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利用 LEXY 和 LINuS 光遗传学工具及自动化图像分析定量活细胞中核质运输动态

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DOI：

10.3791/68585

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2025年7月22日

 , 
1Institut de Génétique Humaine (IGH), Université de Montpellier, CNRS, UMR9002

本文内容

摘要

本方案描述了如何高效地建立并执行活细胞成像数据的自动化分析，这些数据是通过光遗传学工具追踪核质运输获得的。

摘要

核质运输（NCT）对于维持细胞稳态至关重要，其功能障碍与多种疾病相关，包括神经退行性疾病和肌萎缩侧索硬化症。这凸显了开发用于监测和量化 NCT 的工具的必要性。在这些工具中，快速且可逆的光遗传学探针 LEXY（光诱导核输出系统）和 LINuS（光诱导核定位信号）能够实现活细胞中 NCT 动态过程的测量。

原始文献描述了在活细胞成像中转染LEXY和LINuS构建体后，对细胞核和细胞质中荧光探针信号进行手动分割和定量分析。然而，转染过程和手动分割均限制了可分析细胞的数量，并可能因操作者依赖性误差而引入不精确性。尽管光遗传学所提供的高速度和可逆性理论上应能实现对核质运输（NCT）动态变化的高灵敏度检测，但其效果仍依赖于采集参数以及足够数量细胞的分析。

因此，我们构建了表达 LEXY 和 LINuS 的慢病毒载体，以建立稳定的细胞系，测试了活细胞成像标记物和对照条件，并建立了一条半自动化的图像分析流程，可实现对数百个细胞的分析。该分析方法采用开源软件 FIJI，对生物信息学初学者友好，且无需复杂的计算机配置。本文提供了一步一步的操作方案，以 LEXY 为例展示如何使用这类光遗传学工具监测核输出，涵盖从样本制备、活细胞成像采集到自动化分析的全过程，同时说明如何在任何实验室中针对其他实验条件、对照或模型对方案进行调整。本方案中使用的所有质粒和细胞系都将向科学界公开，从而进一步提升该方法的可及性。

引言

近年来，核质运输（NCT）在调控关键细胞通路和维持细胞稳态中的重要性已被广泛研究1。因此，已开发出多种工具用于研究NCT的动态过程2,3,4。其中，分别于2014年和2016年发表的光遗传探针LINuS5和LEXY6，为在活细胞中监测NCT提供了强有力的方法。这些工具可分别用于追踪荧光报告蛋白的可诱导出核（LEXY）或入核（LINuS）过程，其调控依赖于蓝光照射，并具有可逆性。

简而言之，这两种小型探针利用了植物Avena sativa光敏蛋白-1中LOV2结构域的特性7。在无蓝光条件下，LOV2结构域的Jα螺旋处于光封闭状态并嵌入蛋白核心中。由于Jα螺旋可响应光刺激，蓝光照射会诱导其发生构象变化，从而导致Jα螺旋从LOV2结构域解离。LEXY和LINuS的作者利用这种光敏感性，分别将核定位信号（NLS）或核输出信号（NES）融合至Jα螺旋上（图1）。由此构建的探针可在蓝光照射下转入细胞核（LINuS）或细胞质（LEXY）。

为了通过荧光成像追踪探针，还在构建体中加入了mCherry荧光报告蛋白。最后，系统中添加了一个弱的核输出信号（NES，用于LINuS）或核定位信号（NLS，用于LEXY），以确保探针在蓝光照射前未处于最终的定位状态，从而避免无法观察到LEXY或LINuS在细胞核与细胞质之间的转位过程。

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图1：LEXY 和 LINuS 探针的示意图。两种探针均由 mCherry 蛋白与光敏感的 LOV2 结构域融合而成。两者之间的差异在于被 Jα 螺旋隐藏的信号序列：LEXY 含有核输出信号（NES），而 LINuS 含有核定位信号（NLS）。此外，两种探针均具有一个弱信号序列以控制其初始定位：LEXY 含有一个弱 NLS，而 LINuS 含有一个弱 NES。因此，通过蓝光照射激活系统后，可分别诱导 LEXY 的核输出或 LINuS 的核输入，从而允许研究人员监测核输出或核输入过程。缩写：LEXY = 光诱导核输出系统；LINuS = 光诱导核定位信号；NLS = 核定位信号；NES = 核输出信号。 请点击此处查看该图的放大版本。

mCherry荧光的定位可报告LEXY和LINuS探针在细胞核与细胞质之间的穿梭，因此可在活细胞成像中进行追踪，使用户能够监测核质运输（NCT）。除了作为简单的探针使用外，LEXY和LINuS还可被改造以调控目标蛋白的定位并对其进行研究。 体外5,6,8,9 或 体内10,11.

LEXY和LINuS出版物中提出的定量方法显示了探针的相对核强度。建议的分析需手动完成，依赖于对细胞核和细胞质中感兴趣区域（ROI）的测量。尽管该方法能够较好地反映探针信号随时间的变化，但过程非常耗时且繁琐，尤其是在重复进行实验和不同条件测试时。更重要的是，该方法的准确性有限，因为仅反映了所设计区室的一小部分。

本文提出了一种用于LEXY和LINuS荧光信号定量的新方案。我们采用了自动化技术，可简化分析过程并提高定量准确性。该方案将有助于新用户更便捷地使用这些工具，并提升实验通量。我们的定量方案仅使用一个界面，即开源软件FIJI中的TrackMate12插件。值得注意的是，为提高定量结果的可靠性，我们使用了一种适用于活体成像的远红光DNA标记物，结合经过训练的卷积神经网络StarDist13实现全细胞核分割，并利用TrackMate12对探针的荧光信号进行追踪和测量。

随后，可轻松将获得的数据导出至提供的即用型电子表格（补充表 S1），以计算每个已识别细胞核的相对核强度。本方案还说明了如何通过将获得的时间进程曲线拟合为单指数模型（如 Yoo 和 Mitchison14 所述），将所得数值汇总成图，并计算不同实验条件下物质的转运速率。借助本方案及所提供的分析用电子表格，即使不具备丰富的生物信息学技能，用户也能轻松定量分析活细胞成像数据。

方案

注意：以下方案描述了使用 LEXY 探针监测核输出的过程。有关针对 LINuS 调整设置的详细信息见第 5 节。

1. 细胞培养

注意：本节中的操作应在组织培养级生物安全柜中进行。以下步骤已针对 NIH/3T3 小鼠成纤维细胞系进行优化15，培养基为添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM（如特别注明，则使用无酚红 DMEM）（参见材料表）。然而，用户可根据需要将该操作流程调整用于其他细胞类型。本方案适用于转染细胞或稳定细胞系，但我们建议如讨论部分所述，构建稳定细胞系。

