本方案可从多种临床样本中高效提取组蛋白，用于后续通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行翻译后修饰分析。通过实现对关键组蛋白修饰的可靠检测，该方法可作为大规模临床队列中全面表观遗传学分析的重要工具。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
从临床样本中提取组蛋白用于质谱法进行表观遗传学分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
大量实验证据表明，表观遗传机制在癌症的发生、发展和复发中发挥重要作用。其中，组蛋白变体及其翻译后修饰（PTMs）通过所谓的“组蛋白密码”调控染色质的结构与动态性以及基因组的可及性，从而影响转录、复制和DNA损伤修复等关键的DNA相关过程。在癌症中常可观察到失调的组蛋白PTM模式，其中一些标志物已被证实可作为诊断和预后的生物标志物。因此，开发能够在临床样本中实现无偏倚且全面的组蛋白PTM谱型分析的新方法，对于刻画肿瘤的表观遗传图谱具有重要价值。本文介绍了一种从临床样本（包括速冻组织、OCT包埋冷冻组织以及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）活检样本）中高效提取组蛋白的实验方案。该方法可获得足量且高质量的组蛋白，适用于后续基于高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的自下而上（bottom-up）分析策略。该工作流程能够对原发性肿瘤样本中的关键组蛋白修饰（特别是赖氨酸乙酰化和甲基化）进行可靠检测与定量，为癌症的分子特征分析提供了一个额外的维度。
引言
在真核细胞的细胞核中，组蛋白与DNA组装形成核小体，核小体是染色质的基本结构单位。每个核小体包含约146 bp的DNA，缠绕在一个由两份核心组蛋白H2A和H2B以及两对组蛋白H3和H4二聚体组成的八聚体上。此外，还存在一种连接组蛋白H1，它通过结合核小体及核小体之间的连接DNA片段，促进染色质的高级结构形成1。组蛋白携带多种翻译后修饰（PTMs），这些修饰主要位于其N端尾部。这些修饰包括甲基化、多种类型的酰化（如乙酰化、丙酰化、丁酰化等）、磷酸化、SUMO化、泛素化、ADP-核糖基化以及巴豆酰化等，其中赖氨酸和精氨酸的甲基化以及赖氨酸的乙酰化研究最为深入2。特定类型、位置和组合的组蛋白修饰构成了所谓的“组蛋白密码”。该密码由组蛋白N端尾部上的各种翻译后修饰（PTMs）组成，这些修饰由特异的组蛋白修饰酶进行添加或去除。随后，这些修饰被效应蛋白识别，导致染色质结构发生改变，例如压缩或去凝集，最终影响包括DNA损伤修复、复制以及特别是基因转录在内的多种生物学过程3,4。
DNA甲基化和组蛋白翻译后修饰（PTMs）是癌症中研究最为广泛的表观遗传特征之一3。近期的实验证据表明，多种癌症类型中存在多种组蛋白PTMs水平的改变。值得....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
新鲜冷冻和OCT冷冻组织活检样本来自在欧洲肿瘤研究所（米兰）接受手术的患者，并已获得患者的知情同意；而FFPE活检样本则来自在卡洛·贝斯塔神经学研究所（米兰）接受手术的患者。本研究已获得欧洲肿瘤研究所伦理委员会（研究编号UID 2550）和卡洛·贝斯塔神经学研究所伦理委员会（研究编号CET 39/24）的批准。
1. 从患者来源的组织中提取组蛋白（图1A）
注意：为分析代表性肿瘤细胞群体的组蛋白并减少样本间变异，建议使用肿瘤细胞含量至少为50%的临床活检样本，并避免含有坏死区域和/或大量免疫细胞浸润的样本。
- 从新鲜冷冻组织中富集组蛋白（预计耗时：60 分钟）
注意：所有步骤均需在冰上操作。- 将组织在冰上解冻，并切取约 20–30 mg 的组织块，通常相当于约 2 mm3 的组织体积。
- 将样本转移至 1.5 mL 离心管中，使用剪刀（材料表）将组织剪成小块。
- 加入 1 mL 核分离缓冲液（表 1），并新鲜添加 材料表 中所列的蛋白酶抑制剂，充分混匀。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们已按照上述方案，从新鲜冷冻和OCT冷冻的乳腺癌样本以及FFPE包埋的脑膜瘤样本中提取了组蛋白。如图1A所示，对于冷冻样本，我们去除了存在的OCT包埋剂，并在含有温和去垢剂（0.1% Triton，步骤1.1）的细胞核分离缓冲液中进行样本匀浆，以实现细胞核的分离。随后，我们通过添加0.1% SDS提取组蛋白；而对于FFPE样本，则进行脱蜡、复水和去交联处理，并在强变性条件下提取蛋白质（提取缓冲液含2% SDS，步骤1.3）。为评估组蛋白的产量和质量，分别取两份乳腺癌新鲜冷冻和OCT冷冻样本的核提取物的1/10，以及两份脑膜瘤FFPE样本总蛋白提取物的1/10，与1、0.5和0.25 µg的重组组蛋白H3.1（作为上样参照）一同上样，在17%聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离（图1B）。
