过表达并纯化一种来自 Escherichia coli 的毒性核酸酶

摘要

本文介绍了一种在C41(DE3)表达系统中过表达重组Nsp15（一种具有毒性的核酸酶）的方法，随后通过亲和层析和尺寸排阻层析纯化带标签的蛋白。这些方案可适用于其他难以表达的毒性蛋白。

摘要

大肠杆菌（Escherichia coli）已被广泛用作表达系统以生产重组蛋白。然而，某些类型的重组蛋白（如核酸酶）由于其对细胞DNA或RNA的酶活性，在大肠杆菌（E. coli）中进行重组过表达时可能较为困难。此类毒性效应可能导致细胞生长缓慢和蛋白产量低下。冠状病毒的内切核糖核酸酶Nsp15即为一例：野生型（WT）γ冠状病毒Nsp15的产量远低于无催化活性的Nsp15。为解决这一问题，我们采用了C41(DE3)细胞以及同日单菌落起始培养的方法，以减轻毒性影响。带有N端6xHis标签的重组Nsp15通过钴基亲和层析进行过表达和纯化，随后采用尺寸排阻层析（SEC）进一步纯化。所得纯化蛋白的产量足以用于生化检测及冷冻电子显微镜结构研究。该方法已被证实可有效缓解毒性效应，并获得满足后续研究分析所需的蛋白产量。

引言

Escherichia coli （E. coli） 是一种广泛用于生产重组 蛋白的细菌。目前已开发出多种突变菌株，包括BL21(DE3)及其衍生菌株，用于表达目标蛋白¹。该过程通常由编码的噬菌体T7 RNA聚合酶驱动，并通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，IPTG是乳糖的类似物，可通过释放lac阻遏蛋白来激活lac操纵子^1,2,3。由于IPTG不能被水解，因此可实现持续的mRNA表达，从而提高蛋白产量³。

尽管这类系统对于许多蛋白质而言具有使用方便和表达稳定的特点，但某些类型的重组蛋白会在其中产生毒性 E. coli，导致蛋白质产量低下。重组蛋白的存在可能对细菌产生毒性，影响其生长，这可能是由于诱导前存在渗漏表达，或诱导后对细菌造成应激所致。^3,4结果是细菌的生长速率和存活率下降⁵抑制泄漏表达在成功表达毒性蛋白的过程中可能发挥重要作用。表达菌株的....

方案

1. 缓冲液与试剂的准备

1. 过表达试剂
   1. 在2 L带挡板的锥形瓶中，将16 g胰蛋白胨、10 g酵母提取物、5 g氯化钠（NaCl）和900 mL去离子水混合，配制1 L的2xTY培养基。在液体循环模式下高压灭菌至少30分钟。
      注意：每轮纯化至少需要2 L的2xTY培养基。
   2. 根据质粒准备相应的抗生素母液。对于Nsp15-pET-14b，取1.5 g氨苄青霉素溶于去离子水中，定容至15 mL，配制成100 mg/mL的氨苄青霉素溶液，置于15 mL锥形管中。将抗生素母液储存于-20 ˚C备用。
   3. 在500 mL玻璃瓶中，将2.5 g胰蛋白胨、1.25 g酵母提取物、2.5 g NaCl、3.75 g琼脂糖和250 mL去离子水混合，配制250 mL的Lysogeny Broth（LB）琼脂培养基。在液体循环模式下高压灭菌至少30分钟，然后冷却至手感温热。
   4. 将25 mL温热的LB琼脂培养基转移至已灭菌的250 mL三角烧瓶中（每块平板使用25 mL），加入25 µL 100 mg/mL氨苄青霉素，轻轻旋转混匀。使用移液管将25 mL培养基混合物加入无菌塑料培养皿中，避免产生气泡。
      1. 倾注平板时，用20%乙醇擦拭实验台面，并点燃本生灯以维持无菌环境，防止污染。
      2. 平板冷却后，于4 ˚C保存备用。

结果

由于Nsp15作为核酸酶具有毒性，起始培养通常需要约7小时才能达到OD₆₀₀为0.8–1.0。接种后，通常还需约3–5小时才能达到诱导所需的相同最佳OD₆₀₀（0.8–1.0）。在此情况下，倍增时间约为1小时。当表达Nsp15的催化失活突变体时，E. coli细胞的倍增时间表现正常（约20分钟），进一步证明核酸酶活性是导致毒性的原因（图1A）。

经过过夜诱导后，通常每2 L野生型培养物可收获6-9 g湿重的细胞沉淀。在多次不同Nsp15突变体的培养实验中，我们观察到较小的细胞沉淀与较高的核酸酶活性相关。对于催化失活的Nsp15，每2 L培养物获得的沉淀量明显更大，约为18-30 g。这些结果进一步支持核酸酶活性在表达过程中导致细胞毒性，但由于资源限制，我们尚缺乏以Western印迹形式提供的直接证据。

在实验流程中不同阶段取样进行凝胶电泳分析，结果显示，成功实现了对源自γ冠状病毒——传染性支气管炎病毒（In.......