  1. 在无菌 1x PBS 中配制含 23 µg/mL 胶原蛋白和 2 µg/mL 纤连蛋白的包被溶液。每孔活细胞成像培养皿中加入 800 µL 包被溶液（参见材料表），于培养箱中孵育 90 分钟。
  2. 用无菌 1x PBS 洗去包被液，将 60,000 个细胞接种至活细胞成像培养皿中，并加入培养基，用于次日的图像采集。
  3. 如有需要，根据最适合所用细胞类型的转染方法，将细胞转染 LEXY 质粒。为遵循本方案，应将探针与空载体共转染以提高转染效率，LEXY 与空载体的比例为 1:5。用避光盒或铝箔将细胞避光保护，并继续培养一天。
  4. 图像采集前，在不含酚红的培养基中使用远红荧光 DNA 标记物对细胞进行染色，并确保细胞在采集前始终完全避光。
    注意：本实验中，我们使用 1 µM 的 SiR-DNA16，染色时间至少为 1 小时。
  5. 为控制核输出，可在图像采集前 1 小时向细胞中加入核输出抑制剂 Leptomycin B17，浓度分别为 0.5 nM（轻度抑制输出）和 1 nM（强效抑制输出）。

2. 成像

注意：可使用兼容活体成像的共聚焦显微镜进行图像采集，该显微镜需具备设定特定采集模式以及脉冲式458 nm激光照明的功能。我们的成像在共聚焦显微镜的37 °C培养环境（含5% CO2）中避光进行，显微镜配备共振扫描装置。系统采用20倍物镜进行优化，因而可在同一视野中同时对多个细胞进行成像。成像序列包含三个阶段，如图2所示。

  1. 稳定阶段
    1. 每15秒进行一次mCherry（LEXY，561 nm激光）和远红光（SiR-DNA，633 nm激光）信号的采集，重复10次，总时长为150秒。确保在此阶段未观察到光漂白或LEXY向细胞质的转位。
      警告：在此阶段若用蓝光照射系统，将激活LEXY，导致其立即被输出至细胞质。
  2. 照射阶段
    注意：此阶段包含三个步骤，重复15次。
    1. 使用蓝光（458 nm激光）进行脉冲式照射，每次脉冲持续36 ms，重复150次，总时长约5秒。
    2. 进行一次mCherry（LEXY，561 nm激光）和远红光（SiR-DNA，633 nm激光）荧光信号的采集。
    3. 暂停15秒。
  3. 恢复阶段
    1. 每15秒进行一次mCherry（LEXY，561 nm激光）和远红光（SiR-DNA，633 nm激光）信号的采集，重复25次，总时长为375秒。
      注意：此步骤为可选，若用户仅需观察探针的输出而无需观察恢复过程，可省略此步骤。

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图2：LEXY 实验的三个阶段配置。 为利用 LEXY 监测核输出，需在显微镜软件中设置三个阶段。上半部分展示了 LEXY 活细胞成像采集所用的配置，该配置包括一个稳定阶段，以确保信号在细胞核内保持稳定；一个光照阶段，以诱导 LEXY 从细胞核向细胞质转位；以及一个恢复阶段，用于观察 LEXY 重新回到细胞核的过程。图的下半部分展示了活细胞成像的预期结果。红色信号 mCherry 指示 LEXY 的定位，灰色信号 SiR-DNA 对细胞核进行染色。比例尺 = 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