在新鲜冷冻和OCT冷冻样本中，经过细胞核分离后，我们观察到组蛋白H2A/H2B、H3和H4相较于其他核蛋白有明显的富集。基于H3.1标准品的肉眼观察及软件辅助定量分析显.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述方法提供了一种简单且稳健的工作流程，可高效地从以新鲜冷冻、OCT冷冻和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）形式保存的临床样本中分离组蛋白，进而通过质谱分析对其修饰图谱进行表征。后续的样品制备流程采用SDS-PAGE分离及凝胶内PRO-PIC胰蛋白酶消化，可有效去除去垢剂、盐类及其他质谱干扰物33，并实现组蛋白赖氨酸乙酰化和甲基化的准确、稳健定量。重要的是，通过苯基异氰酸酯（PIC）对N端进行衍生化修饰，可增强短组蛋白肽段（如H4_20-23肽段和H3_3-8肽段）的质谱检测灵敏度17，也可用于分析较罕见的酰化修饰，如赖氨酸甲酰化、巴豆酰化、琥珀酰化、丙二酰化、羟基异丁酰化、戊二酰化和乳酸酰化34。本文展示了对特征最明确且丰度最高的组蛋白修饰——组蛋白H3和H4的甲基化与乙酰化——的分析6。然而，对于希望定量其他组蛋白翻译后修饰（PTM）的研究人员，已有包括本研究团队及其他研究团队报道的多种替代性赖氨酸及肽段N末端衍生化方案可供选择
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢来自欧洲肿瘤研究所和Carlo Besta神经学研究所的外科医生和临床医生提供了新鲜冷冻组织、OCT包埋冷冻组织以及福尔马林固定石蜡包埋组织活检样本。我们感谢Roberta Noberini在手稿撰写过程中提供的科学与方法学讨论，以及以下基金对我们研究的支持：PRIN2022（项目编号CUPG53D23001530006）、AIRC（资助号IG-2023-28767）和Fondazione IEO-Monzino（FIEORDT-2023-BONALDI）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>化学品 | |||
| 组织学用 Histolemon RS | Carlo Erba | 454912 | 2.5 L |
| 乙腈（ACN） | Carlo Erba | 412341 | 1 L |
| 碳酸氢铵 (AmBic) | Sigma Aldrich | A6141 | 500 g |
| 过硫酸铵（APS） | WDR | 1.012.010.500 | 500 g |
| 抑肽酶蛋白酶抑制剂 | Sigma Aldrich | A1153 | 5 mg |
| Benzonase核酸酶 | Merk | E1014 | 25 KU |
| 30% 双丙烯酰胺 37.5 M | AppliChem | APA36261000 | 1 L |
| 缓冲液A：ddH₂O中含0.1%甲酸2O | 赛默飞世尔科技 | 10229884 | 500 mL |
| 缓冲液B：ddH₂O中含0.1%甲酸和80%乙腈2O | 赛默飞世尔科技 | 15431423 | 500 mL |
| C18 树脂 | 默克 | 66883-U | 47 mm 直径 |
| 考马斯亮蓝即用型染色液 | Abcam | ab119211 | 1 L |
| 二硫苏糖醇（DTT） | WDR | 441496P | 25 g |
| 乙醇 | Carlo Erba | 414608 | 2.5 L |
| 亮抑蛋白酶肽 蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | L8511 | 5 mg |
| N,N,N′，N′- 四甲基乙二胺（TEMED） | Sigma Aldrich | 1.107.320100 | 100 mL |
| NuPAGE LDS 样品缓冲液 | Invitrogen | NP0007 | 4x |
