一种改进的共培养系统，用于了解牛卵巢中颗粒-Theca细胞相互作用

Summary

本文介绍了牛鞘细胞和颗粒细胞的共培养模型。该方法有可能作为分析的可靠基础，重点研究卵泡内体细胞之间的旁分泌通讯和底物转运。

Abstract

颗粒细胞 （GC） 和膜细胞 （TC） 的可靠共培养有可能促进更全面地了解牛卵泡中两个细胞区室之间的相互作用、信号通路和底物交换。利用市售的细胞培养插入物，建立了牛GCs和TCs的可重复共培养模型。据观察，与细胞系相比，原代鞘膜细胞和颗粒细胞需要更多的时间才能附着在插入膜上。最初，将 TC 接种到倒置的插入膜上，用截管作为接种容器以防止培养基泄漏。经过 72 小时的孵育期后，将插入片段倒置，允许在膜的另一侧培养 GC。然后将该共培养物在 37°C 和 5% CO₂ 下再孵育 6 天，每隔一天更换一次培养基。标记基因的表达表明细胞类型特异性模式， CYP17A1 在 TC 中高度丰度，在 GC 中不表达。相反， CYP19A1 在 GC 中显示出高水平，而在 TC 中仅显示低水平。激素分析支持生理共培养系统的存在，雌二醇的合成证明了这一点。这种改良的共培养模型支持对卵泡体细胞之间旁分泌信号传导和底物转运的可重复研究。

Introduction

在卵泡发生过程中，黄体生成素 （LH） 的激增会引发卵巢的一系列生理变化，最终导致排卵期间成熟卵母细胞的释放 ^1,2。这一过程受到卵泡体细胞的严格调节，卵泡体细胞为卵母细胞成熟提供必要的支持并确保正常的排卵功能³。卵泡由两种类型的类固醇生成体细胞组成，内层是颗粒细胞 （GC），外层是鞘膜细胞 （TC）。其中，GC 在 LH 激增后经历了最明显的形态和功能变化，凸显了它们在协调卵泡发育最后阶段的关键作用⁴。因此，GC 在分析可能影响卵泡发生、排卵和黄体形成的因素方面具有相当大的兴趣。

先前^{建立了模拟}雌二醇活性状态的牛GC的细胞培养模型5,6,7,8,9,10,11。这种无血清培养模型可以对GC生理学进行可靠的分析，并在信号通路，基因调控和激素合成中进行可能的效应子分析12,13,14。然而，卵泡结构要复杂得多，正如 2 细胞 2 促性腺激素假说¹⁵ 所强调的那样。这强调了在类固醇合成在两层之间划分的背景下细胞类型的依赖性和相互关联性。

许多研究描述了与先前建立的GC单一培养系统相似的TC培养模型16,17,18。然而，报道了猪鞘细胞和颗粒细胞的共培养系统，其中两个细胞群在单个培养皿中以 4：1 的 GC 与 TC 的比例培养 19,20,21。在该模型中，可以表明颗粒细胞和鞘膜细胞之间存在功能系统和相互作用，揭示了共培养系统中的雌二醇含量高于单培养系统。然而，应该注意的是，该模型无法充分分析颗粒细胞和鞘细胞之间的相互作用和底物交换，因为两种细胞类型可能受到不同的影响。因此，如果没有复杂的分选程序，几乎不可能独立地分析 GC 和 TC 的分子水平，这本身可能会影响细胞生理学。此外，重要的是要考虑到该模型可能无法准确复制LH激增之前的情况，此时GC和TC被基底膜^隔开3。在牛中，提出了一种基于膜的细胞培养系统，其中两种细胞类型都在胶原膜的两侧培养，从而更精确地反映体内情况22,23,24,25,26。