3. LEXY 分析

注意：整个分割与追踪分析均使用 FIJI 及其开源插件 TrackMate12 完成（所需版本详见材料表）。

  1. 安装FIJI，随后下载StarDist13 及 TrackMate 插件。要安装插件，请前往 Help | Update … | Manage Update Sites and tick CSBDeep, StarDist, and Trackmate-StarDist然后点击 Apply changes. Restart Fiji.
  2. 部分显微镜能够同时采集每个成像阶段（稳定-照明-恢复），而另一些显微镜（例如，本文引用的共聚焦显微镜）则会分别保存这些阶段。因此，若使用此类配置，需增加一个步骤，即将各阶段图像拼接在一起：打开三个序列的图像，运行 concatenate 将三个延时阶段编译至单个文件的功能：点击 Image | Stacks | Tools | Concatenate….
  3. 选择 stable phase as Image1安装 FIJI 软件，然后下载 StarDist 13 和 TrackMate 插件。安装插件时，请前往 帮助 | 更新… | 管理更新站点，勾选 CSBDeep、StarDist 和 Trackmate-StarDist，然后点击 应用更改。重启 Fiji。部分显微镜可将每个采集阶段（稳定-照明-恢复）一并拍摄，而其他显微镜（例如，所提及的共聚焦显微镜）则会分别保存各阶段。因此，若使用此类配置，需增加一个步骤，即将各阶段拼接在一起：打开三个序列的图像，运行 拼接 功能，将三个延时阶段编译至单个文件中：点击 图像 | 堆栈 | 工具 | 拼接…。选择 稳定阶段 作为 图像1，照明阶段 作为 图像2，恢复阶段 作为 图像3。生成的图像是包含三个阶段延时的单一图像，其中 mCherry（通道 1）和 SiR-DNA（通道 2）通道已合并。保留所得图像用于后续分割步骤并保存：前往 文件 | 另存为 | Tiff…。为进行后续分析，单独拆分 mCherry 通道：前往 图像 | 颜色 | 拆分通道 并保存：前往 文件 | 另存为 | Tiff…。为检查采集过程中可能发生的荧光淬灭，在 mCherry 通道上运行 绘制 Z 轴剖面 命令：前往 图像 | 堆栈 | 绘制 Z 轴剖面。在生成的表格中，点击 数据 | 复制第 1 个数据集 并将其粘贴到本方案附带的即用电子表格（补充表 S1）中 Z 轴剖面单元格下方。绘制一个平均细胞核大小的圆形感兴趣区域（ROI）并保存：前往 分析 | 工具 | ROI 管理器…。添加 ROI 并保存：前往 更多 | 保存… 注意：所有分析条件中测量背景时应使用同一 ROI。将保存的 ROI 置于整个延时过程中均无细胞的区域，并使用 ROI 界面功能测量该 ROI 内的平均强度。首先，通过点击 分析 | 设置测量 确保已勾选平均灰度值。然后，点击 更多 | 多重测量。勾选 测量所有 50 个切片 和 每切片一行，然后点击 确定。将所有显示的值复制粘贴到提供的电子表格（补充表 S1）中“ROI 背景”单元格下方。在 Fiji 中，关闭仅含 mCherry 通道的图像，选择先前保存的合并了 mCherry 和 SiR-DNA 通道的图像。打开 TrackMate 插件：前往 插件 | 追踪 | TrackMate。确认时间点数量正确（若遵循建议的阶段，应为 0 至 49），然后点击 下一步。选择 StarDist 检测器 并点击 下一步。选择 通道 2（SiR-DNA） 以分割细胞核，然后点击 下一步。等待几秒钟直至分割过程完成。目视检查所得分割是否与细胞核边界对应，然后点击 下一步（图 3）。若分割不准确，请记下相应的细胞核标识符（SpotID），以便在步骤 3.26 中将其从后续分析中排除。保留默认参数，在 初始阈值设置 窗口点击 下一步。此窗口显示 50 个时间点中分割出的斑点（细胞核）数量。设置斑点过滤器：创建并设置过滤器： 创建两个以 通道 1 平均强度 为参数的过滤器，以去除信号过强或过弱的细胞核，这些可能影响分析：一个过滤器用于选择高于设定阈值的值，另一个用于选择低于阈值的值。设定阈值以仅去除极低或饱和的信号。 注意：若使用稳定细胞系，可能无需这些过滤器。请记录这些值，因为所有条件均需重新应用。创建两个 面积 过滤器，以从分析中去除不需要的物体（碎片、死亡或分裂细胞）：一个过滤器用于选择高于设定阈值的值，另一个用于选择低于阈值的值。 illumination phase as Image2安装 FIJI 软件，随后下载 StarDist 13 和 TrackMate 插件。安装插件时，请依次点击 帮助 | 更新… | 管理更新站点，勾选 CSBDeep、StarDist 和 Trackmate-StarDist，然后点击 应用更改。重启 Fiji。部分显微镜可将每个采集阶段（稳定-照明-恢复）一并采集，而其他显微镜（例如，所提及的共聚焦显微镜）则会分别保存各阶段。因此，若使用此类配置，需额外执行一个步骤，即将各阶段图像拼接在一起：打开三个序列的图像，运行 拼接 功能，将三个延时阶段编译至单个文件中：依次点击 图像 | 堆栈 | 工具 | 拼接…。选择 稳定阶段 作为 图像1，照明阶段 作为 图像2，恢复阶段 作为 图像3。所得图像为包含三个阶段的延时序列的单一图像，其中 mCherry（通道 1）和 SiR-DNA（通道 2）通道已合并。保留此图像用于后续分割步骤，并保存：依次点击 文件 | 另存为 | Tiff…。为进行后续分析，单独拆分 mCherry 通道：依次点击 图像 | 颜色 | 拆分通道，并保存：依次点击 文件 | 另存为 | Tiff…。为检查采集过程中是否发生光漂白，请在 mCherry 通道上运行 绘制 Z 轴剖面 命令：依次点击 图像 | 堆栈 | 绘制 Z 轴剖面。在生成的表格中，点击 数据 | 复制第 1 个数据集，并将其粘贴至本方案提供的现成电子表格（补充表 S1）中 Z 轴剖面单元格下方。绘制一个平均细胞核大小的圆形感兴趣区域（ROI）并保存：依次点击 分析 | 工具 | ROI 管理器…。添加该 ROI 并保存：依次点击 更多 | 保存…。 注意：分析所有条件时，应使用同一 ROI 测量背景。将保存的 ROI 置于整个延时序列中均无细胞的区域，并使用 ROI 界面功能测量该 ROI 内的平均强度。首先，通过点击 分析 | 设置测量 确保已勾选平均灰度值。然后，点击 更多 | 多重测量。勾选 测量所有 50 个切片 和 每切片一行，并点击 确定。将所有显示的值复制粘贴至提供的电子表格（补充表 S1）中“ROI 背景”单元格下方。在 Fiji 中，关闭仅含 mCherry 通道的图像，选择先前保存的合并了 mCherry 和 SiR-DNA 通道的图像。打开 TrackMate 插件：依次点击 插件 | 追踪 | TrackMate。确认时间点数量正确（若遵循建议的阶段设置，应为 0 至 49），然后点击 下一步。选择 StarDist 检测器，点击 下一步。选择 通道 2（SiR-DNA）以分割细胞核，点击 下一步。等待数秒直至分割过程完成。目视检查所得分割结果是否与细胞核边界相符，然后点击 下一步（图 3）。若分割不准确，请记录相应的细胞核标识符（SpotID），以便在步骤 3.26 中将其从后续分析中排除。在 初始阈值设置 窗口中保留默认参数，点击 下一步。此窗口显示 50 个时间点中分割出的斑点（细胞核）数量。设置斑点过滤器：创建并设置过滤器： 创建两个以 通道 1 平均强度 为参数的过滤器，以去除信号过强或过弱的细胞核，这些细胞核可能导致分析偏差：一个过滤器用于选择高于设定阈值的值，另一个用于选择低于阈值的值。设定阈值，仅去除极低或饱和的信号。 注意：若使用稳定细胞系，可能无需这些过滤器。请记录这些值，因为所有条件均需重新应用。创建两个 面积 过滤器，以从分析中去除不需要的物体（碎片、死亡或分裂细胞）：一个过滤器用于选择高于设定阈值的值，另一个用于选择低于阈值的值。 recovery phase as Image3最终生成的图像是一个包含三个时相延时拍摄的单一图像文件，其中 mCherry（通道1）与 SiR-DNA（通道2）通道已合并。 mCherry (channel 1) and SiR-DNA (channel 2) channels merged.
  4. 将所得图像保存以供后续分割步骤使用：点击“文件 | 另存为 | Tiff…”。 File | Save As | Tiff….
  5. 为进行后续分析，请单独拆分 mCherry 通道：前往 Image | Color | Split Channels 并保存：前往 File | Save As | Tiff….
  6. 为检查采集过程中可能发生的光漂白，请运行 Plot Z-axis Profile 在 mCherry 通道上运行该命令：前往 Image | Stacks | Plot Z-axis Profile在生成的表格上，点击 Data | Copy 1 st Data Set 并将其粘贴至本方案提供的即用型电子表格中（Supplemental Table S1位于 Z 轴剖面单元格下方。