| PBS - 磷酸盐缓冲液 | MicroGem | TL1006 | 500 mL |
| 苯基异氰酸酯（PIC） | Sigma Aldrich | 185353 | 100 g |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂 | Sigma Aldrich | P7626 | 1 g |
| 丙酸酐（PRO） | Sigma Aldrich | 240311 | 50 g |
| 重组组蛋白 H3.1 人 | New England Biolabs | M2503 | 1 µ克/µL |
| 测序级胰蛋白酶 | Promega | V5113 | 100 μg |
| 丁酸钠（NaBut）组蛋白去乙酰化酶抑制剂 | 默克 | B5887 | 5 g |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma Aldrich | L3771 | 100 g |
| 三乙基铵碳酸氢盐 | Sigma Aldrich | T7408 | 100 mL |
| 三氟乙酸（TFA） | 赛默飞世尔科技 | 28904 | 1×10 mL |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | 100 g |
| Triton X-100 去垢剂 | Sigma-Aldrich | X100RS | 5 g |
| <强>试剂盒/设备/软件 | |||
| 96孔微孔板 | 康宁 | PCR-96-FS-C | 无热原，RNase/DNase-free |
| 平衡 | 克恩 | 19024 | |
| 台式离心机 | Hareus Biofuge 实验室 | Pico, 23396 | |
| Bioruptor 超声破碎仪 | Diagenode | ||
| Branson Digital Sonifier 250 | Emerson | ||
| 细胞滤网 100 µm | Falcon | 352360 | |
| 浓缩仪 plus | Eppendorf | 5305000509 | |
| Dounce匀浆器（例如 邓斯，惠顿……) | 邓斯，惠顿 | 1 mL 组织研磨器 | |
| EASY-nLC 1200 液相色谱系统 | 赛默飞世尔科技 | ||
| EASY-Spray HPLC C18色谱柱 | 赛默飞世尔科技 | ES902 | 2 µ米，100 Å, 75 µm × 25 cm |
| EpiProfile2.0 脚本 | https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family | ||
| Fiji 软件 | https://imagej.net/software/fiji/downloads | ||
| MATLAB | https://www.mathworks.com | ||
| MaxQuant 搜索引擎 | https://maxquant.net/maxquant/ | ||
| Pestel A（松散） | 邓斯，惠顿 | ||
| Pestel B（紧密） | 邓斯，惠顿 | ||
| Q Exactive Plus Orbitrap 液相色谱-串联质谱系统 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 旋转轮 | 赛默飞世尔科技 | 11496548 | |
| 手术刀 | Kiato | 13010 | |
| 剪刀 | 赛默飞世尔科技 | 15207266 | |
| 密封垫 | 康宁 | AM-96-PCR-RD | 自动化兼容 |
| 水平转子离心机 | Beckman Coulter | Allegra X-15R | |
| Thermomixer compact | Eppendorf | 5350 | |
| 涡旋 | PBI | Vibromix | |
| Xcalibur 软件 | 赛默飞世尔科技 | OPTON-30965 |
参考文献
- Cutter, A. R., Hayes, J. J. A brief review of nucleosome structure. FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).
- Millan-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