该方法采用基于膜的系统的初始概念，旨在建立牛GC和TC与细胞培养插入物的共培养模型，以便将来研究两个细胞区室之间的旁分泌信号传导。所提出的方法利用市售的悬挂式细胞培养插入物代替基于定制的膜系统，具有更高的重现性、标准化质量和更高的产品稳定性等优点。这种方法确保了实验的一致性，使其成为研究滤泡细胞相互作用的研究人员的宝贵工具。培养程序包括在插入物的下侧初始接种 1.7-1.8 x 10⁵ 个鞘细胞，然后在倒置后在上表面接种大约 1.0 x 10⁵ 个颗粒细胞，并进行 72 小时的预孵育。培养物在标准条件（37°C，5%CO₂）下保持在规定的培养基中，每隔一天更换一次培养基。为了实现跨隔室的旁分泌交换，使用了由聚酯制成的 0.4 μm 细胞培养插入物，例如聚对苯二甲酸乙二醇酯 （PET）（市售）。这种孔径的膜允许可溶性大分子的扩散，例如激素、生长因子和蛋白质，同时防止细胞迁移^27,28。

通过在保持旁分泌通讯的同时实现空间分离，该共培养系统为研究颗粒-鞘细胞相互作用、信号通路和底物交换提供了生理相关的环境。该模型特别适用于需要受控条件的研究，例如激素调节、基因表达分析或药物测试。对卵泡动力学、生殖生理学或卵巢疾病感兴趣的研究人员可能会发现这种方法适用于他们的研究。此外，使用标准化插入物可以轻松适应不同的实验需求，包括修改培养持续时间、细胞类型或治疗条件。

Protocol

牛卵巢是从当地的商业屠宰场获得的。在这种实验装置中，卵巢的准备在接收后2小时内进行。根据德国法律，屠宰场副产品的收集不需要道德批准。

注意：牛GC的分离和冷冻保存已经在先前的方法报告⁶ 中描述和显示，并且可以相应地进行。

1. 卵泡清扫试剂的制备和设置

1. 制备1x PBS（pH 7.4），补充有100 IU青霉素，0.1mg / mL链霉素和0.5μg / mL两性霉素，用于转运卵巢。该溶液可在 4 °C 下储存长达 4 周。
2. 制备含有 10x Hanks 盐缓冲液的消化溶液，其中补充有 25 mM HEPES、100 IU 青霉素、0.1 mg/mL 链霉素和 0.5 μg/mL 两性霉素。消化液可在4°C下储存2-3周。
   1. 在每个计划解剖的卵泡的 1.5 mL 管中填充 1 mL 消化溶液，并将溶液预热至 37 °C。
   2. 在制备前不久加入 10 μL 胶原酶 NB8 以达到 0.1% 浓度的消化溶液。
3. 准备以下菜肴进行准备、隔离和洗涤程序。
   1. 最小直径为 3 厘米的玻璃盘，用于放置卵巢进行解剖。
   2. 用于洗涤的 6 孔板，其中含有 1 mL 1x PBS（补充抗生素）。
   3. 一个 12 孔培养皿，含有约 10 μL 消化液。
4. 对于冷冻保存，准备由80%胎牛血清（FCS）和20%DMSO组成的冷冻溶液。
   注意：用于冷冻保存的DMSO的最终浓度为10%。

