使用 LEXY 和 LINuS 光遗传学工具和自动图像分析来量化活细胞中的核质转运动力学

摘要

该协议描述了如何有效地设置和执行通过光遗传学工具跟踪核质运输获得的活细胞成像数据的自动分析。

摘要

核质转运 （NCT） 对于维持细胞稳态至关重要，其破坏与各种疾病有关，包括神经退行性疾病和肌萎缩侧索硬化症。这强调了开发监测和量化 NCT 的工具的必要性。在这些工具中，快速且可逆的光遗传学探针 LEXY（光诱导核输出系统）和 LINuS（光诱导核定位信号）允许测量活细胞中的 NCT 动力学。

原始出版物描述了在活细胞成像中转染 LEXY 和 LINuS 构建体后细胞核和胞质溶胶中荧光探针信号的手动分割和定量。然而，转染和手动分割都限制了可分析的细胞数量，并且由于潜在的用户相关错误而受到不精确性的影响。虽然光遗传学提供的高速和可逆性原则上应该允许在检测 NCT 动力学变化时具有高灵敏度，但它取决于采集参数和足够数量的细胞分析。

因此，我们建立了表达 LEXY 和 LINuS 的慢病毒载体，以创建稳定的细胞系，测试了实时成像标记物和控制条件，并实施了允许分析数百个细胞的半自动图像分析管道。这种分析方法使用开放访问软件 FIJI，适合生物信息学初学者使用，不需要高级计算机设置。在这里，我们提供了一个分步协议，将 LEXY 设置为这些光遗传学工具的示例，以监测核输出，从样品制备到活细胞成像采集和自动分析，同时演示如何使协议适应任何实验室中的其他条件、对照或模型。该方案中使用的所有质粒和细胞系都将提供给科学界，从而进一步提高该方法的可及性。

引言

核质转运 （NCT） 在调节关键细胞通路和维持细胞稳态方面的重要性在过去几年中得到了充分研究¹。因此，产生了几个工具来研究 NCT 的动力学 ^2,3,4。在这些工具中，分别于 2014 年和 2016 年发布的 LINuS⁵ 和 LEXY⁶ 光遗传学探针提供了一种监测活细胞中 NCT 的强大方法。这些工具旨在跟踪荧光报告基因的诱导输出 （LEXY） 或导入 （LINuS），可通过暴露于蓝光进行诱导并且是可逆的。

简而言之，这两个小探针利用了植物 Avena sativa⁷ 的蛋白质光促素-1 的 LOV2 结构域的特性。在没有蓝光的情况下，来自 LOV2 结构域的 Jα 螺旋被光笼并嵌入蛋白质核心。由于 Jα 螺旋可以响应光刺激，因此蓝光照射会诱导构象变化，随后 Jα 螺旋从 LOV2 结构域分离。LEXY 和 LINuS 的作者使用这种光敏性将核定位信号 （NLS） 或核输出信号 （NES） 分别融合到 LINuS 和 LEXY 的 Jα 螺旋上（图 1）。所得工具是一个探针，在蓝光照射下易位到细胞核 （LINuS） 或胞质溶胶 （LEXY） 中。

为了通过荧光成像追踪探针，还向构建体中添加了 mCherry 荧光报告基因。最后，将弱 NES（用于 LINuS）或 NLS（用于 LEXY）添加到系统中，以确保探针在蓝光照射之前不处于最终定位状态，这将阻止观察到细胞核和胞质溶胶之间的 LEXY 或 LINuS 易位。

图 1：LEXY 和 LINuS 探针的表示。 两种探针都由融合到光敏 LOV2 结构域的 mCherry 蛋白组成。这两种工具之间的区别在于 Jα 螺旋隐藏的信号序列：用于 LEXY 的 NES 和用于 LINuS 的 NLS。两种探针还具有弱信号序列来控制其初始定位：LEXY 的弱 NLS 和 LINuS 的弱 NES。因此，通过蓝光照明激活系统会导致它们被导出为 LEXY 或它们被导入 LINuS，从而允许用户监控核能的出口或进口。缩写： LEXY = 光诱导核输出系统;LINuS = 光诱导核定位信号;NLS = 核定位信号;NES = 核输出信号。 请单击此处查看此图的较大版本。

mCherry 荧光的定位报告了 LEXY 和 LINuS 探针在细胞核和胞质溶胶之间的穿梭，因此可以在活细胞成像中进行跟踪，从而允许用户监测 NCT。除了用作简单探针外，LEXY 和 LINuS 还可以用于控制定位和研究目标蛋白质，体外 5,6,8,9 或体内^10,11。

