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从临床样本中提取组蛋白用于质谱法进行表观遗传学分析

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DOI：

10.3791/68584

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2025年11月21日

 ,  , 
1Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hematology-Oncology (DIPO), University of Milan

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案可从多种临床样本中高效提取组蛋白，用于后续通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行翻译后修饰分析。通过实现对关键组蛋白修饰的可靠检测，该方法可作为大规模临床队列中全面表观遗传学分析的重要工具。

摘要

大量实验证据表明，表观遗传机制在癌症的发生、发展和复发中发挥重要作用。其中，组蛋白变体及其翻译后修饰（PTMs）通过所谓的“组蛋白密码”调控染色质的结构与动态性以及基因组的可及性，从而影响转录、复制和DNA损伤修复等关键的DNA相关过程。在癌症中常可观察到失调的组蛋白PTM模式，其中一些标志物已被证实可作为诊断和预后的生物标志物。因此，开发能够在临床样本中实现无偏倚且全面的组蛋白PTM谱型分析的新方法，对于刻画肿瘤的表观遗传图谱具有重要价值。本文介绍了一种从临床样本（包括速冻组织、OCT包埋冷冻组织以及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）活检样本）中高效提取组蛋白的实验方案。该方法可获得足量且高质量的组蛋白，适用于后续基于高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的自下而上（bottom-up）分析策略。该工作流程能够对原发性肿瘤样本中的关键组蛋白修饰（特别是赖氨酸乙酰化和甲基化）进行可靠检测与定量，为癌症的分子特征分析提供了一个额外的维度。

引言

在真核细胞的细胞核中，组蛋白与DNA组装形成核小体，核小体是染色质的基本结构单位。每个核小体包含约146 bp的DNA，缠绕在一个由两份核心组蛋白H2A和H2B以及两对组蛋白H3和H4二聚体组成的八聚体上。此外，还存在一种连接组蛋白H1，它通过结合核小体及核小体之间的连接DNA片段，促进染色质的高级结构形成1。组蛋白携带多种翻译后修饰（PTMs），这些修饰主要位于其N端尾部。这些修饰包括甲基化、多种类型的酰化（如乙酰化、丙酰化、丁酰化等）、磷酸化、SUMO化、泛素化、ADP-核糖基化以及巴豆酰化等，其中赖氨酸和精氨酸的甲基化以及赖氨酸的乙酰化研究最为深入2。特定类型、位置和组合的组蛋白修饰构成了所谓的“组蛋白密码”。该密码由组蛋白N端尾部上的各种翻译后修饰（PTMs）组成，这些修饰由特异的组蛋白修饰酶进行添加或去除。随后，这些修饰被效应蛋白识别，导致染色质结构发生改变，例如压缩或去凝集，最终影响包括DNA损伤修复、复制以及特别是基因转录在内的多种生物学过程3,4。

DNA甲基化和组蛋白翻译后修饰（PTMs）是癌症中研究最为广泛的表观遗传特征之一3。近期的实验证据表明，多种癌症类型中存在多种组蛋白PTMs水平的改变。值得注意的是，H4K20me3和H4K16ac的丢失已被报道为癌症的标志性特征，因为在几乎所有肿瘤中，其水平相较于正常组织均有所下降4。我们课题组通过基于质谱（MS）的方法量化了多种癌症与其正常对应组织中H3K14ac的减少，发现H3K14ac的丢失可能是癌症的潜在标志特征5。此外，大量研究强调了组蛋白PTMs的预后价值，表明其整体水平的改变（主要通过患者活检样本的免疫组织化学方法评估）与癌症进展、组织学分级以及治疗反应相关6,7,8。因此，在癌症样本中对组蛋白PTMs进行分析，对于发现新的诊断和预后生物标志物，以及所谓表观遗传药物（epi-drugs）的潜在靶点具有重要意义8。