2. 卵泡解剖，随后消化牛鞘细胞

1. 在层流工作台下执行细胞消化程序以及细胞培养工作。
2. 用 1x PBS（补充抗生素，参见步骤 1.1）洗涤卵巢 2-3 次，以去除表面的血液和其他残留物。将卵巢放入玻璃杯中，用 1x PBS 填充，以覆盖卵巢，然后丢弃溶液。重复此步骤 3-4 次，直到卵巢干净。
3. 将一个卵巢放入玻璃盘中，选择用尺子测量的 5-11 毫米的卵泡进行解剖。
4. 用 3 mL 注射器和 18 G 针头穿刺一个选定的卵泡吸出卵泡液。丢弃卵泡液。
5. 用剪刀剪开毛囊，从抽吸过程中插入针头的点开始。使用双筒望远镜进行精确切割。
   1. 在毛囊的切削刃处使用镊子抓住最内层，即内膜。
   2. 尝试从开放的毛囊壁的内侧剥离内膜。
      注意：根据卵泡的年龄或阶段，鞘膜细胞层可以更容易剥离，从而形成完整的鞘膜层。
6. 将theca细胞层放入装有1x PBS（补充抗生素，参见步骤1.1）的培养皿中，以去除剩余的颗粒细胞。
   1. 用手术刀从膜内侧轻轻刮掉颗粒细胞。细胞应该很容易成群分离。
   2. 将theca细胞层放入装有1x PBS的新培养皿中进行洗涤。
   3. 通过在新鲜的 1x PBS 中旋转来仔细冲洗膜，以去除任何松散的细胞。
      注意：从下一步开始，在层流箱下工作。
7. 将内螺纹转移到12孔板的制备消化液中（参见步骤1.2和1.3.3），并使用手术刀将其切成小块，大概是1-3毫米。
   注意：建议独立消化来自不同毛囊的膜膜细胞，以防止不同来源的组织堵塞。
8. 将theca片段转移到准备好的1.5mL反应管中（参见步骤1.2.1和1.2.2）。将theca在37°C下以800rpm的保温摇动培养箱孵育45-50分钟。
   1. 摇动30分钟后，开始涡旋反应管3-5秒，然后将它们放回摇动培养箱中。
   2. 在剩余的孵育时间内重复此步骤3-4次。
   3. 孵育后，用移液器重悬消化的细胞。
9. 使用放置在 50 mL 管上的 100 μm 细胞过滤器通过过滤去除未消化的组织，并立即进行细胞计数和冷冻保存以去除消化培养基。

3. TC的计数和冷冻保存

1. 要计算活细胞的数量，请准备装有 1.5 μL 0.25% 台盼蓝溶液的试管。活细胞将保持未染色，而死细胞由于台盼蓝通过破坏的细胞屏障进入而呈现蓝色。
   1. 将 15 μL 消化的细胞悬液加入台盼蓝溶液中并轻轻混合。
   2. 将 10 μL 混合物放入血细胞计数器的两个腔室中。计算每个腔室一个大方格中的活（=无色）细胞数量。
   3. 按照标准指南确定活细胞的数量，以及两个腔室平方的平均值。请注意，卵巢之间活细胞的比例可能不同。
2. 冷冻膜细胞悬液的未消化部分（参见步骤 2.9），以作为非培养对照进行预期比较，并评估与 GC 的潜在交叉污染（如 图 2 所示）。
   1. 将残留在 100 μm 细胞过滤器中的每个解剖的内膜的未消化组织（参见步骤 2.10）转移到标记管中。
   2. 在储存在-80°C之前，将试管在液氮中电击冷冻。
3. 对分离的鞘细胞进行冷冻保存，以促进改进细胞培养的计划，特别是关于所需的细胞数量。
   1. 在室温（平均20°C）下以500× g 离心消化的细胞悬液5分钟。弃去上清液。
   2. 小心地将细胞沉淀溶解在 1 mL 的 100% FCS 中。向细胞溶液中加入 1 mL 冷冻培养基（参见步骤 1.4）。用于冷冻保存的DMSO的最终浓度为10%。将混合物转移到指定的 2 mL 冷冻瓶中。
   3. 将小瓶放入较冷的装置中，以控制温度下降。在此设置中，使用了特定的冷冻容器，当在-80°C下放置至少4小时时，该容器保证了-1°C/min的冷冻速率。 之后，小瓶可以储存在液氮储存系统中。