LEXY 和 LINuS 出版物中提出的定量方法显示了探针的相对核强度。建议的分析是手动完成的，并且依赖于细胞核和胞质溶胶中感兴趣区域 （ROI） 的测量。尽管这种方法可以很好地表示探针信号随时间的变化，但它非常漫长且乏味，尤其是在重复实验和条件时。重要的是，这种方法也缺乏准确性，因为只代表了设计隔室的一小部分。

在这里，我们提出了一种用于 LEXY 和 LINuS 荧光信号定量的新方案。我们实施了自动化技术，这有助于分析并提供更高的准确性。这将简化这些工具的新用户的流程，并有助于提高吞吐量。我们的定量协议只使用一个接口，即 FIJI 的开源 TrackMate¹² 插件。值得注意的是，为了提高定量的可靠性，我们使用了与实时成像兼容的远红 DNA 标记物，使用 StarDist¹³（一种经过训练的卷积神经网络）进行全细胞核分割，并使用 TrackMate¹² 跟踪和测量探针的荧光信号。

然后，可以轻松将获得的数据导出到提供的即用型电子表格（补充表 S1）中，以获得每个已识别细胞核的相对核强度。该协议还解释了如何通过将获得的时间过程曲线拟合到单指数模型（如 Yoo 和 Mitchison¹⁴ ）来将获得的值汇集到图形中，以及如何计算测试的不同条件的传输速率。使用此方案和提供的分析电子表格，即使生物信息学技能有限，用户也将能够轻松量化活细胞成像数据。

方案

注意：以下协议描述了使用 LEXY 探头监测核输出。有关要调整 LINuS 的设置的详细信息，请参见第 5 节。

1. 细胞培养

注：本节中的程序应在组织培养级通风橱中进行。使用 DMEM（或指有需要的不含酚红的 DMEM）作为培养基，补充有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素作为培养基，下面描述的步骤已针对 NIH/3T3 小鼠成纤维细胞¹⁵ 细胞系进行了优化（参见 材料表）。但是，用户可以针对其他细胞类型调整该程序。该方案适用于转染细胞或稳定细胞系。但是，我们建议创建稳定细胞系，如讨论部分所述。

1. 在无菌 1x PBS 中制备含有 23 μg/mL 胶原蛋白和 2 μg/mL 纤连蛋白的涂层溶液。向每个活成像皿中加入 800 μL 涂层溶液（参见 材料表），并在培养箱中放置 90 分钟。
2. 用无菌 1x PBS 洗涤涂层混合物，并在培养基中的活成像培养皿上接种 60,000 个细胞，以便第二天采集。
3. 如果需要，根据最适合所用细胞类型的转染方法，用 LEXY 质粒转染细胞。要遵循此方案，请以 1：5 的比例对 LEXY：空载体进行探针与空载体的共转染以提高效率。在暗箱中或用铝箔保护细胞免受光照，让它们生长一天。
4. 采集前，在不含酚红的培养基中，用与活细胞成像兼容的远红外 DNA 标记物对细胞进行染色，并确保它们在采集前完全避光。
   注意：在我们的例子中，我们使用 1 μM 的 SiR-DNA¹⁶ ，在采集前孵育至少 1 小时。
5. 为了控制输出，在收购前 1 小时将核输出抑制剂 Leptomycin B¹⁷ 以 0.5 nM（轻度输出抑制）和 1 nM（强输出抑制）应用于细胞。