分析细胞系和临床样本中组蛋白PTMs的常用方法依赖于基于抗体的技术，例如免疫印迹、免疫组织化学和酶联免疫吸附测定（ELISA）。9然而，基于抗体的方法存在多种局限性，包括交叉反应性，或相反地，表位遮蔽10交叉反应是指抗体与具有相似表位的非目标分子结合，可能导致假阳性结果；而表位遮蔽则是指由于邻近残基存在其他修饰，导致特定表位（在此为组蛋白PTM或变体）未能被检测到的现象。此外，使用抗体进行组蛋白修饰分析时通常需要较大量的组织，因为同时可检测的PTM种类有限，因此进行多重分析时需处理多个组织切片。11质谱技术（MS）已成为分析组蛋白翻译后修饰和组蛋白变体的首选方法，克服了基于抗体方法的局限性5,8质谱技术依赖于检测肽段和蛋白质的理论质量与实验测定质量之间的差异（Δm，即质量差）。该方法具有无偏性、全面性和定量性，能够鉴定和定量翻译后修饰及蛋白质变体，且无需预先假设 先验的 了解其位点，这使得质谱技术在癌症及其他病理条件下组蛋白翻译后修饰变化的高灵敏度与高准确性分析中具有重要价值8.

本文介绍了一种针对临床样本的组蛋白提取优化方案，并结合基于质谱（MS）的组蛋白翻译后修饰（PTM）分析流程，后文将此流程称为表观蛋白质组学工作流程。患者活检样本主要以新鲜冷冻（FF）样本、最佳切割温度（OCT）冷冻样本以及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本的形式保存12。新鲜活检样本通常在液氮或预冷的异戊烷中速冻，不添加任何保存介质13；而OCT冷冻样本则含有水溶性冷冻保护包埋介质，主要成分为聚乙烯醇和聚乙二醇，有助于组织切片14。另一方面，FFPE样本经福尔马林固定并包埋于石蜡中，是临床标本最常用的保存方式，因其可在室温下长期保存数年，避免了低温或超低温储存带来的高昂维护成本15。由于不含保存添加剂，速冻样本可直接用于组蛋白提取，而OCT冷冻样本和FFPE样本则需首先去除包埋介质或固定剂。此外，FFPE样本还需进行充分的蛋白质去交联和抗原修复。

本方案详细阐述了从新鲜冷冻、OCT包埋以及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的临床样本中提取组蛋白的方法，通过充分考虑每种样本保存类型所特有的技术挑战，确保获得足量且高质量的组蛋白，以满足后续质谱分析的需求（步骤1）。从临床样本中纯化的组蛋白在变性条件下通过蛋白质凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离，随后进行衍生化处理，并通过酶解消化生成适合自下而上质谱分析的肽段（长度为4-15个氨基酸）16（步骤2）。具体而言，组蛋白采用类似ArgC的酶解策略：通常在未修饰赖氨酸（K）和精氨酸（R）的C端切割的胰蛋白酶，在使用丙酸酐（PRO）对未修饰及单甲基化赖氨酸进行化学酰化修饰后，仅在精氨酸的C端进行切割。随后，将Arg-C样酶解产生的组蛋白肽段通过添加苯基异氰酸酯（PIC）对其N端进行酰化修饰。该进一步的衍生化处理可增强肽段的疏水性，从而在反相高效液相色谱（RP-HPLC）中实现短组蛋白肽段的更好分离，提高同量异序肽段形式（isobaric peptidoforms）的鉴定与定量能力17,18（步骤3）。总体而言，本文所述方法凸显了基于质谱的组蛋白谱型分析在癌症表观遗传学研究中的强大作用。

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方案

新鲜冷冻和OCT冷冻组织活检样本来自在欧洲肿瘤研究所（米兰）接受手术的患者，并已获得患者的知情同意；而FFPE活检样本则来自在卡洛·贝斯塔神经学研究所（米兰）接受手术的患者。本研究已获得欧洲肿瘤研究所伦理委员会（研究编号UID 2550）和卡洛·贝斯塔神经学研究所伦理委员会（研究编号CET 39/24）的批准。