4. 细胞培养工作的准备工作

1. 从 1.5 mL 反应管上切下盖子。然后，在手术刀（最好是加热的）或适当的软管切割器的帮助下，将反应管从开口处切开约 1 厘米。然后，高压灭菌切割的管子和盖子。细胞培养的后续程序可能需要盖子（参见步骤5.5）。
   注意：确保 1.5 mL 试管紧紧贴在所选插入物上。
2. 确保在插入物上涂有 0.02% 的胶原蛋白 R，用于培养物中的 GC 和 TC 附着。
   注意：在无菌层流罩下执行涂层程序。
   1. 使用纯净水（适用于细胞培养）制备0.02%胶原蛋白R溶液。为所需的每个细胞培养插入物制备 80 μL 该溶液。
   2. 将插入物倒置在 24 孔板的盖子中。轻轻地将 40 μL 胶原蛋白 R 溶液添加到插入物的膜中，确保其保持在原位。将胶原蛋白 R 溶液在层流罩下干燥 4-5 小时。
   3. 转动插入物并将其挂在 24 孔板的孔中，以再次用 40 μL 胶原蛋白 R 溶液涂覆第二面。让溶液再次干燥 4-5 小时。
   4. 用紫外线照射插入物 10-15 分钟以减少污染。
   5. 插入物应储存在24孔板内（最好在无菌递送袋中）和4°C的冰箱中，可使用长达4周。
3. 按如下方式准备介质 ^8,10：
   注意：在无菌层流罩下执行培养基制备程序。
   1. 用 2 mM L-谷氨酰胺、0.084% 碳酸氢钠、0.1% BSA、20 mM HEPES、4 ng/mL 亚硒酸钠、5 μg/mL 转铁蛋白、10 ng/mL 胰岛素和 1 mM 非必需氨基酸补充 α-Minimial 必需培养基 （α-MEM）。
      注意：为确保一致性，建议提前为整个实验准备足够的培养基。制备的培养基可在4°C下储存。 对于所描述的设置，每个细胞培养孔使用 750 μL。
   2. 此外，向制备的培养基中加入100 IU青霉素，0.1 mg / mL链霉素和0.5 μg / mL两性霉素。
   3. 在水浴中将培养基预热至 37 °C。
      注意：培养基预热后，抗生素稳定约48小时。因此，仅等分所需量的培养基进行加热。
   4. 此外，用 20 ng/mL 促卵泡激素 （FSH）、50 ng/mL R³ IGF-1 和 2 μM 雄烯二酮补充 α-MEM，用于生理细胞环境 ^7,8,10,11。
      注意：在培养物或培养基交换开始前不久添加这些组分。为了防止活性受损，必须避免FSH和IGF-1储备液的重复冻融循环。

5. TC和GC的共培养

1. 准备用于培养theca细胞的接种室（图1A）。
   1. 将涂层插入物倒置放入更大的板（例如，12 孔板）中。
   2. 将切割和高压灭菌的管放在倒置的插入物上（参见步骤 4.1）。确保管子牢固地固定在插入物上，以防止介质泄漏。
2. 将冷冻保存的theca细胞在37°C的水浴中快速解冻3-5分钟，解冻后立即将细胞悬液转移到预热的培养基中。
3. 在室温（平均20°C）下以500× g 离心theca细胞悬液3分钟，并弃去上清液。加入补充的α-MEM并小心地重悬细胞。
4. 在接种室中接种 1.7-1.8 x 10⁵ 个细胞，最终体积为 200 μL 培养基。每个条件至少包括三个技术重复。
5. 要用盖子关闭细胞培养皿，在使用接种室时可能需要增加培养皿和盖子之间的距离。
   1. 使用1.5mL反应管中切割和高压灭菌的盖子（参见步骤4.1），并将它们放在细胞培养板的每个角落。盖子将充当支撑物，稍微抬起板盖，为接种室提供足够的空间，同时仍充分覆盖培养皿。
   2. 小心关闭孔板，确保其保持稳定并且不接触膜或腔室。
   3. 轻轻地将板转移到加湿的细胞培养箱中。
6. 将膜细胞在37°C下与5%CO₂ 孵育3天，以允许细胞附着在膜上。
7. 培养3天后转动插入物，准备用GC接种（图1B）。
   1. 准备一个 24 孔板，并在每个所需孔中填充 500 μL 培养基。
   2. 使用移液器从接种室中取出所有培养基。用镊子小心地从插入物中取出接种室。
   3. 将带有附着的 theca 细胞的插入物放入准备好的 24 孔板中，确保 TC 面朝下（有关更多详细信息，请参见 图 1B ）。
8. 要从冷冻保存中接种颗粒细胞，请执行步骤 5.2 和 5.3。
9. 每个插入片段接种大约 1.0 x 10⁵ 个细胞，最终体积为 250 μL 培养基，放置在插入物内。
10. 随后，将共培养物与5%CO₂ 在37°C下再孵育六天。
11. GC接种后每48小时更换一次培养基，此时仅更换三分之二的培养基。这应该会减轻手术的压力，并有助于适应新添加的介质。