2. 成像

注意：可以使用实时成像兼容的共聚焦显微镜进行采集，该显微镜能够创建选定采集的模式和脉冲 458 nm 激光照明。我们的成像是在黑暗中在共聚焦显微镜的 37 °C 腔室（含 5% CO₂）中进行共振扫描的。该设置使用 20 倍物镜进行了优化，因此允许在同一视场中同时对多个细胞进行成像。成像序列由三个阶段组成，如图 2 所示。

1. 稳定期
   1. 每 15 秒采集一次 mCherry（LEXY，561 nm 激光）和远红外（SiR-DNA，633 nm 激光）信号，并重复 10 次，总持续时间为 150 秒。确保此时既未观察到 LEXY 的漂白，也未观察到 LEXY 向胞质溶胶的易位。
      注意：在此阶段用蓝光照射系统会激活 LEXY，这将立即诱导其输出到胞质溶胶中。
2. 照明阶段
   注：此阶段由三个步骤组成，重复 15 次。
   1. 用蓝光（458 nm 激光）进行脉冲照明，以 36 ms 脉冲重复 150 次，总持续时间为 ~5 s。
   2. 执行一次 mCherry（LEXY，561 nm 激光）和远红外（SiR-DNA，633 nm 激光）荧光信号采集。
   3. 暂停 15 秒。
3. 恢复阶段
   1. 每 15 秒采集一次 mCherry（LEXY，561 nm 激光）和远红外（SiR-DNA，633 nm 激光）信号，重复 25 次，总持续时间为 375 秒。
      注意：此步骤是可选的，如果用户只想观察探测的导出而不是恢复，则可以删除此步骤。

图 2：LEXY 三个阶段的配置。 要使用 LEXY 监测细胞核输出，必须在显微镜软件上设置三个阶段。顶部表示用于 LEXY 活细胞成像采集的配置。这种配置包括一个稳定阶段，以确保信号在细胞核中稳定，一个照明阶段，诱导 LEXY 从细胞核转移到胞质溶胶，以及一个恢复阶段，以观察 LEXY 返回细胞核。图的底部表示活细胞成像的预期结果。红色表示 mCherry 的定位。灰色时，SiR-DNA 对细胞核进行染色。比例尺 = 10 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