1. 从患者来源的组织中提取组蛋白（图1A）

注意：为分析代表性肿瘤细胞群体的组蛋白并减少样本间变异，建议使用肿瘤细胞含量至少为50%的临床活检样本，并避免含有坏死区域和/或大量免疫细胞浸润的样本。

  1. 从新鲜冷冻组织中富集组蛋白（预计耗时：60 分钟）
    注意：所有步骤均需在冰上操作。
    1. 将组织在冰上解冻，并切取约 20–30 mg 的组织块，通常相当于约 2 mm3 的组织体积。
    2. 将样本转移至 1.5 mL 离心管中，使用剪刀（材料表）将组织剪成小块。
    3. 加入 1 mL 核分离缓冲液（表 1），并新鲜添加 材料表 中所列的蛋白酶抑制剂，充分混匀。
    4. 将样本转移至 Dounce 匀浆器中（材料表）。
      注意：若存在较大组织块，可使用剪去尖端的 p1000 吸头以更有效地收集样本。
    5. 先使用松动研杵，再使用紧密研杵（材料表）进行匀浆，直至肉眼不可见组织碎片。
    6. 使用 100 µm 细胞滤网（材料表）过滤匀浆后的样本，以去除组织碎片。
    7. 使用 p200 移液器剧烈吹打数次，以溶解细胞膜，并将样本转移至新的 1.5 mL 离心管中。
    8. 使用台式离心机（材料表）在 4 °C 条件下以 2,300 x g 离心 15 分钟，沉淀细胞核。
    9. 弃去上清液，并将核沉淀重悬于 50–100 µL 核分离缓冲液中，缓冲液中添加 0.1% SDS 以溶解核膜（材料表）。
    10. 加入 250 U 苯甲酸酶核酸酶以消化核酸，充分混匀后于 37 °C 孵育 2 分钟（材料表）。
      注意：若样本仍较粘稠，可在水浴中超声处理（设置：开启 30 秒/关闭 30 秒，持续 10 分钟；功率：高；温度：4 °C）。此步骤后，样本可在 -20 °C 保存。
  2. 从 OCT 包埋样本中富集组蛋白（预计耗时：90 分钟）
    注意：本方案已针对四至五张 10 µm 厚的 OCT 切片（相当于 20–60 mg 组织）进行优化。然而，组织切片数量取决于临床活检类型及总组织面积。鉴于临床样本通常稀缺，也可使用较少起始组织量进行提取，尽管这可能导致组蛋白修饰的检测灵敏度降低。
    1. 将四至五张 10 µm 厚的组织切片（约相当于 20–60 mg 组织）放入 1.5 mL 离心管中。
    2. 加入 1 mL 冰冷的 70% 乙醇（表 1），在 4 °C 条件下于旋转仪（材料表）上孵育 2 分钟以洗涤切片。
    3. 在台式离心机中于 4 °C 以 16,000 x g 离心 2 分钟。
    4. 重复步骤 1.2.2 和 1.2.3 共 3 次。
    5. 在 1 mL 双蒸水（ddH2O）中于 4 °C 旋转孵育 2 分钟，使样本复水（材料表）。
    6. 在台式离心机中于 4 °C 以 16,000 x g 离心 2 分钟（材料表）。
    7. 使用 1x PBS（材料表）重复步骤 1.2.5 和 1.2.6 两次。
    8. 继续执行新鲜冷冻样本组蛋白富集方案的第 1.1.2 步。
  3. 从 FFPE 样本中提取组蛋白（预计耗时：8 小时）