  7. 绘制一个与细胞核平均大小相当的圆形感兴趣区域（ROI）并保存：前往 Analyze | Tools | ROI Manager…添加该 ROI 并保存：转到 More | Save…
    注意：所有分析条件均应使用同一 ROI 测量背景。
  8. 将保存的 ROI 置于整个延时拍摄期间均无细胞的区域，并使用 ROI 界面功能测量该 ROI 内的平均强度。首先，通过点击 **Analyze | Set Measurements** 确保已勾选平均灰度值。 Analyze | Set Measurements然后，点击 More | Multi Measure. Tick Measure all 50 slices and one raw per slice并点击 ok.
  9. 将显示的所有数值复制粘贴到所提供的电子表格中（Supplemental Table S1)，位于 "ROI Background" cell.
  10. 在Fiji中，关闭仅包含mCherry通道的图像，并选择先前保存的合并了mCherry与SiR-DNA通道的图像。
  11. 打开 TrackMate 插件：前往 Plugins | Tracking | TrackMate.
  12. 确认时间点数量是否正确（0 安装 FIJI 软件，随后下载 StarDist 13 与 TrackMate 插件。安装插件时，请前往 帮助 | 更新… | 管理更新站点，勾选 CSBDeep、StarDist 和 Trackmate-StarDist，然后点击 应用更改。重启 Fiji。部分显微镜可将每个采集阶段（稳定-照明-恢复）一并拍摄，而另一些（例如，所提及的共聚焦显微镜）则将其分别保存。因此，若使用此类配置，需额外执行一个步骤，即将各阶段图像拼接在一起：打开三个序列的图像，运行 拼接 功能，将三个延时阶段编译至单个文件中：点击 图像 | 堆栈 | 工具 | 拼接…。选择 稳定阶段 作为 图像1，照明阶段 作为 图像2，恢复阶段 作为 图像3。所得图像为包含三个阶段的延时序列的单一图像，其中 mCherry（通道 1）与 SiR-DNA（通道 2）通道已合并。保留此图像用于后续分割步骤并保存：前往 文件 | 另存为 | Tiff…。为进行后续分析，单独拆分 mCherry 通道：前往 图像 | 颜色 | 拆分通道 并保存：前往 文件 | 另存为 | Tiff…。为检查采集过程中可能发生的荧光淬灭，在 mCherry 通道上运行 绘制 Z 轴剖面 命令：前往 图像 | 堆栈 | 绘制 Z 轴剖面。在生成的表格中，点击 数据 | 复制第一组数据，并将其粘贴至本方案提供的现成电子表格（补充表 S1）中 Z 轴剖面单元格下方。绘制一个平均细胞核大小的圆形感兴趣区域（ROI）并保存：前往 分析 | 工具 | ROI 管理器…。添加该 ROI 并保存：前往 更多 | 保存… 注意：分析所有条件时，应使用同一 ROI 测量背景。将保存的 ROI 置于整个延时序列中无细胞的区域，并使用 ROI 界面功能测量该 ROI 内的平均强度。首先，通过点击 分析 | 设置测量 确保已勾选平均灰度值。然后，点击 更多 | 多重测量。勾选 测量所有 50 个切片 和 每切片一行，点击 确定。将所有显示的值复制粘贴至提供的电子表格（补充表 S1）中“ROI 背景”单元格下方。在 Fiji 中，关闭仅含 mCherry 通道的图像，选择先前保存的合并了 mCherry 与 SiR-DNA 通道的图像。打开 TrackMate 插件：前往 插件 | 追踪 | TrackMate。确认时间点数正确（若遵循建议的阶段设置，应为 0 至 49），点击 下一步。选择 StarDist 检测器，点击 下一步。选择 通道 2（SiR-DNA）以分割细胞核，点击 下一步。等待数秒直至分割过程完成。目视检查所得分割结果是否与细胞核边界对应，点击 下一步（图 3）。若分割不准确，请记录相应的细胞核标识符（SpotID），以便在步骤 3.26 中将其从后续分析中排除。在 初始阈值设置 窗口中保留默认参数，点击 下一步。此窗口显示 50 个时间点中分割出的斑点（细胞核）数量。设置斑点过滤器：创建并设置过滤器： 创建两个以 通道 1 平均强度 为参数的过滤器，以去除信号过强或过弱的细胞核，这些可能影响分析：一个过滤器用于选择高于设定阈值的值，另一个用于选择低于阈值的值。设定阈值以仅去除极低或饱和的信号。 注意：若使用稳定细胞系，可能无需这些过滤器。请记录这些值，因为所有条件均需重新应用。创建两个 面积 过滤器，以从分析中去除不需要的物体（碎片、死亡或分裂细胞）：一个过滤器用于选择高于设定阈值的值，另一个用于选择低于阈值的值。 49 若遵循了建议的相位设置）并点击 Next.
  13. 选择 StarDist detector 并点击 Next.
  14. Select channel 2 (SiR-DNA) 分割细胞核，然后点击 Next等待数秒，直至分割过程完成。目视检查所得分割结果是否与细胞核边界吻合，然后点击 Next (Figure 3若分割不准确，请记录下相应的细胞核标识符 (SpotID)，以便在步骤 3.26 中将其排除在后续分析之外。
  15. 保留默认参数并点击 Next 在初始阈值设置窗口中保留默认参数，点击“下一步”。该窗口显示50个时间点中分割出的斑点（细胞核）数量。对斑点设置过滤器：创建并设定过滤器： 创建两个以“通道1平均强度”为参数的过滤器，以去除信号过强或过弱的细胞核，这些可能影响分析结果：一个过滤器用于选择高于设定阈值的数值，另一个用于选择低于阈值的数值。设定数值以仅去除极低或饱和的信号。 注意：若使用稳定细胞系，可能无需这些过滤器。请记录这些数值，因为所有实验条件均需重新应用。创建两个“面积”过滤器，以从分析中去除不需要的物体（碎片、死亡或分裂细胞）：一个过滤器用于选择高于设定阈值的数值，另一个用于选择低于阈值的数值。 initial thresholding setting 该窗口显示50个时间点内分割出的斑点（细胞核）数量。
  16. 设置斑点过滤器：创建并设置过滤器：
    1. 创建两个过滤器，参数设为 Mean intensity ch1 作为参数，以去除信号过强或过弱、可能影响分析结果的细胞核：一个过滤器用于选择高于设定阈值的值，另一个用于选择低于阈值的值。设定阈值时，应仅去除信号极低或饱和的情况。
      **注意**：若使用稳定细胞系，可能无需应用这些过滤器。请记录这些阈值，因为所有实验条件均需重复应用。
    2. Create two filters Area 以排除分析中的非目标对象（碎片、濒死或分裂细胞）：一个过滤器用于选择高于设定阈值的数值，另一个用于选择低于阈值的数值。点击 Next.
      **注意：** 对所有实验条件均需重新应用这些阈值。
  17. Select a tracker: choose Simple LAP tracker 并点击 Next.
  18. 选择追踪参数。调整 Linking max distance (here, 30 µm)-允许在帧间关联对象的最大距离。使用 Gap-closing max distance (here, 15 µm) and Gap closing max frame gap (here, 3) 用于定义单个轨迹中可忽略多少个检测点而不至于排除该轨迹。点击 Next (Figure 3).
    **注意**：此处建议的参数是通过试错法针对我们的实验装置和细胞模型进行优化的，在实际应用中可能需要根据具体实验条件进行调整。
    最大关联距离需要进行调整，以防止细胞核之间的错误追踪，尤其是在细胞移动较为剧烈的情况下。
  19. 计算完成后，点击 Next 并对轨迹设置筛选条件。为仅选择在整个时程内（按建议序列为50个时间点）均被追踪的细胞核，请选择轨迹中最大斑点数量（将光标置于 over 49 （针对所建议的序列）。点击 Next.
    **注意：** 此举将有助于分析，但前提是有足够数量的细胞核在整个时间过程中被成功追踪。若无法满足此条件，请参阅讨论部分。
  20. Display options: tick Display spot names 以便在后续分析中能够追溯每个细胞核。根据用户需求自定义显示的参数。's preferences.
  21. 在页面底部，点击 轨迹 | 导出为 CSV 保存包含所有测量结果的表格。关闭表格并点击 Next.