3. LEXY 分析

注意：整个分割和跟踪分析是使用 FIJI 和 TrackMate 12 进行的，TrackMate¹² 是一个开源的斐济插件（所需版本 详见材料表）。

1. 安装 FIJI，然后下载 StarDist¹³ 和 TrackMate 插件。要安装插件，请转至 帮助 |更新 ... |管理更新站点 并勾选 CSBDeep、 StarDist 和 Trackmate-StarDist，然后单击 应用更改。重新启动斐济。
2. 虽然一些显微镜可以将每个采集阶段（稳定-照明-恢复）放在一起，但其他显微镜（例如，引用的共聚焦显微镜）可以单独保存它们。因此，如果使用此配置，另一个步骤是将阶段连接在一起：打开三个序列的图像，运行 concatenate 函数将三个延时阶段编译到一个文件中：单击 Image |堆栈 |工具 |连接....
3. 选择 稳定期 作为 Image1， 照明期 作为 Image2， 恢复期 作为 Image3。生成的图像是三个阶段延时的单个图像，其中 mCherry （通道 1）和 SiR-DNA （通道 2）通道合并。
4. 保留获取的图像以供后续分割步骤使用并保存：转到 文件 |另存为 |蒂夫....
5. 单独拆分 mCherry 通道以进行以下分析：转到 图像 |颜色 |拆分通道 并保存：转到 文件 |另存为 |蒂夫....
6. 要在采集过程中检查最终的漂白，请在 mCherry 通道上运行 Plot Z-axis Profile 命令：转到 图像 |堆栈 |绘制 Z 轴轮廓。在生成的表上，单击 Data |复制 1 ^st Data Set 并将其粘贴到该协议提供的即用型电子表格（补充表 S1）中，位于 Z 轴轮廓单元格下方。
7. 绘制一个原子核平均大小的圆形感兴趣区域 （ROI） 并保存：转到 Analyze |工具 |ROI 管理器....添加 ROI 并保存：转至 更多 |救。。。
   注意：应使用相同的 ROI 来测量所分析的所有条件的背景。
8. 在整个延时过程中，将保存的 ROI 放置在没有单元格的区域，并使用 ROI 接口功能测量该 ROI 内的平均强度。首先，通过单击 Analyze |设置 Measurements。然后，单击 更多 |多度量。勾选 测量所有 50 个切片 和 每个切片一个原始，然后单击 确定。
9. 复制粘贴提供的电子表格（补充表 S1）中显示的所有值，位于“ROI 背景”单元格下方。
10. 在斐济，关闭仅包含 mCherry 通道的图像，然后选择先前保存的具有合并的 mCherry 和 SiR-DNA 通道的图像。
11. 打开 TrackMate 插件：转到 Plugins |追踪 |TrackMate 的 TrackMate 中。
12. 检查时间点的数量是否正确（如果遵循建议的阶段，则为 0 到 49 ），然后单击 Next。
13. 选择 StarDist 检测器 ，然后单击 Next。
14. 选择 通道 2 （SiR-DNA） 对细胞核进行切片，然后单击 Next。等待几秒钟，让分段过程完成。目视检查获得的分割是否对应于细胞核的边界，然后单击 下一步 （图 3）。如果分割不准确，请记下相应的细胞核标识符 （SpotID），以将其从步骤 3.26 中的进一步分析中排除。
15. 保留默认参数，然后单击初始阈值设置窗口上的 Next。此窗口给出了 50 个时间点中分割点（细胞核）的数量。
16. 在点上设置过滤器：创建和设置过滤器：
    1. 创建两个过滤器，以 平均强度 ch1 作为参数，以去除信号太强或太弱的细胞核，这可能会使分析出现偏差：一个过滤器用于选择高于定义阈值的值，另一个用于选择低于阈值的值。定义该值以仅删除非常低或饱和的信号。
       注意：如果使用稳定细胞系，则可能不需要这些过滤器。请注意这些值，因为它们需要重新应用于所有条件。
    2. 创建两个过滤器 Area 以从分析中删除不需要的对象（碎片、垂死或分裂的细胞）：一个过滤器用于选择高于定义阈值的值，另一个用于选择低于阈值的值。单击 Next（下一步）。
       注意：对所有条件重新应用这些值。
17. 选择跟踪链接：选择 Simple LAP tracker 并点击 Next。
18. 选择跟踪的参数。调整 Linking max distance （此处为 30 μm） - 允许在帧之间链接到对象的最大距离。使用 Gap-closing max distance （此处为 15 μm）和 Gap closing max frame gap （此处为 3）来定义在不排除同一轨迹的情况下可以省略单个轨迹的多少个点。单击 Next （图 3）。
    注意：这些提议的参数使用试错法针对我们的设置和细胞模型进行了优化，可能需要通过实验进行调整。
    需要调整连接最大距离，以防止从一个细胞核到另一个细胞核的跑偏，尤其是在细胞移动很多的情况下。
19. 计算后，单击 Next 并在轨道上设置过滤器。要仅选择在整个时间过程中（建议序列的 50 个时间点）跟踪的细胞核，请选择轨迹中最高的点数（将光标放在建议序列 的 49 个以上 ）。单击 Next（下一步）。
    注意：这将有助于分析，但只有在整个时间过程中跟踪了足够的原子核时才有可能，如果没有：请参阅讨论。
20. 显示选项：勾选 Display spot names（显示光斑名称 ），以便能够在进一步的分析中回溯每个原子核。根据用户的偏好自定义显示的功能。
21. 在页面底部，单击 Tracks |导出为 CSV 以保存包含所有测量值的表格。关闭表，然后单击 Next。
22. （可选）以 T（时间） 作为 X 轴 ，以 ch1 的平均强度 作为 Y 轴绘制轨迹特征。单击 Plot features。关闭图表，然后单击 Next（ 下一步）。
    注意：这将使用户了解导出的一般趋势。此时，它不会归一化为背景和初始强度。
23. 单击 Capture overlay as action（ 捕获叠加 作为作），然后单击 Execute |好的。生成的图像将用于识别量化的原子核。保存：转到 File |另存为 |蒂夫....
24. 在电子表格文件中，导入使用TrackMate获取的CSV文件：在 数据 选项卡的 获取和转换数据 组中，点击 从文本/CSV 并 导入。
25. 通过单击相应的字母选择以下四列，然后将它们复制并粘贴到提供的电子表格（补充表 S1）的顶部，列 A 到 D，背景为：点 ID （B）、轨迹 ID （C）、帧 （I）、平均强度 ch1 （M）。
    注意：确保粘贴的度量的开头从 补充表 S1 的第 6 行开始。如果不是这种情况，则测量值可能会从一个或多个单元格中偏移，因此是不正确的。请参阅 补充表 S2 的电子表格，以获取预期处置的示例。
26. 首先通过单击单元格 B5 中的箭头按 TrackID（单个核）和 Frame （time point） 通过单击单元格 C5 中的箭头按字母顺序对结果进行排序。
27. 要去除背景噪声，请从平均强度 ch1 中获得的每个值中减去步骤 3.8 中获得的值（在提供的电子表格中预先计算，参见 补充表 S1）。
28. 要归一化 LEXY 的信号，请计算稳定相（第 0 帧到第 9 帧）中 mCherry 荧光信号的平均强度。然后，将平均强度 ch1 中获得的所有结果除以稳定相的平均强度（在提供的电子表格中预先计算，参见 补充表 S1）。
    注：获得的数字是 LEXY 的平均核荧光强度。所有测度都已由 L 列中的原子核显示，并且可以绘制在图形中。