6. 培养的theca和颗粒细胞的后续分析

1. 使用相差显微镜对整个细胞培养物中的 theca 和颗粒细胞进行形态学评估，以监测两种细胞类型的附着和扩散（见 图 3）。
2. 对于类固醇激素分析，收集培养基并在-20°C下冷冻。 使用适当的方法分析所需类固醇激素的浓度（例如，在此工作流程中，通过RIA ^5,29分析雌二醇）。
   注意：类固醇激素分析有助于评估培养物的生理状态⁷.
3. 要分析基因表达，首先使用适当的技术（例如试剂盒程序）分离 RNA。
   注意：请注意，在分离过程中，两种细胞类型都是相互独立制备的。
   1. 用适当的试剂（例如胰蛋白酶或accutase）将细胞从膜的两侧解离。将解离培养基放入插入物（例如，200μL accutase）和板的孔（例如，500μL accutase）中，使膜完全被解离培养基包围。
   2. 从插入物中收集颗粒细胞，而分离的鞘细胞可以从孔中收集。将每种细胞类型转移到 1.5 mL 管中。
   3. 将细胞以 500 x g 离心 3 分钟，然后弃去上清液。
   4. 裂解细胞，进行 RNA 分离，然后测量 RNA 浓度。
      注意：对于大多数分离程序，可以在细胞裂解后停止该方案，以便样品可以在-20°C下短期储存。为了更长时间的储存，裂解的细胞可以在-80°C下储存。
   5. 随后，合成cDNA以通过qPCR测量感兴趣的转录本的丰度。cDNA 合成利用 100 ng RNA 和随机六聚体和寡核苷酸 dT 引物。对于qPCR，如前所述^5,30使用基因特异性引物。简而言之，循环条件如下：在95 °C下预孵育5 min，在95 °C下变性40 s，在60 °C下退火15 s，在72 °C下延伸15 s，单点荧光采集10 s。共扩增五种不同浓度的外标（5x10-12-5x10-16 g DNA/反应）。为了对转录本丰度进行归一化，计算了RPLP0和TBP的几何平均值。
   6. 为了消除潜在的交叉污染，通过分析新鲜分离的TC和GCs细胞制剂中 CYP17A1 和 CYP19A1 的细胞特异性标记物的基因表达来评估theca和颗粒细胞制剂的纯度（图2）。
      注意：统计评估应包括至少三个不同细胞培养物的重复。在此实验设置中，在检查正态性和方差后执行 t 检验或单因素方差分析。

Results

尽管使用基于卵泡区室化的成熟机械分离技术分离了 TC 和 GC，但评估了细胞类型特异性基因的表达 CYP17A1 和 CYP19A1 ，以消除交叉污染的风险。 CYP17A1 仅在新鲜分离的 TC 中表达，而 CYP19A1 主要在新鲜分离的 GC 中表达（图 2）。

共培养系统能够将牛鞘细胞和颗粒细胞分隔在膜插入物的相对侧，从而模拟体内空间组织。培养三天后，TC在胶原蛋白包被的插入膜表面扩散时表现出扁平和细长的形态，表明成功附着（图3A）。当单独培养整个 9 天时，TC 继续增殖并在第 9 天达到汇合（图 3B）。相比之下，在胶原蛋白包被的插入膜上单独培养6天的GCs发展出成纤维细胞样表型，这是体外GC的特征（图3C）。此外，如前所述，GC倾向于形成簇，这是培养物^中这些细胞的典型特征5,7,31,32。在共培养系统中，与各自时间匹配的单培养物相比，TC或GC均未观察到明显的形态学差异（图3D），表明基于插入片段的环境保持正常的细胞行为。然而，由于技术限制，共培养物的显微镜评估仍然具有挑战性，特别是在独立于其他细胞区分和评估TC形态方面。为了克服这些限制，目前正在根据探索在没有用于免疫染色的细胞特异性抗体的情况下进行细胞鉴定的替代策略来解决细胞固定的优化方案。