  22. 可选操作：使用 TrackMate 的"分析"功能绘制轨迹特征。 T (time) 作为 X axis 安装 FIJI 软件，然后下载 StarDist 13 和 TrackMate 插件。要安装插件，请前往 **帮助 | 更新… | 管理更新站点**，勾选 **CSBDeep**、**StarDist** 和 **Trackmate-StarDist**，然后点击 **应用更改**。重启 Fiji。部分显微镜可以将每个采集阶段（稳定-照明-恢复）一起拍摄，而另一些（例如，本文引用的共聚焦显微镜）会将其分别保存。因此，如果使用此配置，需要额外执行一个步骤，即将各阶段拼接在一起：打开三个序列的图像，运行 **拼接** 功能，将三个延时阶段编译到单个文件中：点击 **图像 | 堆栈 | 工具 | 拼接…**。选择 **稳定阶段** 作为 **Image1**，**照明阶段** 作为 **Image2**，**恢复阶段** 作为 **Image3**。生成的图像是三个阶段的延时摄影单张图像，其中 **mCherry**（**通道 1**）和 **SiR-DNA**（**通道 2**）通道已合并。保留所得图像用于后续分割步骤并保存：前往 **文件 | 另存为 | Tiff…**。为进行后续分析，单独拆分出 mCherry 通道：前往 **图像 | 颜色 | 拆分通道** 并保存：前往 **文件 | 另存为 | Tiff…**。为检查采集过程中可能发生的光漂白，在 mCherry 通道上运行 **绘制 Z 轴剖面** 命令：前往 **图像 | 堆栈 | 绘制 Z 轴剖面**。在生成的表格上，点击 **数据 | 复制第 1 个数据集**，并将其粘贴到本方案附带的即用型电子表格（补充表 S1）中 Z 轴剖面单元格下方。绘制一个平均细胞核大小的圆形感兴趣区域（ROI）并保存：前往 **分析 | 工具 | ROI 管理器…**。添加 ROI 并保存：前往 **更多 | 保存…**。 **注意**：所有分析条件中测量背景时应使用同一个 ROI。将保存的 ROI 置于整个延时摄影期间均无细胞的区域，并使用 ROI 界面功能测量该 ROI 内的平均强度。首先，确保勾选了平均灰度值：点击 **分析 | 设置测量**。然后，点击 **更多 | 多重测量**。勾选 **测量所有 50 个切片** 和 **每个切片一行**，然后点击 **确定**。将所有显示的值复制粘贴到提供的电子表格（补充表 S1）中 **"ROI 背景"** 单元格下方。在 Fiji 中，关闭仅包含 mCherry 通道的图像，选择先前保存的合并了 mCherry 和 SiR-DNA 通道的图像。打开 TrackMate 插件：前往 **插件 | 追踪 | TrackMate**。检查时间点数量是否正确（如果遵循了建议的阶段，应为 **0** 到 **49**），然后点击 **下一步**。选择 **StarDist 检测器** 并点击 **下一步**。选择 **通道 2（SiR-DNA）** 以分割细胞核，然后点击 **下一步**。等待几秒钟，待分割过程完成。目视检查所得分割是否与细胞核边界对应，然后点击 **下一步**（图 3）。如果分割不准确，请记下相应的细胞核标识符（SpotID），以便在步骤 3.26 中将其从进一步分析中排除。保留默认参数，在 **初始阈值设置** 窗口点击 **下一步**。此窗口显示 50 个时间点中分割出的斑点（细胞核）数量。设置斑点过滤器：创建并设置过滤器： * 创建两个以 **通道 1 平均强度** 为参数的过滤器，以去除信号过强或过弱的细胞核，这些细胞核可能会使分析产生偏差：一个过滤器用于选择高于设定阈值的值，另一个用于选择低于阈值的值。定义阈值以仅去除极低或饱和的信号。 **注意**：如果使用稳定细胞系，可能不需要这些过滤器。请记下这些值，因为所有条件都需要重新应用。 * 创建两个 **面积** 过滤器，以从分析中去除不需要的物体（碎片、死亡或分裂的细胞）：一个过滤器用于选择高于设定阈值的值，另一个用于选择低于阈值的值。 通道1的平均强度 安装 FIJI 软件，随后下载 StarDist 13 与 TrackMate 插件。安装插件时，请前往 帮助 | 更新 … | 管理更新站点 ，勾选 CSBDeep 、 StarDist 与 Trackmate-StarDist ，然后点击 应用更改 。重启 Fiji。部分显微镜可将每个采集阶段（稳定-照明-恢复）一并拍摄，而其他显微镜（例如本文引用的共聚焦显微镜）则会分别保存各阶段图像。因此，若使用此类配置，需额外执行一个步骤：将各阶段图像拼接在一起。打开三个序列的图像，运行 拼接 功能，将三个延时阶段编译为单个文件：点击 图像 | 堆栈 | 工具 | 拼接 … 。选择 稳定阶段 作为 图像1 ， 照明阶段 作为 图像2 ， 恢复阶段 作为 图像3 。生成的图像即为包含三个阶段的延时序列单一图像，其中 mCherry （ 通道 1 ）与 SiR-DNA （ 通道 2 ）通道已合并。保留此图像用于后续分割步骤，并保存：前往 文件 | 另存为 | Tiff … 。为进行后续分析，单独拆分 mCherry 通道：前往 图像 | 颜色 | 拆分通道 ，并保存：前往 文件 | 另存为 | Tiff … 。为检查采集过程中是否发生光漂白，在 mCherry 通道上运行 绘制 Z 轴剖面 命令：前往 图像 | 堆栈 | 绘制 Z 轴剖面 。在生成的表格中，点击 数据 | 复制第 1 个数据集 ，并将其粘贴至本方案提供的即用电子表格（ 补充表 S1 ）中 Z 轴剖面单元格下方。绘制一个平均细胞核大小的圆形感兴趣区域（ROI）并保存：前往 分析 | 工具 | ROI 管理器 … 。添加该 ROI 并保存：前往 更多 | 保存 … 注：分析所有条件时，应使用同一 ROI 测量背景。将保存的 ROI 置于整个延时序列中均无细胞的区域，并使用 ROI 界面功能测量该 ROI 内的平均强度。首先，通过点击 分析 | 设置测量 确保已勾选 平均灰度值 。随后，点击 更多 | 多重测量 。勾选 测量所有 50 个切片 与 每个切片一行 ，并点击 确定 。将所有显示的值复制粘贴至提供的电子表格（ 补充表 S1 ）中 " ROI 背景 " 单元格下方。在 Fiji 中，关闭仅含 mCherry 通道的图像，选择先前保存的合并了 mCherry 与 SiR-DNA 通道的图像。打开 TrackMate 插件：前往 插件 | 追踪 | TrackMate 。确认时间点数量正确（若遵循建议阶段，应为 0 至 49 ），然后点击 下一步 。选择 StarDist 检测器 ，点击 下一步 。选择 通道 2（SiR-DNA） 以分割细胞核，点击 下一步 。等待数秒直至分割过程完成。目视检查所得分割是否与细胞核边界对应，然后点击 下一步 （ 图 3 ）。若分割不准确，请记录相应的细胞核标识符（SpotID），以便在步骤 3.26 中将其从后续分析中排除。保留默认参数，在 初始阈值设置 窗口点击 下一步 。此窗口显示 50 个时间点中分割出的斑点（细胞核）数量。设置斑点过滤器：创建并设置过滤器： 创建两个以 通道 1 平均强度 为参数的过滤器，以去除信号过强或过弱的细胞核，这些细胞核可能导致分析偏差：一个过滤器用于选择高于设定阈值的值，另一个用于选择低于阈值的值。设定数值以仅去除极低或饱和的信号。 注：若使用稳定细胞系，可能无需这些过滤器。请记录这些数值，因为所有条件均需重新应用。创建两个 面积 过滤器，以从分析中去除不需要的物体（碎片、死亡或分裂细胞）：一个过滤器用于选择高于设定阈值的值，另一个用于选择低于阈值的值。 Y axis点击 Plot features关闭图表并点击 Next.
    **注意：** 这将让用户对输出的大致趋势有所了解。此时，数据尚未针对背景和初始强度进行归一化处理。
  23. 点击 Capture overlay as action and Execute | OK生成后的图像将用于识别已量化的细胞核。保存操作：请前往 File | Save As | Tiff….
  24. 在电子表格文件中，导入通过 TrackMate 获得的 CSV 文件：在 Data 选项卡中，在 Get & Transform Data group, click From Text/CSV and Import.
  25. 点击对应字母选中以下四列，将其复制并粘贴至所提供电子表格的顶部。Supplemental Table S1），A至D列，含背景： Spot ID (B), Track ID (C), Frame (I), Mean intensity ch1 (M).
    注意：请确保粘贴的测量数据起始于第6行。 Supplemental Table S1若不符合此情况，测量值可能偏移自一个或多个细胞，从而导致结果不准确。请参考电子表格中的 Supplemental Table S2 以获取预期布局示例。
  26. 首先按字母顺序对结果进行排序， TrackID (individual nucleus) 通过点击 arrow in cell B5 and Frame (time point) 通过点击 arrow in cell C5.
  27. 为消除背景噪声，需从通道1平均强度值（已在提供的电子表格中预计算，参见补充表S1）中减去步骤3.8所得数值。 Supplemental Table S1).
  28. To normalize LEXY'信号，计算稳定期（第0至9帧）中mCherry荧光信号的平均强度。随后，将所有在“通道1平均强度”中获得的结果除以稳定期的平均强度（已在提供的电子表格中预先计算，参见 Supplemental Table S1).
    ​**注意：** 所得数值即为 LEXY 的平均核荧光强度。所有测量值已按细胞核显示在 L 列，并可绘制成图。