图 3：使用 FIJI 的 TrackMate 分析。 顶部是 TrackMate 分析的示意图，底部是从 FIJI 分析中获得的图像。左侧的第一个图为灰色显示了未分割的 SiR-DNA 染色，这是细胞核的标志物。第二个面板表示 Stardist 使用 SiR-DNA 通道执行的自动分割。根据 mCherry 通道的强度对细胞核进行着色，以方便可视化和最后一步。第三个面板显示了通过在整个活细胞成像序列的时间点跟踪 SiR-DNA 染色获得的轨迹。右侧的最后一个面板显示了 LEXY 的荧光信号，以红色显示，位于分割定义的区域，将针对每个时间点进行测量。比例尺 = 50 μm 请单击此处查看此图的较大版本。

4. 运输费率、统计数据和数据

1. 绘制相对核强度图。
   1. 打开 GraphPadPrism 并创建一个工作表：单击输入或将数据导入到新表中，然后在选项中为 X 选择经过的时间，并为 Y 的并排子列中的重复值选择最大分割核数。单击 Create 并将获取的数据粘贴到表中。
   2. 对于 X 值 （时间），如果按建议保留购置参数，请复制并粘贴所提供电子表格中“时间”下的列。否则，请根据使用的参数调整值。
   3. 要创建相对核强度的图形，请转到 Graphs （图形） 部分。选择 XY 作为 图形系列，选择 点和带有误差线的连接线 作为 图形类型。
   4. 在 Plot （绘图 ） 部分中，选择 Mean （平均值）、Error （误差） 和 SEM （SEM ），然后单击 OK （ 确定 ） 查看图形。根据所选参数更改比例和视觉效果。
2. 将相对核强度拟合为单指数模型。
   1. 在 Data Table 部分，单击 New Data Table。
      1. 选择 Enter X values as X 和 Enter 并将每个点的单个 Y 值绘制 为 Y，然后单击 Create。
      2. 在 X 列中，仅以小数形式报告稳定阶段和照明阶段的时间;如果保留了建议的采集参数，请复制并粘贴提供的电子表格（ 补充表 S1）中“十进制时间”下的列。
      3. 将作为 相对核强度 获得的值粘贴到表中，仅适用于稳定期和照明期。
      4. 在结果 部分中，选择以下分析：XY 分析 |指数 |Nonlinear Regression （Curve Fit） 并单击 OK。
      5. 在参数中，选择高原后跟一个相位衰减作为模型，在约束参数中，选择一个等于 2.25 的常数作为 X0（照明的开始时间），一个等于 1 的常数作为 Y0（照明开始时的相对核强度），一个等于 0 的常数作为高原（相对核强度应依赖的值）， ，并指示 K（导出速率）应大于 0。将其他参数保留为默认值。点击 OK。
      6. 在 Results （结果 ） 部分中，K 行表示测试条件的核的所有导出速率。
      7. 如果需要，对其他条件重复 步骤 4.2.1 到 4.2.1.5 。
3. 创建导出速率图。
   1. 创建一个新表格：选择 Enter X values as X 和 Enter 并将每个点的单个 Y 值绘制 为 Y，然后单击 create。
   2. 对于每个条件（在列中），粘贴并转置在上一步中获得的 K 值。
   3. 要创建导出率的图形，请转到 图形 部分，选择列作为图形系列，然后在 盒子和小提琴 部分中，选择 小提琴图 作为图形类型，带有 小提琴图 。将所有点显示为 plot。单击 OK 查看图表。如果需要，自定义表示数据的方式。
   4. 要对导出率运行统计检验，请按照以下步骤执行双侧 Welch's t 检验，如 Yoo 和 Mitchison¹⁴ 中所述：
      1. 在包含所有条件的导出率的表中，单击 Analyze |组比较 |T 检验（和非参数检验），选择要检验的条件，然后单击确定。勾选 Unpaired， Yes use parametric test， 和 Unpaired t test with Welch's correction。不要假设 SD 相等，然后单击 OK。
   5. 观察 Results 部分表中的分析结果，并根据需要报告导出速率图。