通过分析激素产生以及TCs和GCs关键标记基因的表达来评估共培养系统的功能^33,34，证实了细胞类型特异性类固醇生成作用。GC 单培养和共培养模型之间的比较显示，体外产生的雌二醇 （E2） 水平相似。然而，正如预期的那样，TC单一培养仅产生了可以忽略不计的量的E2，这与2细胞-2-促性腺激素假说（图4A）¹⁵一致，该假说指出鞘细胞缺乏独立合成E2的能力。

为了进一步评估培养条件的生理相关性，检查了关键标记基因³³的表达。根据2细胞-2-促性腺激素假说，CYP19A1主要在GC中表达，而CYP17A1主要在TC中检测到，这种模式在单培养和共培养条件下都观察到（图4B，C）。值得注意的是，尽管没有观察到雌二醇浓度差异，但与 GC 单培养相比，共培养系统内 GC 中 CYP19A1 的转录丰度更高。

图1：细胞培养设置的示意图。 （A）说明定制接种室的图表，该接种室利用倒置插入物上的截管来防止整个初始培养期间的培养基泄漏。（B）实验程序的时间表：将TC在倒置插入物上培养三天以允许附着。翻转插入片段，将GC接种在另一侧，然后再进行六天的培养。该研究将单独培养的 TC 和 GC 与 TC-GC 共培养系统进行了比较。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：新鲜分离的颗粒细胞和膜膜细胞中细胞类型特异性标记物的基因表达。 （A） CYP17A1 仅在 TC 中表达，而 （B） CYP19A1 主要在 GC 中检测，证实了培养前分离细胞群的特异性和初始纯度。数据以归一化为参考基因 RPLP0 和 TBP 的几何平均值的相对表达表示。显示均值和均值标准误差，检验数据的正态性和方差，星号表示显着差异（n=3，t 检验）。 请点击此处查看此图的大图。

图3：培养物中theca和颗粒细胞的形态。 （A）将培养3天的TC附着在胶原蛋白包被的插入膜上。（B）TCs在单一培养的整个9 d后生长到汇合。（C）GC在培养6天后显示出典型的成纤维细胞样表型。（D）与各自时间匹配的单一培养物相比，TCs和GCs的共培养没有显示出明显的形态学差异。该图像是在 GC 培养 6 天和 TC 培养 9 天后（在共培养实验的终点）拍摄的。比例尺 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图4：共培养系统中功能标志物的分析。 （A）雌二醇（E2）的激素浓度证实了细胞培养系统的生理功能。（乙、丙）TC标记 CYP17A1 和GC标记 CYP19A1 的基因表达分析证明了两个细胞群的身份和功能状态。参考基因 RPLP0 和 TBP 的几何平均值计算相对表达量。显示均值和均值标准误差，检验数据的正态性和方差，星号表示显着差异（n=3，单因素方差分析）。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

执行这种共培养模型的先决条件是对两种细胞类型进行良好的分离，以防止任何交叉污染。通过TC特异性标记 CYP17A1 和GC特异性标记CYP19A1的基因表达来评估两种细胞制剂的纯度 。 如前所述，GC和TC分离技术没有显示出相关的交叉污染³⁰。