    注意：本方案针对四张 10 µm 厚的 FFPE 切片（约相当于 20–60 mg 组织）开发。对于大多数组蛋白修饰的质谱分析，此起始量已足够，且在材料不紧缺时为稳妥的起始点。然而，也可使用更少的起始材料，这在分析临床样本时常因组织量有限而尤为重要。尽管使用较少起始材料是可行的，但通常会降低低丰度组蛋白修饰（如 H3K27ac 或多甲基化的 H3K27/K36 肽段）的定量稳健性，且该效应可能因组织类型及样本间差异而有所不同。尽管如此，本实验室先前已证明，基于质谱的组蛋白翻译后修饰谱分析可成功应用于激光显微切割的乳腺癌 FFPE 样本区域，其细胞数量可低至 1,000 个18。
    1. 将四张 10 µm 厚的 FFPE 切片（约相当于 20–60 mg 组织）放入 1.5 mL 离心管中。
    2. 向样本中加入 1 mL 石蜡溶解剂，并以最大速度涡旋振荡（材料表）30 秒，直至石蜡完全溶解。
      警告：石蜡溶解试剂具有致突变性、致癌性且易燃，必须在化学通风橱中操作。
      注意：当肉眼不可见石蜡碎片，且石蜡溶解剂呈现均匀的乳白色时，表明石蜡已完全溶解。
    3. 在台式离心机中于室温以 16,000 x g 离心 3 分钟，弃去上清液。为避免在去除上清液时意外吸走样本，可使用较小的吸头（如 p200 或 p10 吸头）套在真空泵或移液器末端。
    4. 重复步骤 1.3.2 和 1.3.3 额外三次（共 4 次），以确保石蜡完全去除。或者，可称量完全脱蜡后的样本，以获得所处理组织量的参考值。
    5. 加入 1 mL 95% 乙醇溶液（表 1），并以最大速度涡旋振荡 30 秒，确保组织完全重悬。
    6. 在台式离心机中于室温以 16,000 x g 离心 3 分钟，弃去上清液。或者，可称量脱水后的样本，以获得所处理干组织量的参考值。
    7. 依次使用 70%、50%、20% 乙醇（表 1）及 ddH2O 重复步骤 1.3.5 和 1.3.6，以使样本复水。
    8. 加入 200 µL 提取缓冲液（表 1）。
      注意：若存在较大组织块，可用剪刀将其剪成更小片段。根据组织量，可适当增减提取缓冲液的体积，以确保充分裂解。对于特别小的沉淀，若重悬于低于 100 µL 提取缓冲液中，可使用超声设备（材料表）进行超声处理（开启 30 秒/关闭 30 秒，功率：高，共 10 个循环）。
    9. 使用带 3 mm 微型探头的数字超声仪（材料表）在提取缓冲液中进行超声匀浆（>15 个循环，开启 5 秒/关闭 2 分钟，功率：15–30%）。
      注意：当溶液中无可见组织颗粒，且提取缓冲液呈现均匀、无浑浊的颜色时，可认为样本已充分匀浆。超声过程中保持样本在室温。冰浴可能导致提取缓冲液中的 SDS 沉淀，从而影响组织匀浆效果。充分的超声处理对实现完全组织裂解和蛋白提取至关重要。应将微型探头置于样本管中适当高度（不得接触管底，以免释放塑料颗粒；也不得位于空气-提取缓冲液界面，以免产生泡沫和气泡）。
    10. 匀浆完成后，在恒温混匀仪中于 95 °C 孵育 45 分钟。每 15 分钟打开管盖一次，以促进甲醛挥发。
    11. 在恒温混匀仪中于 65 °C 孵育 4 小时。每 20–60 分钟打开管盖一次，以促进甲醛挥发。
    12. 在台式离心机中于室温以 16,000 x g 离心 1 分钟，将上清液转移至新管中。
      注意：此时样本可在 -20 °C 保存。