5. LINuS 的调整

注意：通过应用以下更改，可以轻松调整上述协议以使用 LINuS 监控核导入。

1. 细胞培养
   1. 在步骤 1.5 中代替钩托霉素 B，使用进口唑¹⁸ 作为核抑制剂，浓度为 10 μM，在采集前 1 小时。
2. 成像
   1. 为了实现系统的最佳导入，在步骤 2.2.1 中用 458 nm 激光器将 36 ms 照明脉冲的 150 次重复替换为 250 次重复，总持续时间为 ~9 s。
      注意：序列时间可能取决于细胞类型，并且两种探针的参数可能需要调整以达到最佳状态，因为系统依赖于 NLS 和 NES 的识别，它们是细胞类型特异性的^19,20。
3. 运输速率、统计数据和数据
   1. 在步骤 4.2.1.5 中，不要将曲线拟合到 Plateau，然后进行一个相位衰减，而是选择 Plateau 后跟一个相关联 分析。
   2. 将 X0 限制为 2.25， 将 Y0 限制为 1，并且 K （LINuS 情况下的导入速率） 大于 0。
      注意：LINuS 使用 TrackMate 的分析与 LEXY 的相同。相对核强度仍然是测量和分析的值，但不应观察到由于探针的出口而降低，而是应该观察到蓝光照射后细胞核中荧光信号的富集。

结果

上述协议应允许用户在活细胞成像采集过程中可视化探针的定位和易位。 图 4 显示了使用 LEXY 可视化核输出的预期图像示例。在几轮蓝光照射后，应观察到来自细胞核的信号迅速减弱和胞质溶胶的富集。停止照明循环后，可以看到探头信号的逐渐恢复。为了控制系统，输出抑制剂 Leptomycin B 证明，输出的变化可以通过分析可视化，因为它可以防止 LEXY 在蓝光照射下输出（图 4）。

图 4：LEXY 信号随时间变化的可视化。 通过活细胞成像捕获稳定、照明和恢复阶段的代表性时间点。甲醇条件表示控制条件。在脉冲蓝光照射下，红色表示 LEXY 位置的报告基因 mCherry 荧光信号从细胞核转移到胞质溶胶。停止照明后，信号在原子核中恢复。用 1 nM 或 0.5 nM 的出口抑制剂 Leptomycin B 处理表明，当出口受阻时，LEXY 的出口不存在或减少。比例尺 = 30 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

关于分析，虽然稳定阶段的相对核强度曲线的值应该在 1 左右，但在蓝光激活后，它们应该表现出缓慢的下降，直到在照明阶段结束时达到平台期（图 5A）。如果下降太快或太慢，则可以优化采集参数（参见讨论）。足够浓度的钩端霉素 B 处理也可以确认分析和技术足够敏感，以表明核输出被完全阻断，在整个实验中相对核强度值稳定在 1 左右。然而，中等 Leptomycin B 浓度应显示温和的核输出（图 5A）。这些目视观察结果应通过确定出口率进行定量确认（图 5B）。

