织中的某些细胞群体在代谢、增殖、进展、应激耐受和耐药性方面比其他细胞更活跃。原位检测HCC组织中的活细胞具有重要的临床和生物学意义，因为这些细胞包含了正在增殖的亚克隆、治疗耐受的细胞群体以及启动转移的细胞。这些活细胞可能成为肿瘤复发、免疫逃逸和治疗失败的关键驱动因素2。
然而，目前的空间分析技术（例如，空间转录组学）需要专用仪器，且成本较高，而传统的整体分析方法往往忽略了活细胞的空间异质性及其与基质成分的动态相互作用3例如，切除后残留的存活肝细胞癌细胞表现出独特的代谢特征，而这些特征无法在解离的细胞系统中被真实重现4因此，推进空间分辨检测技术对于揭示活肿瘤细胞与其微环境之间的功能互作至关重要，最终将为精准治疗策略提供依据。尽管本课题组已采用流式细胞术或免疫组织化学（IHC）等传统方法检测肝细胞癌（HCC）中的活细胞，但这些方法需要对组织进行解离或固定，从而导致空间信息丢失，阻碍了对细胞间相互作用的分析。5,6因此，开发非破坏性、高分辨率的技....
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所有实验均按照《赫尔辛基宣言》进行，并经泉州第一医院伦理委员会批准（编号：FJMU IACUC2021257）。肝细胞癌组织由福建医科大学附属泉州第一医院在患者知情同意的情况下手术切除并收集。本实验需采取标准防护措施，包括穿戴实验服、一次性口罩和手套。
1. 组织制备
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本研究成功检测了肝细胞癌组织中具有代谢活性的细胞，且未破坏组织结构。首先，明场图像（图1A) 显示，组织表面呈现出密集的细胞覆盖以及细胞在载玻片上的多层堆叠，证实了肝细胞癌（HCC）组织在培养和处理过程中保持了完整的结构完整性。值得注意的是，表层区域的细胞簇显示出明显的紫红色甲臜沉积物，提示存活细胞群体中存在线粒体活性。其次，DAPI 核复染可清晰识别荧光图像中细胞的位置与轮廓。图1B）。这些图像还显示切片中细胞核完整且分布均匀，证实了本方案对细胞结构的良好保存效果。第三，将明场图像（图1A）及其相应的荧光图像（图1B），我们可以通过甲臜阳性细胞（紫红色）与DAPI阳性细胞核（蓝色）的精确定位共定位，更轻松、准确地识别和区分活细胞，从而实现 原位 组织内活细胞的定位图1C).
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当前的方法学 原位 活细胞检测仍面临多方面的局限性。免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）虽广泛用于鉴定增殖标志物或凋亡相关蛋白，但因甲醛固定导致细胞膜完整性被破坏，存在明显缺陷。7此外，抗体在较厚组织切片中的渗透效果不理想8荧光活力探针（如Calcein-AM）虽能有效标记酯酶活性的活细胞 离体在缺氧的肝细胞癌区域，由于酶活性改变以及向坏死区域的非特异性扩散，其特异性降低9激光捕获显微切割（LCM）能够精确分离存活的细胞簇，但通量较低且会丢失空间位置信息，限制了其在细胞间通讯动态研究中的应用10新兴技术如多光子显微镜可实现深层组织成像，但成本高昂，且在长时间成像过程中会引发光毒性，从而人为干扰细胞活力11基于纳米颗粒的探针可靶向肝细胞癌特异性表面标志物，从而提高信号特异性，但其应用仍面临诸多挑战，例如被库普弗细胞非特异性摄取以及可能诱发氧化应激，进而干扰细胞活力的准.......
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作者声明无利益冲突。
本研究由厦门市科学技术局（编号：3502Z20227197）和福建医科大学科研启动基金（2021QH1240）资助。感谢华侨大学的Xianying Zhang、Jingjing Zhou和Shaocong Weng提供的技术支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| -80 °C 冰箱（立式） | Thermo Fisher Scientific | TSX60086V | |
| 超净工作台（垂直层流） | AIRTECH | SW-CJ-1FD | |
| CO2 培养箱（165 L） | Thermo Fisher Scientific | Heracell VIOS 160i（例如：51030400 / 51033559） | |
| 盖玻片（24×50 mm，#1.5） | CITOGLAS (Citotest) | 0341-3610 | |
| 培养皿（90 mm） | NEST | 752001（示例） | |
| 含 DAPI 的封片剂 | Beyotime | P0131（5 mL/25 mL） | |
| DMEM（高糖，含丙酮酸钠） | Invitrogen (Gibco) | 11995-065 | |
| FBS（经认证，美国来源） | Invitrogen (Gibco) | A3160501 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | ECLIPSE Ti2 系列 | |
| 冷冻切片机（恒冷切片机） | Leica | CM1950 | |
| 载玻片（普通，25×75 mm） | CITOGLAS (Citotest) | 0317-0001 | |
| MTT 试剂（粉末） | Beyotime | ST316 | |
| 透明指甲油 | Beyotime | — | |
| 中性缓冲福尔马林（NBF） | Beyotime | — | |
| OCT 包埋剂 | SAKURA (Sakura Finetek) | 4583 | |
| 光学显微镜（ upright） | Nikon | ECLIPSE Ci 系列（例如：Ci-L） | |
| PBS（500 mL） | Beyotime | C0221A | |
| 4% 多聚甲醛 PBS 溶液（固定液） | Beyotime | P0099 | |
| 移液器吸头（1 mL，低吸附） | KIRGEN | KG1313-L | |
| 移液器吸头（200 µL） | Axygen (Corning) | T-200-Y（散装）/ T-200-Y-R-S（盒装，无菌） | |
| 单通道移液器 | Thermo Fisher Scientific | Finnpipette F2（按量程对应货号） | |
| 手术刀 | HYSTIC | 型号各异（例如，供应商编号 100022208326） | |
| 镊子 | HYSTIC | 型号各异 |
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