讨论

本文介绍了一种详细的实验方案，可成功在 E. coli 中过表达具有毒性的核酸酶，并通过亲和层析和尺寸排阻层析进行纯化。采用当天制备的10 mL单菌落起始培养物替代过夜起始培养物，显著提高了不同培养批次间生长时间和蛋白产量的一致性。我们选择使用C41(DE3)细胞，该细胞含有降低T7 RNA聚合酶活性的突变，有助于缓解重组蛋白的毒性效应^1,4,8,9,10。在优化或调整本方案时，建议测试目标蛋白在Rosetta2、C43(DE3)或pLysS菌株中的表达情况。在撰写本文期间，我们发现本方案所用C41(DE3)细胞的商业来源已停产。目前我们找到了另外两家销售C41(DE3)等效细胞的公司，但尚未进行测试。另一种未在本方法中探讨的细胞类型是BL21-AI细胞，其通过pBAD启动子调控T7聚合酶的表达，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm PES，无菌，低蛋白结合，过滤系统，1 L	Corning	431098
AEBSF 丝氨酸蛋白酶抑制剂	Goldbio	30827-99-7
细菌学琼脂	Amresco	J637
ÄKTA go 纯化系统	Cytiva	29383015
Amicon Ultra 15 mL，30 kDa 分子量截留浓缩管	Millipore	UFC903024
氨苄青霉素钠	Goldbio	A-301-25
带挡板摇瓶	Nalgene	F0527
台式离心机	Eppendorf	5920R
BioPhotometer plus	Eppendorf	E-BP6132
牛凝血酶	BioPharm	91-030
Bradford 染料试剂	Boston BioProducts	BPA-200
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	114931
氯化钙	Sigma-Aldrich	C4901
数字干浴器	Bio Rad	1660562
一次性L型涂布棒	MedSupply Partners	62-1014-1
二硫苏糖醇	Goldbio	27565-41-9
牛胰脱氧核糖核酸酶I（DNaseI）	Sigma-Aldrich	D4527
Douce 组织研磨器，40 mL	Wheaton	357546
Econo-column 层析柱	Bio-Rad	737-1532
Enduro minimix 摇床混合器	Labnet	S0600
乙醇	Sigma-Aldrich	459844
Excella E25R 制冷摇床	Eppendorf	NB-E25R
FastPette V2	Labnet	P2000
Fiberlite F10-4x1000 LEX 固定角转子	Thermo Fisher Scientific	096-041075
Fiberlite F21-8x50y 固定角转子	Thermo Fisher Scientific	096-084275
Gel Doc EZ 成像仪	Bio-Rad	1708270
甘油	Sigma-Alrich	G5516
甘氨酸	Bio-Rad	161-0718
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
加热磁力搅拌器	VWR	12365-346
盐酸	VWR	BDH3028
咪唑	Goldbio	I-902-25
异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	Goldbio	12481C25
Lemo21(DE3) 感受态大肠杆菌细胞	New England Biolabs	C2528J
四水合氯化锰(II)	Sigma-Aldrich	M3634
微量离心管，0.5 mL	VWR	87003-290
微量离心管，1.7 mL	MedSupply Partners	15-1151
微量离心管，2 mL	Axygen	MCT-200-C
Mini-PROTEAN tetra 垂直电泳槽	Bio-Rad	10025025
Mini-Protean Tris-甘氨酸凝胶，4-20%	Bio-Rad	4568094
MyFuge 小型离心机	MedSupply Partners	C1008-B
Nalgene 1 L 超速离心瓶	Thermo Fisher Scientific	3141-1006
Nalgene Oak Ridge 离心管	Thermo Fisher Scientific	31139-0050
Nanophotometer	Implen	3769
非振荡培养箱	Labnet	I 5110
C41(DE3) 化学感受态过表达细胞	Biosearch Technologies	60442-1
C41(DE3) 化学感受态过表达细胞	Sigma-Aldrich	CMC0017	已停产；可选用 Biosearch C41(DE3) 细胞或 NEB Lemo21 细胞作为替代
培养皿	MedSupply Partners	62-1077-3
质粒（pET-14b 载体）	Genscript	定制订单
塑料微量比色皿	Fisher Scientific	14955127
PowerPac universal 电源	Bio-Rad	1645070
Precision glide 针头	Becton Dixon	305198
Precision plus protein 未染色标准蛋白	Bio-Rad	1610363
表达恢复培养基	Sigma-Aldrich	CMR0001K
S-4x1000 水平转子	Eppendorf	EP-S4X1
移液管，10 mL	Faclon	357551
移液管，25 mL	Faclon	35725
移液管，5 mL	Faclon	35743
移液管，50 mL	Pr1ma	PR-Sero-50
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L3771
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	567530
超声破碎仪	Fisher Scientific	FB505
Sorvall Lynx 4000 离心机	Thermo Fisher Scientific	75006580
Sephadex G-25 M PD-10 层析柱	Cytiva	17085101
ß-巯基乙醇	Millipore	444203
不锈钢 Griffin 烧杯	Polar Ware	13977-010-EA
无菌 Falcon 管，15 mL	Falcon	352097
无菌 Falcon 管，50 mL	Falcon	352098
Superdex 200 10/300 GL 层析柱	Cytiva	28990944
注射器，1 mL	Air-Tite	A1
注射器，3 mL	Becton Dixon	309657
TALON 金属亲和树脂	Takara	635503
牙签	Creativity Street	PAC3690-01
Tris 碱	Goldbio	T-400-1
Triton X-100	MP Biomedicals	807423
胰蛋白胨	Research Products International	T60065
Vornado	Benchmark	BV101-G
酵母提取物	Research Products International	Y20025