图 5：LEXY 的预期相对核强度和传输速率。 （A） 该图表示 LEXY 荧光信号随时间变化的相对核强度，归一化为稳定相的 mCherry 平均强度。与用浓度为 0.5 nM（浅蓝色）或 1 nM（深蓝色）的出口抑制剂 Leptomycin B 处理的细胞相比，甲醇（对照，红色）条件的相对核强度在光照后降低了一半。误差线：SEM。（B） 对照和莱托霉素 B 条件的导出率，通过将曲线拟合到单指数模型获得。Leptomycin B 阻止输出时获得的值明显低于控制条件。N = 18 个甲醇细胞（红色），19 个细胞用于 Leptomycin B 0.5 nM（浅蓝色），15 个细胞用于 Leptomycin B 1 nM（深蓝色）。P 值通过双侧 Welch's t 检验计算。： P < 1×10⁻⁴， ****： P < 1×10⁻⁵. 请单击此处查看此图的较大版本。

补充表 S1：具有预定义计算的电子表格。 提供此电子表格是为了方便分析。使用 TrackMate 获得的强度值可以直接复制并粘贴到电子表格中，以获得标准化的相对核强度值。 请点击此处下载此文件。

补充表 S2：LEXY 分析的控制条件的预期结果示例。 该电子表格代表了 LEXY 稳定细胞系的控制条件所获得值的示例。 请点击此处下载此文件。

讨论

如方案中所述，稳定细胞系的创建大大提高了分析质量。首先，让 100% 的细胞表达探针增加了跟踪和分析的细胞核数量，从而增强了分析的稳健性。其次，它减少了由探针过表达和所用转染试剂的毒性诱导的细胞死亡。最后，它降低了细胞间荧光信号的强烈异质性。这个参数很重要，因为饱和信号不允许正确检测照明后的强度变化。同样的结论也适用于弱信号，它可能会漂白或不允许量化差异。因此，我们建议首先通过转染测试探针以确保它们正常工作，设置采集参数，然后快速创建稳定的细胞系。我们创建了用于 LEXY 和 LINuS 探针的慢病毒载体，可根据要求共享，以及使用这些慢病毒创建的 NIH/3T3 LEXY 或 LINuS 稳定细胞系。

如果探针被转染或细胞稀疏，则建议的参数可能会减少检测到的轨迹数量，并且分析将不那么可靠。如果是这种情况，用户可以通过减少过滤器 Track 中的点数 （Number of spots in track） （建议在 50 个点中至少保留 45 个） 来更宽容地处理跟踪中省略的点。注意：如果此过滤器减少，则应手动调整提供的 Excel 文件（补充表 S1）：实际上，从导入的 CSV 粘贴的值不会考虑间隙。用户需要使用 TrackID 编号找到缺失点的位置，并将它们与核编号相关联，这通常需要几轮复制粘贴。

保证实验成功的一个关键参数是将细胞置于黑暗中。由于探针会对蓝光产生反应，因此用户必须确保在采集前将细胞在黑暗中运输至少 30 分钟。一个小的封闭盒子或使用铝盖住盘子就足够了。同样，必须非常小心，仅使用 mCherry 光在显微镜上搜索细胞，因为蓝光照射会激活细胞。如果最终在显微镜下发生照明，请搜索另一个遥远的视场进行采集。在步骤 3.6 中绘制 Z 轴轮廓将有助于了解细胞是否受到照明的影响，曲线是否正在下降而不是处于稳定状态。

成像序列设置为由三个阶段组成。首先是稳定相，用于评估潜在的漂白，但也要确保 LEXY 的定位稳定而不被激活 （1）。其次，激活阶段，由多轮脉冲蓝光照明组成，诱导 LEXY 从胞核转位到胞质溶胶 （2）。最后是可选的恢复阶段，此时信号逐渐返回到其在原子核中的初始位置 （3）。