这种共培养模型允许在膜的相对两侧同时培养膜膜细胞和颗粒细胞，模仿它们在卵泡内的空间组织并支持两个细胞群的生理^状态3。该模型的有效性通过其激素产生谱和基因表达模式得到加强，这些模式与 2 细胞-2-促性腺激素假说¹⁵ 一致。正如预期的那样，TC 单培养物中的低雌二醇水平证实了仅膜细胞无法合成雌二醇，支持卵泡类固醇生成的既定知识³⁵。尽管共培养的 GC 中CYP19A1表达较高，但雌二醇水平仍与 GC 单一培养相当，这表明受到底物可用性、反馈抑制或酶活性差异等调节机制的影响。作为未来研究的主题，有必要进一步探索信号通路和潜在机制。然而，正如本研究所提供的那样，建立牛 TC 和 GC 的功能性共培养系统势在必行。本研究的重点是雌二醇的产生和 CYP17A1 和 CYP19A1 的 mRNA 表达水平，作为共培养模型功能的关键指标。两者都代表颗粒细胞和膜瓣细胞功能的敏感标志物^4,8,36，并且与2细胞-2-促性腺激素假说¹⁵直接一致。虽然认识到蛋白质表达的重要性，但缺乏可靠的抗体使其无法进行准确评估;因此，对蛋白质水平的全面分析超出了这项初步调查的范围。

总的来说，该模型是传统2D培养模型的进一步发展，它部分模仿了卵泡³的结构。结果支持了 GC 和 TC 生理学敏感标志物的表达所揭示的两个细胞区室的生理状态。

与传统的 2D 培养模型相比，一个优势在于促进 theca 和颗粒细胞之间的旁分泌相互作用，同时保持它们的空间分离，更好地模拟体内卵泡结构。相比之下，TC和GC在单个孔中混合的培养皿共培养系统缺乏这种结构组织。使用此类系统的研究通常应用 4：1 19,20,21 的 GC：TC 比率，但这种方法不能反映体内发现的区室化，因此对于分析底物交换可能不可行。此外，当必须以复杂的方式分选这种 GC-TC 混合物时，在细胞水平上发现的改变不容易被检测到。

颗粒细胞和膜鞘细胞的三维共培养模型仍然很少，但早期的尝试已经显示出有希望的结果。Kotsuji 22,23,24,37 小组之前描述了使用胶原膜作为物理分离剂在培养物中颗粒细胞和 theca 细胞的相互作用。然而，该系统依赖于定制的胶原膜，使得可重复性和标准化具有挑战性。相比之下，所提出的共培养模型受益于市售的悬挂式培养插入物，这提高了可重复性、标准化和产品质量，确保了在实验室中更广泛的适用性。尽管本文提出的模型导致雌二醇产量高于以前的模型，但这些模型的比较很困难，因为它缺乏细胞培养补充剂的统一性，特别是使用的浓度²⁶或IGF-1的额外使用22,23,24,37。

该程序中最关键的步骤之一是在接种室内培养 TC。确保腔室牢固地放置在倒置的插件上对于防止介质泄漏至关重要，否则可能会影响 TC 的附着和存活。因此，建议用镊子将接种室用力压在倒置的插入物上，并目视检查接种室的位置。此外，三天后移除接种室并翻转插入物需要技术精度。可能需要进行一些技能培训才能在不破坏和/或损坏附着的细胞的情况下执行此步骤。另一个重要的考虑因素是GC的接种密度。超过每个插入片段1.0 x 10⁵ 个细胞的最佳水平的较高细胞密度可导致GC的分化，从而可能影响类固醇生成输出。此外，所提出的冷冻保存方法在两种细胞类型解冻后均具有 80-90% 的活力。

尽管所描述的模型提供了一个生理和可重复的系统来研究颗粒细胞和膜细胞相互作用，但应考虑一些局限性。该方法也适用于其他物种;然而，物种特异性差异可能需要优化细胞培养参数，例如细胞密度、时间或培养基组成。该模型的可扩展性仅限于细胞培养插入物的可用性，但对于大多数效应器研究来说可能足够了。最后，这种共培养模型是朝着模仿卵泡 体内情况迈 出的又一步，但仍然缺乏卵泡的全部复杂性。