表1：缓冲液成分。 请点击此处下载该表格。

2. 通过SDS-PAGE分离组蛋白及凝胶内消化

  1. SDS-PAGE（图1B；预计耗时：2 小时）
    1. 为评估组蛋白纯度并估算其含量，将组蛋白提取物的1/10上样至17%聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE；表1），同时上样已知量的重组组蛋白作为参照，如图1B所示。
      注意：除上样1/10组蛋白提取物外，也可以上样经耐高浓度去污剂蛋白定量方法（如双辛可宁酸（BCA）蛋白测定法19）测定的15–50 µg蛋白质。但请注意，新鲜冷冻、OCT包埋冷冻及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中组蛋白相对于总蛋白的富集程度可能存在显著差异，组蛋白量的定量只能基于SDS-PAGE结果。可以上样1、0.5和0.25 µg的重组组蛋白H3.1（材料表）作为参照，以更精确地定量组蛋白含量。
    2. 将样品与十二烷基硫酸锂（LDS）上样缓冲液或等效的SDS-PAGE上样缓冲液（例如Laemmli缓冲液）混合，并加入二硫苏糖醇（DTT；材料表），使其终浓度为10 mM。
    3. 在恒温混匀仪中95°C变性样品5分钟。
    4. SDS-PAGE分离蛋白后，使用考马斯亮蓝染色（材料表）对凝胶进行染色。
    5. 通过目视或软件辅助20定量临床样本中组蛋白条带，并与已知量的重组组蛋白H3条带比较，估算组蛋白产量。
  2. 组蛋白凝胶内消化（图2；预计耗时：2天）
    注意：由于组蛋白序列中赖氨酸和精氨酸氨基酸残基频率较高，标准胰蛋白酶消化会产生过短的肽段，不利于液相色谱-质谱（LC-MS）检测和翻译后修饰（PTM）鉴定。因此，采用类ArgC消化策略进行组蛋白PTM的质谱分析。通过化学修饰赖氨酸，可阻止胰蛋白酶在这些位点的切割，仅在精氨酸的C末端进行切割，从而产生较长的肽段（4–15个氨基酸），其中包含序列内部的修饰赖氨酸；总体而言，该方案有助于组蛋白修饰肽段的质谱检测与定量，已在多篇文献中详细描述8,17,21。
    ​可选：可将内标物（例如重同位素标记的加标物、合成标记肽段22）以1:1比例与组蛋白样品混合，以实现质谱中更准确的肽段定量（图2B）。
    1. 根据步骤2.1.5中估算的组蛋白含量，将3–5 µg组蛋白样品上样至17%聚丙烯酰胺凝胶（图2B）。
    2. SDS-PAGE完成后，通过考马斯亮蓝染色显影蛋白。
      注意：为防止可能干扰LC-MS/MS分析的污染，建议在无角蛋白环境中进行后续操作（例如专用通风橱），因为角蛋白是质谱分析中的强污染物。
    3. 使用手术刀（材料表）切取对应于核心组蛋白分子量范围的凝胶条带（凝胶条带位于10–18 kDa之间，各核心组蛋白分子量参考如下：H3约17 kDa，H2A-H2B约14 kDa，H4约11 kDa），并将条带切成约1 mm3的小块。
    4. 借助手术刀将凝胶小块转移至1.5 mL离心管中。
      注意：为完全覆盖凝胶小块，可增加下述体积，同时保持试剂化学计量比不变。
    5. 加入50%乙腈（ACN）的ddH2O溶液（表1）以脱色凝胶小块。在恒温混匀仪中1,400 rpm、室温孵育10分钟，随后弃去上清液。
    6. 重复步骤2.2.5，直至凝胶小块完全脱色。
    7. 加入100% ACN（材料表）使凝胶小块脱水。在恒温混匀仪中1,400 rpm、室温孵育10分钟，随后弃去上清液。
    8. 重复步骤2.2.7，直至凝胶小块呈白色且坚硬，即完全脱水。
    9. 在真空离心浓缩仪中室温干燥凝胶小块5分钟（材料表）。
      注意：组蛋白中半胱氨酸含量极低（组蛋白H3仅在第96和110位含有两个半胱氨酸（UniprotKB ID P68431），组蛋白H2B仅在第154位含有一个半胱氨酸（UniprotKB ID B4DR52））。此外，这些半胱氨酸位于底向上质谱分析中ArgC样消化无法检测到的肽段内，因此巯基化学加合物23不会成为组蛋白质谱分析的人工假象，故本方案中不进行半胱氨酸还原和烷基化步骤。