为采集描述的序列可以是细胞类型特异性的^19,20。对于第一个实验，用户应测试并修改激光功率和时间，以查看系统在细胞核和胞质溶胶之间逐渐移位。重要的是，激光功率太强，因为停顿太短，可能会阻止看到进行性易位，而是在照明后 mCherry 强度的残酷下降/富集（取决于使用的探针）。

如果序列的优化不能解决问题，则 NES 和/或 NLS 可能不适合所使用的细胞类型。用户可以参考 LINuS 方法文章⁸ 来设计和修改探针。用户还可以参考本文，了解如何使用落射荧光显微镜对 LINuS 进行成像。

细胞核分割是分析的关键步骤。应使用坚固可靠的核标记物进行探针的活细胞成像。由于蓝光照射会激活探针的易位，并且由于探针是用 mCherry 荧光蛋白监测的，因此该标记物必须在远红光谱中可见或接近。在我们的例子中，我们使用 SiR-DNA 在孵育 1 至 ~24 小时内对细胞进行染色，但使用 SPY-DNA 650 也是一种选择（参考文献见材料表）。

最后，如果使用 StarDist 进行分割，结合 TrackMate 的过滤跟踪，证明了它的效率，那么需要注意的是，用户应该始终目视检查分割和量化的结果。分裂或垂死的细胞可能包括在定量中，而它不应该。为了降低分析此类事件的风险，提供的 Excel 工作表将颜色代码分配给相对核强度（蓝色 = 低值，红色 = 高值）。通过在 GraphPad Prism 中绘制值之前检查颜色，用户应该能够注意到任何异常值。例如，LEXY 的相对核强度应从稳定阶段的高（红色，原子核中探针的量很大）到照明阶段结束时的低（蓝色，原子核中探针的量减少）变化，然后在恢复阶段回到高值（红色），在恢复阶段（如 补充表 S2 所示）。

与以前提出的方法相比，该协议具有各种优势 ^5,6。半自动管道有助于分析 LEXY 和 LINuS 核质转运，并且比以前提出的手动定量更准确 ^5,6。使用我们的协议将使该领域的初学者能够进行有效的分析，但也为有经验的用户提供了一种新工具，他们只需要一个开放访问界面即可对核质运输进行半自动分析。

该方法可用于 NIH3T3 细胞系中整体核质转运速率的研究以外的进一步应用。事实上，通过一些优化步骤，它可以适应研究探针在各种细胞类型或活体动物中的转运速率⁸。此外，通过将感兴趣的蛋白质与 LEXY 或 LINuS 融合，还可以研究其转运速率或其光诱导转位进出细胞核的下游效应。例如，可以用 LEXY 将蛋白质隔离在细胞质中，或者用 LINuS 5,6,21,22,23 强制其定位到细胞核中。最后，所描述的分析也可以扩展到比 LEXY 和 LINuS 更多的应用，以跟踪在可分割的亚细胞区室之间易位的任何信号。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原	西格玛-奥尔德里奇	08-115
共聚焦显微镜	徕卡	SP8
DMEM的	吉布科	31966021
胜过	Microsoft
FBS的	西格玛-奥尔德里奇	F7524
纤连蛋白	西格玛-奥尔德里奇	F1141型
斐济软件	斐济		图像J 2.16.0/1,54p;Java1.8.0_322
氟类	杜彻	FD3510-100型	替代方案：Attofluor 室 （Invitrogen #A7816）
GraphPad 棱镜 10.4.1	GraphPad 软件公司
进口唑	西格玛-奥尔德里奇	SML0341
钩霉素B	西格玛-奥尔德里奇	L2913型
LEXY质粒	阿德基因	72655	pDN122
LINuS 质粒	阿德基因	61347	pDN77
Pencillin-链霉素	吉布科	15140-122
不含酚红DMEM	吉布科	21063-029
SiR-DNA	螺色素	SC007	替代品：SPY-DNA650（螺色素 #SC501）
Stardist 2D 插件	星际区		StarDist_0.3.0
TrackMate 插件	跟踪伴侣		轨迹伴侣-7.14.0