figure-protocol-2
图3：使用FIJI进行TrackMate分析。上方为TrackMate分析的示意图，下方为FIJI分析所得图像。左侧第一幅图为未分割的SiR-DNA染色图像（灰色），该染色为细胞核标记物。第二幅图显示了Stardist基于SiR-DNA通道进行的自动分割结果，细胞核根据mCherry通道的信号强度进行着色，以方便可视化及最终步骤的判读。第三幅图展示了在整个活细胞成像序列的时间点中，通过追踪SiR-DNA染色所获得的运动轨迹。最右侧的最后一幅图显示了在分割定义区域内LEXY的红色荧光信号，该信号将在每个时间点进行定量测量。比例尺 = 50 µm 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 运输速率、统计分析与图表

  1. 绘制相对核强度图。
    1. 打开 GraphPad Prism 并创建一个工作表：单击 将数据输入或导入新表格，然后在选项中选择 经过的时间 用于 X 以及 每个重复值的最大分割细胞核数量 并列的子栏中 Y. 点击 创建 并将获取的数据粘贴到表格中。
    2. 对于 X 值（时间）如果采集参数按建议设置，请复制并粘贴所提供电子表格中“时间”下方的列；否则，请根据实际使用的参数调整数值。
    3. 要创建相对核强度图，请转到“图表”部分。选择 XY 作为 图族，以及 要点 & 带误差线的连接线 作为 图表类型.
    4. 在 绘图 切片，选择 均值、误差与标准误 并点击 好的 查看图表。根据所选参数调整刻度和可视化显示。
  2. 将相对核强度拟合到单指数模型。
    1. 在 数据表 切片，点击 新数据表.
      1. 选择 输入 X 值 作为 X 和 输入并绘制每个数据点的单个 Y 值 作为 Y，然后点击 创建.
      2. 在 X 柱状图中，仅对稳定相和光照相的时间以小数形式报告；若保持了建议的采集参数，请将该列复制并粘贴至所提供电子表格中的“小数时间”列下。 补充表 S1.
      3. 粘贴所获得的数值作为 相对核强度 在表格中，仅针对稳定和光照阶段。
      4. 在 结果 切片，选择以下分析： XY 分析 | 指数拟合 | 非线性回归（曲线拟合） 并点击 好的.
      5. 在 参数，选择 平台期后接单相衰减作为模型，以及在 约束参数，选择一个 常数，等于 2.25 作为 X0 （光照开始时间），a 常数等于 1 作为 Y0 （光照开始时的相对核强度），a 常数等于 0 对于 高原 （相对核强度应趋近的数值），并表明 K （外排速率）应为 大于 0. 其余参数保持默认设置。点击 好的.
      6. 在 结果 在该部分中，K行表示测试条件下所有细胞核的输出速率。
      7. 重复 步骤 4.2.1 至 4.2.1.5 如有需要，可针对其他条件进行操作。
  3. 创建导出速率图。
    1. 创建新表格：选择 输入 X 值 作为 X 和 输入并绘制每个数据点的单个 Y 值 作为 Y，然后点击 创建.
    2. 对于每种条件（列中），粘贴并转置上一步骤中获得的 K 值。
    3. 要创建导出速率图，请前往 图表 切片，选择 柱 作为 图族，以及在 箱线图与小提琴图 切片，选择 小提琴图 作为 图表类型，与 小提琴图. 显示所有点 作为 绘图. 点击 好的 查看图表。如有需要，可自定义数据的呈现方式。
    4. 为了对导出速率进行统计检验，执行双侧 Welch's 检验 t 测试，如Yoo和Mitchison所述14，通过执行以下步骤：
      1. 在包含所有条件下导出速率的表格中，单击 分析 | 组间比较 | T检验（及非参数检验），选择要测试的条件，然后点击 好的蜱虫 非配对，是，使用参数检验，以及 使用韦尔奇校正的非配对 t 检验。不假设标准差相等，然后点击 好的.
    5. 在表格中观察分析结果 结果 如需，可截取并报告出口速率图。