    10. 向每管中加入15 µL 7.7 M丙酸酐（PRO）溶液（材料表）和26 µL 1 M碳酸氢铵（AmBic）（材料表），在恒温混匀仪中350 rpm、37°C孵育10分钟。
      注意：由于酸酐溶于反应性缓冲液后易挥发，切勿预先配制PRO与AmBic的母液混合物，而应分别加入各样品，以确保每管中PRO浓度恒定。
    11. 加入1 M AmBic完全覆盖凝胶小块（推荐体积：80 µL），在恒温混匀仪中1,400 rpm、37°C孵育4小时，随后完全移除液体。
      ​注意：添加1 M AmBic以维持碱性pH，有利于PRO催化未修饰及单甲基化赖氨酸的丙酰化反应。
    12. 用ddH2O洗涤三次，每次在恒温混匀仪中1,400 rpm、室温孵育10分钟，每次洗涤后弃去液体。
    13. 加入50% ACN，在恒温混匀仪中1,400 rpm、室温孵育15分钟，随后弃去液体。
    14. 加入100% ACN完全脱水凝胶小块，在恒温混匀仪中1,400 rpm、室温孵育15分钟，随后弃去液体。
    15. 重复步骤2.2.14，直至凝胶小块呈白色且干燥。
    16. 在真空离心浓缩仪中室温干燥凝胶小块5分钟。
    17. 向每个样品中加入4 µL胰蛋白酶溶液（表1）和20 µL消化缓冲液（表1），冰上孵育10分钟，使胰蛋白酶充分渗入凝胶小块。
      注意：此步骤使用高浓度胰蛋白酶溶液和消化缓冲液（ddH2O中含50 mM AmBic，形成适合胰蛋白酶切割的碱性pH环境），使酶在37°C激活前被凝胶小块充分吸收。
    18. 当高浓度胰蛋白酶完全被吸收后，用额外消化缓冲液充分覆盖凝胶小块（指示体积：80 µL），在恒温混匀仪中37°C过夜孵育。
    19. 为从凝胶小块中提取消化后的肽段，加入100 µL 100% ACN，在恒温混匀仪中1,400 rpm、室温孵育20分钟。
    20. 收集上清液并转移至新的1.5 mL离心管中。
    21. 向凝胶小块中加入80 µL 100% ACN，在恒温混匀仪中1,400 rpm、室温孵育10分钟。
    22. 收集上清液并与步骤2.2.20收集的上清液合并，随后在真空离心浓缩仪中浓缩至1–5 µL体积。
      注意：使用真空离心浓缩仪可蒸发有机溶剂（ACN）。但建议此阶段不要将样品完全干燥，以免影响后续衍生化步骤。若样品意外干燥，可用ddH2O重新溶解，并在水浴中超声5分钟。
    23. 向每个样品中加入ddH2O至终体积15 µL，然后加入2 µL 1 M三乙基碳酸氢铵（材料表）和3 µL苯基异氰酸酯（PIC）溶液（表1），在恒温混匀仪中350 rpm、37°C孵育90分钟。
      警告：PIC具有致突变性和致癌性，建议在化学通风橱中操作。由于PIC高度反应性和挥发性，不建议预先配制三乙基碳酸氢铵与PIC的母液混合物，而应分别加入各试剂，以确保PIC浓度准确。
    24. 向每管中加入8 µL 1%三氟乙酸（TFA；材料表）以终止PIC衍生化反应。
    25. 用100 µL缓冲液A（表1）稀释各样品，并将其加载至C18固相萃取小柱（Stage tips，按24所述方法制备或从不同供应商购买）。
    26. 在摆动转子离心机中4°C、2,100 x g离心10分钟，使组蛋白肽段结合至C18树脂。
      注意：样品可在Stage tips上4°C保存数月。
    27. 向C18 Stage Tips中加入30 µL洗脱缓冲液（表1），并将小柱插入新的1.5 mL离心管中。在台式离心机中4°C、1,000 x g离心10分钟，以洗脱组蛋白肽段。
    28. 使用真空离心浓缩仪将样品浓缩至1–3 µL体积，然后加入1% TFA使终体积达到6 µL。
    29. 将5 µL肽段溶液加入96孔微孔板（材料表）用于质谱分析，并用密封垫（材料表）密封。