总之，所提出的模型可以轻松修改以适应不同的实验需求，例如延长培养期、调整细胞数量或比例，或纳入其他因素。随着进一步的发展，该系统是研究两个细胞区室之间卵泡功能、类固醇生成和细胞信号传导的宝贵工具。此外，它还具有在生殖毒理学中的应用潜力，提供了一个受控平台来评估不同化合物对滤泡细胞的影响。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hank's 平衡盐溶液 HBSS（w Mg/Ca，酚红）	生物&卖	学士。L201-10	溶于超纯水;将pH调节至消化液（HBSS和HEPES）的7.4，并在使用前进行无菌过滤
18 G 针头，40 毫米，直径 1.2 毫米	罗斯	281T.1	一次性针头，捷径
3 毫升注射器（Omnifix 鲁尔）	罗斯	LY22.1 系列
阿库塔酶	默 克	A6964	公司分公司：Sigma-Aldrich
两性霉素 B （250 & micro克/毫升）	生物&卖	学士。型号 AB17.01050
雄烯二酮	默 克	46033	我们使用 10 mM 的储备溶液，用 100% 乙醇稀释;公司分公司：Supelco
双筒望远镜 Carl Zeiss Technival2	卡尔蔡司耶拿	不適用	与入射灯 Schott KL 1600 LED 一起使用
BSA （5%）	默 克	A3311	公司分公司：Sigma-Aldrich
细胞过滤器（100 µm 孔径）	萨斯泰特	83.3945.100	安装在 50 mL 离心管上
胶原蛋白 R （0.2 %）	服务	47254
胶原酶NB8 （10%）	诺德马克	S1745601
CoolCell LX细胞冷冻容器	默 克	CLS432002	康宁产品
冷冻保存瓶（2 mL）	TPP浮士德	TPP89020
培养皿，12孔，平底	TPP浮士德	TPP92112
培养皿，24孔，平底	TPP浮士德	TPP92424
培养皿，6孔，平底	TPP浮士德	TPP92006
DMSO	罗斯	4720.1
DPBS 不含 Ca2+、Mg2+	生物&卖	学士。L182-10	使用前溶解在超纯水中并高压灭菌器
雌二醇，17b-[2,4,6,7-3H]	哈特曼分析	ART1555
胎牛血清（FBS Superior stabil）	生物&卖	FBS。S0615
FSH（~7,000 IU/mg;来自人垂体）	默 克	F4021	我们更喜欢使用2µ的储备溶液;g/ml，用0.9%NaCl稀释;公司分公司：Sigma-Aldrich
悬挂式细胞培养插入物（0.4 & micro;m 孔径）	cellQART	9320412	在订购时注意插入的不同属性;我们更喜欢透明的 PET 膜用于相差显微镜
HEPES （1 米）	罗斯	9105.2	将pH调节至消化液（HBSS和HEPES）的7.4，并在使用前进行无菌过滤
全息转铁蛋白（牛）	默 克	T1283型	溶于无菌水;公司分公司：Sigma-Aldrich
innuPREP RNA 迷你试剂盒 2.0	IST innuscreen	845-KS-2040250
胰岛素（10 mg/ml;来自牛胰腺）	默 克	I0516	溶解在 1x PBS 中;公司分公司：Sigma-Aldrich
L-谷氨酰胺 （200 mM）	生物&卖	学士。K0283
LR3-IGF-1型	默 克	I1146	我们使用 200 和微量的储备溶液;g/ml，溶解在10mM HCl和1x PBS中，含1mg/ml BSA;公司分公司：Sigma-Aldrich
NanoDrop 1000 分光光度计	热科学	不適用	RNA浓度测量
国家能源局 （100x）	生物&卖	学士。K0293
青霉素/链霉素 （10,000 IU/10 mg/ml）	生物&卖	学士。A2213
纯净水，适用于细胞培养	默 克	W3500型	公司分公司：Sigma-Aldrich
SensiFAST cDNA 合成试剂盒	生物线	生物-65054	通过分销合作伙伴 BioCat 提供
碳酸氢钠 （7.5%）	生物&卖	学士。L1713
亚硒酸钠	默 克	S9133	溶于无菌水;公司分公司：Sigma-Aldrich
热振动筛 TS-100C	费舍尔科学	12357627	与HC18模块（货号12337627）一起使用
α-MEM	生物&卖	学士。F0915