5. LINuS 的适应性改进

注意：通过应用以下更改，可轻松调整上述方案以使用 LINuS 监测核输入。

  1. 细胞培养
    1. 在步骤1.5中，使用importazole18作为核转运抑制剂，替代Leptomycin B，浓度为10 µM，处理1小时后进行采集。
  2. 成像
    1. 为实现系统的最佳导入，将步骤2.2.1中458 nm激光以36 ms脉冲重复照射150次的设置，改为重复250次，总持续时间约为9秒。
      注意：该序列的时间参数可能依赖于细胞类型，且两种探针的参数可能均需调整以达到最佳效果，因为该系统依赖于对NLS和NES的识别，而这些序列具有细胞类型特异性19,20。
  3. 转运速率、统计分析与图像处理
    1. 在步骤4.2.1.5中，不拟合“平台期后单相衰减”曲线，而应选择平台期后单相结合分析。
    2. 将X0约束为2.25，Y0约束为1，并将K（在LINuS情况下为导入速率）约束为大于0。
      注意：LINuS在TrackMate中的分析方法与LEXY相同。所测量和分析的仍是相对核内荧光强度，但与观察探针输出导致的信号下降不同，此处应在蓝光照射后观察到核内荧光信号的富集。

结果

上述方案应能使用户在活细胞成像过程中观察到探针的定位及其转位情况。图4展示了利用LEXY可视化核输出所获得的典型图像示例。经过数轮蓝光照射后，应可观察到细胞核内信号迅速减弱，同时细胞质中信号增强。停止光照循环后，探针信号可逐步恢复。为验证系统有效性，可使用核输出抑制剂Leptomycin B作为对照，该抑制剂可阻止LEXY在蓝光照射下发生核输出，从而证明本分析方法能够可视化输出变化（图4）。

figure-results-1
图4：LEXY信号随时间变化的可视化。 通过活细胞成像获取的稳定期、光照期和恢复期代表性时间点的图像。甲醇处理组作为对照条件。在脉冲式蓝光照射（红色表示）下，mCherry荧光信号（LEXY定位的报告分子）从细胞核转移至细胞质。停止光照后，信号重新回到细胞核内。使用1 nM或0.5 nM的核输出抑制剂Leptomycin B处理后，当核输出被阻断时，LEXY的输出显著减少或完全消失。比例尺 = 30 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

在分析过程中，稳定期的核内相对强度值应接近1；而在蓝光激活后，该值应缓慢下降，直至光照阶段结束时达到平台期（图5A）。如果下降速度过快或过慢，可对采集参数进行优化（参见讨论部分）。使用足够浓度的莱普托霉素B（Leptomycin B）处理可进一步验证分析方法和技术的灵敏度，此时应能显示核输出被完全抑制，整个实验过程中核内相对强度值稳定在约1的水平。然而，使用中等浓度的莱普托霉素B时，则应观察到轻微的核输出现象（图5A）。这些视觉观察结果应通过定量计算核输出速率加以验证（图5B）。

figure-results-2
图5：LEXY的预期相对核强度与转运速率。（A）该图表示LEXY荧光信号的相对核强度随时间的变化，已归一化至稳定阶段的mCherry平均强度。甲醇处理组（对照组，红色）在光照后相对核强度下降一半，而经输出抑制剂Leptomycin B处理的细胞在0.5 nM（浅蓝色）或1 nM（深蓝色）浓度下则未出现此现象。误差线：标准误（SEM）。（B）通过将曲线拟合至单指数模型获得的对照组与Leptomycin B处理组的输出速率。Leptomycin B阻断输出时所得值显著低于对照组。甲醇组（红色）n = 18个细胞，Leptomycin B 0.5 nM组（浅蓝色）n = 19个细胞，Leptomycin B 1 nM组（深蓝色）n = 15个细胞。P值通过双侧Welch's t检验计算。***：P < 1×10−4，****：P < 1×10−5。请点击此处查看该图的放大版本。

补充表 S1：含预设计算的电子表格。 提供此电子表格以方便数据分析。使用 TrackMate 获得的强度值可直接复制并粘贴到该电子表格中，以获得归一化的相对核强度值。请点击此处下载此文件。

补充表 S2：LEXY 分析对照条件下预期结果示例。 该电子表格展示了 LEXY 稳定细胞系在对照条件下获得结果的一个示例。请点击此处下载该文件。

讨论

如实验方案中所述，构建稳定细胞系可显著提高分析质量。首先，所有细胞均表达探针，可增加被追踪和分析的细胞核数量，从而增强分析的稳健性。其次，可减少因探针过表达以及转染试剂毒性所导致的细胞死亡。最后，可降低细胞间荧光信号的强烈异质性。这一参数至关重要，因为信号饱和将无法准确检测光照后荧光强度的变化；同样，信号过弱也可能导致荧光淬灭，或无法对差异进行定量分析。因此，我们建议先通过瞬时转染测试探针功能是否正常，并设定成像采集参数，随后尽快构建稳定细胞系。我们已构建了携带 LEXY 和 LINuS 探针的慢病毒载体，可根据请求提供；同时，利用这些慢病毒构建的 NIH/3T3 LEXY 或 LINuS 稳定细胞系也可提供共享。