3. 高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）及数据分析（图3）

注意：此处描述的参数适用于通过 EASY Spray 色谱柱连接至 Q Exactive Plus Orbitrap 质谱仪的 ESAY-nLC 1200 液相色谱系统（材料表），但也可使用类似或同等仪器，并相应调整参数。

  1. 高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）（预计每样本耗时：90 分钟）
    1. 将步骤 2.2.29 中的 5 µL 组蛋白肽取 3 µL（根据 SDS-PAGE 定量结果，相当于约 0.25–0.8 µg 组蛋白）注入 C18 纳米柱（材料表），在缓冲液 A 中以 500 nl/min 的恒定流速进样。
    2. 以 250 nL/min 的流速施加 10%–45% 缓冲液 B 的 55 分钟线性梯度，用于分离肽段。
    3. 采用数据依赖采集模式（DDA）获取 MS/MS 数据，通过专用软件包（材料表）在 MS1 与 MS2 之间自动切换。
      注：采集参数及通用设置请参见 表 2。
  2. RAW 质谱数据的分析
    注：本方案中，组蛋白翻译后修饰（PTM）的定量分析使用 EpiProfile 软件，该软件为开源脚本（https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family），操作简便，适用于 H3 和 H4 赖氨酸甲基化与乙酰化等标准分析。然而，经验更丰富的用户可对 EpiProfile 进行定制，以分析非标准修饰或不同样品制备流程所得数据。请注意，运行 EpiProfile 需要有效的 MATLAB 许可证25。
    1. 使用 EpiProfile 2.0 软件（PRO-PIC 版本）25（材料表）分析所获得的 RAW 数据，并通过选择选项 histone_normal 进行无标记分析，或选择 histone_SILAC 用于 SUPER-SILAC 内标添加实验。设置 ndebug = 0。
    2. 针对每种组蛋白肽（例如 H3_3-8），通过将 EpiProfile 计算得到的提取离子色谱图（XIC）除以该肽段所有 XIC 值的总和，计算每种修饰肽形式（例如 H3_3-8 未修饰、me1、me2、me3）的相对丰度（%RA）。
      注：可选地，可通过检查质谱图并使用文献18,26 所述的专用谱图布局对 EpiProfile 计算的 XIC 值进行手动验证和定量。
    3. 针对每种肽形式，通过将每个内源性轻链肽的 %RA 除以添加至各样品中的 SUPER-SILAC 混合物所提供的相应重链肽的 %RA，计算轻链与重链（L/H）比值。
    4. 将 L/H 比值转换为对数尺度。为突出不同样本间肽形式丰度的显著差异，可进行统计分析，并将所有样本的 L/H 比值以热图和散点图形式可视化展示，如 图 4 所示。

表2：本方案所用LC-MS/MS系统的采集参数与通用参数设置列表。 请点击此处下载该表格。

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结果

我们已按照上述方案，从新鲜冷冻和OCT冷冻的乳腺癌样本以及FFPE包埋的脑膜瘤样本中提取了组蛋白。如图1A所示，对于冷冻样本，我们去除了存在的OCT包埋剂，并在含有温和去垢剂（0.1% Triton，步骤1.1）的细胞核分离缓冲液中进行样本匀浆，以实现细胞核的分离。随后，我们通过添加0.1% SDS提取组蛋白；而对于FFPE样本，则进行脱蜡、复水和去交联处理，并在强变性条件下提取蛋白质（提取缓冲液含2% SDS，步骤1.3）。为评估组蛋白的产量和质量，分别取两份乳腺癌新鲜冷冻和OCT冷冻样本的核提取物的1/10，以及两份脑膜瘤FFPE样本总蛋白提取物的1/10，与1、0.5和0.25 µg的重组组蛋白H3.1（作为上样参照）一同上样，在17%聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离（图1B）。

在新鲜冷冻和OCT冷冻样本中，经过细胞核分离后，我们观察到组蛋白H2A/H2B、H3和H4相较于其他核蛋白有明显的富集。基于H3.1标准品的肉眼观察及软件辅助定量分析显...

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讨论

本文所述方法提供了一种简单且稳健的工作流程，可高效地从以新鲜冷冻、OCT冷冻和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）形式保存的临床样本中分离组蛋白，进而通过质谱分析对其修饰图谱进行表征。后续的样品制备流程采用SDS-PAGE分离及凝胶内PRO-PIC胰蛋白酶消化，可有效去除去垢剂、盐类及其他质谱干扰物33，并实现组蛋白赖氨酸乙酰化和甲基化的准确、稳健定量。重要的是，通过苯基异氰酸酯（PIC）对N端进行衍生化修饰，可增强短组蛋白肽段（如H4_20-23肽段和H3_3-8肽段）的质谱检测灵敏度17，也可用于分析较罕见的酰化修饰，如赖氨酸甲酰化、巴豆酰化、琥珀酰化、丙二酰化、羟基异丁酰化、戊二酰化和乳酸酰化34。本文展示了对特征最明确且丰度最高的组蛋白修饰——组蛋白H3和H4的甲基化与乙酰化——的分析6。然而，对于希望定量其他组蛋白翻译后修饰（PTM）的研究人员，已有包括本研究团队及其他研究团队报道的多种替代性赖氨酸及肽段N末端衍生化方案可供选择

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢来自欧洲肿瘤研究所和Carlo Besta神经学研究所的外科医生和临床医生提供了新鲜冷冻组织、OCT包埋冷冻组织以及福尔马林固定石蜡包埋组织活检样本。我们感谢Roberta Noberini在手稿撰写过程中提供的科学与方法学讨论，以及以下基金对我们研究的支持：PRIN2022（项目编号CUPG53D23001530006）、AIRC（资助号IG-2023-28767）和Fondazione IEO-Monzino（FIEORDT-2023-BONALDI）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>化学品
组织学用 Histolemon RSCarlo Erba4549122.5 L
乙腈（ACN）Carlo Erba4123411 L
碳酸氢铵 (AmBic)Sigma AldrichA6141500 g
过硫酸铵（APS）WDR1.012.010.500500 g
抑肽酶蛋白酶抑制剂Sigma Aldrich A11535 mg
Benzonase核酸酶MerkE101425 KU
30% 双丙烯酰胺 37.5 MAppliChemAPA362610001 L
缓冲液A：ddH₂O中含0.1%甲酸2O赛默飞世尔科技10229884500 mL 
缓冲液B：ddH₂O中含0.1%甲酸和80%乙腈2O赛默飞世尔科技15431423500 mL
C18 树脂默克66883-U47 mm 直径
考马斯亮蓝即用型染色液Abcamab1192111 L
二硫苏糖醇（DTT） WDR441496P25 g
乙醇Carlo Erba4146082.5 L
亮抑蛋白酶肽 蛋白酶抑制剂Sigma-Aldrich L85115 mg
N,N,N′，N′- 四甲基乙二胺（TEMED）Sigma Aldrich1.107.320100100 mL
NuPAGE LDS 样品缓冲液InvitrogenNP00074x
PBS - 磷酸盐缓冲液 MicroGemTL1006500 mL
苯基异氰酸酯（PIC）Sigma Aldrich185353100 g
苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂Sigma Aldrich P76261 g
丙酸酐（PRO）Sigma Aldrich24031150 g
重组组蛋白 H3.1 人New England BiolabsM25031 µ克/µL
测序级胰蛋白酶PromegaV5113100 μg
丁酸钠（NaBut）组蛋白去乙酰化酶抑制剂默克B58875 g
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma AldrichL3771100 g
三乙基铵碳酸氢盐Sigma AldrichT7408100 mL
三氟乙酸（TFA）赛默飞世尔科技289041×10 mL
Tris-HClSigma AldrichT3253100 g
Triton X-100 去垢剂Sigma-Aldrich X100RS5 g
<强>试剂盒/设备/软件
96孔微孔板康宁PCR-96-FS-C无热原，RNase/DNase-free
平衡克恩19024
台式离心机Hareus Biofuge 实验室Pico, 23396
Bioruptor 超声破碎仪Diagenode
Branson Digital Sonifier 250Emerson
细胞滤网 100 µmFalcon352360
浓缩仪 plusEppendorf5305000509
Dounce匀浆器（例如  邓斯，惠顿……)邓斯，惠顿1 mL 组织研磨器
EASY-nLC 1200 液相色谱系统赛默飞世尔科技
EASY-Spray HPLC C18色谱柱赛默飞世尔科技ES9022 µ米，100  Å, 75 µm × 25 cm
EpiProfile2.0 脚本https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family
Fiji 软件https://imagej.net/software/fiji/downloads
MATLABhttps://www.mathworks.com
MaxQuant 搜索引擎https://maxquant.net/maxquant/
Pestel A（松散）邓斯，惠顿
Pestel B（紧密）邓斯，惠顿
Q Exactive Plus Orbitrap 液相色谱-串联质谱系统赛默飞世尔科技
旋转轮赛默飞世尔科技11496548
手术刀Kiato13010
剪刀赛默飞世尔科技15207266
密封垫康宁AM-96-PCR-RD自动化兼容
水平转子离心机Beckman CoulterAllegra X-15R
Thermomixer compactEppendorf5350
涡旋PBIVibromix
Xcalibur 软件赛默飞世尔科技OPTON-30965

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FFPE

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