如果探针是通过转染引入的，或细胞密度较低，则建议的参数可能会减少检测到的轨迹数量，导致分析结果的稳健性降低。在这种情况下，用户可以适当放宽轨迹中遗漏斑点的筛选条件，即降低“轨迹中的斑点数”滤波器的阈值（我们建议至少保留50个斑点中的45个）。注意：如果降低此滤波器阈值，则需手动调整所提供的Excel文件（补充表S1）：因为从导入的CSV文件中粘贴的数值不会自动考虑缺失的数据点。用户需要根据TrackID编号找出缺失斑点的位置，并将其与细胞核编号相对应，这一过程通常需要进行数轮复制和粘贴操作。

确保实验成功的一个关键参数是将细胞保持在黑暗环境中。由于探针会对蓝光产生反应，用户必须确保在采集前至少将细胞在黑暗中运输30分钟。使用一个小型密闭盒子或用铝箔覆盖培养皿即可满足要求。同样，在显微镜下寻找细胞时，必须格外小心，仅使用mCherry光源，因为蓝光照射会激活细胞。如果在显微镜下意外发生了光照，应另选一个远离的视野进行图像采集。在步骤3.6中绘制Z轴轮廓图有助于判断细胞是否受到了光照影响，若曲线呈下降趋势而非平台状，则表明细胞可能已被光照激活。

成像序列设置为包含三个阶段。第一阶段为稳定期，用于评估可能发生的漂白现象，同时确保在未激活状态下 LEXY 的定位保持稳定（1）。第二阶段为激活期，通过脉冲式蓝光照射诱导 LEXY 从细胞核转位至细胞质（2）。最后是可选的恢复期，信号逐渐回到细胞核内的初始位置（3）。

所描述的采集序列可能具有细胞类型特异性19,20。在首次实验中，用户应测试并调整激光功率和时间参数，以观察系统在细胞核与细胞质之间逐步转位的过程。需要注意的是，若激光功率过高或暂停时间过短，可能无法观察到逐步转位现象，而会出现mCherry荧光强度在光照后突然下降或富集（取决于所用探针）的情况。

如果序列优化仍无法解决问题，则可能是核输出信号（NES）和/或核定位信号（NLS）不适用于所使用的细胞类型。用户可参考LINuS方法的相关文章8对探针进行设计和改造。用户也可查阅该文章以了解如何使用落射荧光显微镜对LINuS进行成像。

细胞核分割是分析中的关键步骤。对于探针的活细胞成像，应使用稳定且可靠的核标记物。由于蓝光照射会激活探针的转位，且探针通过mCherry荧光蛋白进行监测，因此该标记物必须能在远红光谱或相近波段被观察到。在本实验中，我们使用SiR-DNA，在孵育1至约24小时期间对细胞进行染色，但也可选用SPY-DNA 650（参见材料表 Materials中的参考文献）。

最后，尽管StarDist分割与TrackMate的过滤追踪相结合已证明其高效性，但仍需注意，用户应始终对分割结果和定量结果进行目视检查。某些正在分裂或死亡的细胞可能被错误地纳入定量分析，而实际上不应包含在内。为降低分析此类事件的风险，所提供的Excel表格会对核相对强度进行颜色编码（蓝色表示低值，红色表示高值）。在使用GraphPad Prism绘图之前，通过检查颜色，用户应能够发现任何异常数值。例如，LEXY的核相对强度应在稳定期较高（红色，核内探针含量高），在光照期结束时降低（蓝色，核内探针含量减少），随后在恢复期再次升高至高值（红色）（如补充表S2所示）。

与先前提出的方法相比，本方案具有多种优势5,6。该半自动分析流程可促进对 LEXY 和 LINuS 核质转运的分析，并比先前提出的 manual 定量方法具有更高的准确性5,6。使用本方案不仅可使该领域的新手高效开展分析，还可为经验丰富的用户提供一种新工具，使其仅需一个开放获取的界面即可完成核质转运的半自动分析。

该方法的应用范围不仅限于研究NIH3T3细胞系中的全细胞核质运输速率。实际上，经过少量优化步骤后，该方法可被改造用于研究探针在多种细胞类型或活体动物中的运输速率8。此外，通过将目标蛋白与LEXY或LINuS融合，也可研究该蛋白的运输速率，或其在光诱导下进出细胞核转位所引发的下游效应。例如，可利用LEXY将蛋白滞留在细胞质中，或利用LINuS强制其定位于细胞核内5,6,21,22,23。最后，文中所述分析方法还可拓展应用于除LEXY和LINuS之外的更多研究场景，以追踪任何可在亚细胞区室之间发生转位且能够被分割识别的信号。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢成像设施MRI（法国生物成像国家基础设施France-BioImaging的成员，https://ror.org/01y7vt929），该设施得到了法国国家科研署（ANR-24-INBS-0005 FBI BIOGEN）的支持；特别感谢Marie-Pierre Blanchard、Julio Mateos-Langerak和Baptiste Monterroso在显微镜设置和FIJI分析方面的帮助。我们感谢Boumendil实验室所有成员提供的建议和富有成效的讨论，尤其感谢Parisa Nobari在项目启动阶段的帮助。我们感谢Joey Dufourd对稿件的校对。

CB研究组的工作得到了法国国家科学研究中心（CNRS）、法国国家癌症研究所（Institut National du Cancer）/法国南部癌症研究中心（Canceropole Grand Sud-Ouest）（2023年新兴项目E07）、法国国家科研署（ANR-23-TERC-0015-01 和 ANR-21-CE12-0039）、法国国家癌症研究所（INCa PLBIO23-207-2023-180）以及蒙彼利埃大学（I-SITE计划，France 2030项目，NAChO项目和ChOICe项目）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胶原蛋白Sigma-Aldrich08-115
共聚焦显微镜LEICASP8
DMEMGibco31966021
ExcelMicrosoft
FBSSigma-AldrichF7524
纤连蛋白Sigma-AldrichF1141
FIJI 软件FIJIImageJ 2.16.0/1,54p；Java1.8.0_322
荧光培养皿DutscherFD3510-100替代品：Attofluor 培养室（Invitrogen #A7816）
GraphPad Prism 10.4.1GraphPad Software, Inc.
ImportazoleSigma-AldrichSML0341
Leptomycin BSigma-AldrichL2913
LEXY 质粒Addgene72655pDN122
LINuS 质粒Addgene61347pDN77
青霉素-链霉素Gibco15140-122
无酚红 DMEMGibco21063-029
SiR-DNASpirochromeSC007替代品：SPY-DNA650（Spirochrome #SC501）
Stardist 2D 插件StarDistStarDist_0.3.0
TrackMate 插件TrackMateTrackMate-7.14.0

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